UNIVERSIDAD DE COLIMA DOCTORADO EN CIENCIAS, AREA: BIOTECNOLOGIA

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1 UNIVERSIDAD DE COLIMA DOCTORADO EN CIENCIAS, AREA: BIOTECNOLOGIA HIBRIDACIÓN SOMÁTICA EN CÍTRICOS PARA LA OBTENCIÓN DE PORTAINJERTOS T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS, ÁREA: BIOTECNOLOGÍA PRESENTA: VÍCTOR MANUEL MEDINA URRUTIA ASESORES: DR. JUDE W. GROSSER DR. ALFONSO PESCADOR RUBIO TECOMÁN, COLIMA, MÉXICO., DICIEMBRE DE 2004

2 UNIVERSIDAD DE COLIMA DOCTORADO EN CIENCIAS, AREA: BIOTECNOLOGIA HIBRIDACIÓN SOMÁTICA EN CÍTRICOS PARA LA OBTENCIÓN DE PORTAINJERTOS T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS, ÁREA: BIOTECNOLOGÍA PRESENTA: VÍCTOR MANUEL MEDINA URRUTIA ASESORES: DR. JUDE W. GROSSER DR. ALFONSO PESCADOR RUBIO TECOMÁN, COLIMA, MÉXICO., DICIEMBRE DE 2004

3 AGRADECIMIENTOS Al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias y las autoridades en Oficinas Centrales, Regionales y Estatales, por permitir mi desarrollo como profesionista y otorgarme facilidades para realizar el Programa Doctoral. A la Universidad de Colima por abrirme las puertas a este programa Doctoral y a los Profesores de Postgrado por la orientación, y motivación para realizar este proyecto, así como a mis asesores Roberto lezama, Andres Rebolledo, Jaime Molina y Salvador Guzmán por la revisión y sugerencias de la Tesis. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología y a la Fundación Produce Colima por haberse interesado en este Proyecto. A la Universidad de Florida especialmente al Dr. Jude Grosser, Juan Chandler y Patricia Serrano, quienes pusieron a mi disposición no solo el laboratorio, sino su ayuda profesional y amistad para efectuar este estudio. Sin este apoyo no hubiéramos logrado el éxito en el trabajo. Así mismo, a los colegas Oscar Olivares, G. Ananthakrishnan y W. Guo y Karla López por sus valiosas aportaciones y atinadas sugerencias. Mención especial merecen los compañeros de trabajo Manuel Robles, José Orozco, Armando Rivera, Martha Calvario y Luis Antonio González a quienes realmente debo el producto de este trabajo al brindarme todo su apoyo y cumplir en mi ausencia con tareas y compromisos importantes durante mi estancia en Florida.

4 DEDICATORIA A mí esposa Mayela Villanueva Carrillo. Esta tesis es tuya gracias a tu inquebrantable fe y constante apoyo que se tradujeron en oxígeno puro, necesario para cumplir el objetivo trazado. A mis Hijos Víctor Alejandro, Marcelo Devadip y Pablo Enrique que sacrificaron Escuelas y Amigos por seguirme y apoyarme. A mi Madre Francisca; mis hermanos Antonio, Hilda, Silvia (q.e.p.d) y José con cariño y admiración. A mis amigos, compadres y compañeros de profesión, la mayoría de los cuales siempre estuvieron al pendiente de mis progresos académicos alentándome. A todas aquellas personas que contribuyeron de alguna manera para hacer este proyecto realidad, esperando me disculpen por omitir involuntariamente su nombre. A los productores de limón.

5 CONTENIDO INDICE DE CUADROS... INDICE DE FIGURAS... RESUMEN... ABSTRACT... i ii iii Iv I. INTRODUCCIÓN... 1 II. ANTECEDENTES Importancia de la agroindustria del limón Perspectivas de la agroindustria de limón La tristeza la principal amenaza del limón Clasificación taxonómica de la subfamilia de cítricos Origen y dispersión de los cítricos Necesidades de mejoramiento de los cítricos Caracteres relevantes presentes en especies de la subfamilia Relaciones genéticas entre los cítricos Mejoramiento genético clásico de los cítricos Selección clonal Hibridación sexual Mutagénesis inducida Hibridaciones interploides Limitaciones de Mejoramiento Genético clásico en los cítricos Heterocigosis y depresión por endogamia Esterilidad e incompatibilidad sexual Apomixis y poliembrionia nuclear Juvenilidad Mejoramiento genético de los cítricos por medio de Biotecnología Manipulación de ploidía Transformación genética Variación somaclonal Hibridación somática Germoplasma de Cítricos Embriogénesis somática Aislamiento de protoplastos y regeneración de plantas Métodos de fusión de protoplastos Selección de los híbridos somáticos Caracterización de los híbrido somáticos Ventajas de la Hibridación Somatica Situación actual del mejoramiento genético de cítricos por Hibridación somática Mejoramiento de portainjertos de cítricos mediante hibridación somática Enfermedades inducidas por Phytophthora El virus de la tristeza de los cítricos El Blight de los cítricos Resistencia a nemátodos Frío Salinidad Sequía Inundación Factores agronómicos Continúa CONTENIDO...

6 ...continuación CONTENIDO Mejoramiento de variedades de Cítricos por hibridación somática Tolerancia al frío Resistencia a enfermedades Tolerancia a plagas Producción estacional de fruta Variedades atractivas para el consumidor Portainjertos y variedades de cítricos genereados por Hibridación Somáticos Portainjertos de cítricos híbridos somáticos (H.S) H. S. Intergenéricos sexualmente compatibles H. S. Intergenéricos sexualmente incompatibles H. S. Interespec. entre mandarino y otros Citrus H. S. entre especies de limón y otros cítricos Híbridos somáticos para obtención de variedades Cihibridación de cítricos Fusión de protoplastos en diversos cultivos Conclusión III. MATERIALES Y METODOS Localización Establecimiento de experimentos Cultivo de Callo embriogénico Fuentes de callo embriogénico Cultivo de óvulos de frutos inmaduros Cultivo de óvulos de frutos maduros Cultivos embriogénicos en suspensión Aislamiento y purificación de protoplastos Intervalo de tiempo óptimo de incubación en protoplastos Determinación de la concentración óptima de BH Conc. óptima de sacarosa durante el aislamiento de protoplastos Efecto del medio de cultivo sobre el rendimiento de protoplastos durante la incubación Efecto de la duración y velocidad de la centrifugación Experimentos de fusión de protoplastos Experimento 1. Obtención de híbridos somáticos intergenéricos entre mandarino Amblicarpa (Citrus amblycarpa Ochse) y diferentes variedades del género Poncirus trifoliata Experimento 2. Obtención de híbridos somáticos interespecíficos entre mandarino Amblicarpa y líneas monoembriónicas de plántulas de Pomelo (Citrus máxima Burn) Experimento 3. Obtención de híbridos somáticos intergenéricos entre Macrofila (Citrus macrophylla Wester) y géneros parientes de los cítricos Experimento 4. Obtención de híbridos somáticos interespecíficos entre Amblicarpa y especies derivadas del Cidro Descripción de la metodología de fusión de protoplastos Aislamiento de protoplastos Protoplastos de callo embriogénico en suspensión Protoplastos de Hoja Continúa CONTENIDO...

7 ...continuación CONTENIDO Experimento 1. Trifoliados e Híbridos Experimento 2. Pomelos Experimento 3. Intergenéricos Experimento 4. Cidro Purificación de protoplastos Fusión de protoplastos Cultivo y regeneración de protoplastos Selección y verificación de Híbridos Somático Selección de híbridos somáticos Verificación de híbridos Evaluación de la morfología de la hoja Determinación del nivel de ploidía Marcadores genéticos Extracción del ADN Pruebas de PCR Prueba de la herencia de orgánelos Electróforesis IV. RESULTADOS Experimentos de aislamiento y purificación de protoplastos Experimento 1: Intervalo de tiempo óptimo de incubación Experimento 2: Determinación de la óptima concentración del medio de cultivo líquido Experimento 3. Efecto del medio de cultivo sobre el rendimiento de protoplastos durante la incubación Experimento 4. Concentración de sacarosa Efecto del tiempo y velocidad de la centrifugación durante el proceso de purificación de protoplastos Experimentos sobre fusión de protoplastos para obtención de híbridos somáticos Experimento 1. Híbridos intergenéricos entre Amblicarpa y variedades de Poncirus trifoliata Recuperación y regeneración de híbridos Morfología foliar Nivel de ploidia Análisis de PCR Herencia de organelos Experimento 2. Híbridos somáticos interespecíficos entre mandarino, Amblicarpa y líneas de Pomelo Recuperación y regeneración de híbridos Morfología foliar Nivel de ploidía Pruebas de PCR Experimento 3. Híbridos somáticos entre limón Macrofila y parientes cercanos de los cítricos Recuperación y regeneración de híbridos Morfología foliar Nivel de Ploidía Prueba de PCR Herencia mitocondrial y de cloroplastos Continúa CONTENIDO...

8 ...continuación CONTENIDO Experimento 4. Híbridos somáticos interespecíficos entre Amblicarpa y especies derivadas del cidro Recuperación y regeneración de híbridos Morfología foliar Nivel de Ploidia Pruebas de PCR V. DISCUSIÓN VI. CONCLUSIONES VIII. BIBLIOGRAFÍA

9 INDICE DE CUADROS Cuadro Descripción Página 1 Taxonomía de la subfamilia Aurantioideae según Swingle y Reece (1967). 8 2 Tribus, Subtribus y géneros de la subfamilia Aurantioideae Swingle Reece (1967).Incompatibilidad sexual y por injerto y características genéticas de 15 interés. Híbridos somáticos intergenéricos sexualmente compatibles. Especies del 3 género Citrus como donadores de callo. 55 Híbridos somáticos intergenéricos sexualmente incompatibles. Especies del 4 género Citrus como donadores de callo Embriogénico. 57 Híbridos somáticos interespecíficos entre mandarinos y otras especies de 5 Citrus. 59 Híbridos y Cíhibridos somáticos interespecíficos de frutos ácidos con especies 6 de Citrus. 61 Trabajos reportados sobre fusión de protoplastos en otras especies que no son 7 cítricos Soluciones base para preparar medios de cultivo EME M 74 Ingredientes a partir de soluciones base del Cuadro 11 para preparar un medio 9 de cultivo EME M utilizado para el crecimiento de células embriogénicas Soluciones base para la preparación de medios de cultivo BH3 0.6 M empleada para fusión de protoplastos. Macronutrientes, sales, azúcaresalcohol 77 y ácidos orgánicos. Ingredientes para preparar un medio de cultivo BH3 0.6 M para fusión de 11 protoplastos a partir de soluciones base Composición de la solución enzimática empleada en fusión de protoplastos. 80 Rendimiento de protoplastos de callo embriogénico de Macrofila y 13 Volkameriana en diferentes medios de cultivo durante la incubación. 100 Tiempo de centrifugación de protoplastos de callo embriogénico de Macrofila 14 durante la purificación. 101 Velocidad de centrífugación durante el proceso de purificación de los 15 protoplastos de callo embriogénico de Macrofila Medio de cultivo DBA3 utilizado para el enraizado de embriones in vitro 103

10 INDICE DE FIGURAS Figura Descripción Página Rendimiento de protoplastos de callo embriogénico de tres portainjertos sometidos a diferentes períodos de incubación (Protoplastos 10 6 /ml) 98 Rendimiento de protoplastos de callo embriogénico de dos portainjertos: A) a diferentes concentraciones de BH 3 B) a diferentes concentraciones de sacarosa 99 durante el aislamiento (Protoplastos 10 6 /ml Forma de las hojas de los Híbridos somáticos tetraploides (al centro) obtenidos de las combinaciones de mandarino Amblicarpa (Citrus amblycarpa) y dos Citranges en comparación con las hojas de los materiales parentales donadores 105 de callo embriogénico (izquierda) y de protoplastos de hoja (derecha) (A). Morfología de las hojas del híbrido somático Amblicarpa + Flying Dragon y sus respectivos progenitores: Amblicarpa y Flying Dragon. (B). Morfología foliar de seis híbridos somáticos. En la hilera de arriba de izquierda a derecha: Rubidoux, Carrizo, benton Sofd, Sofd (4x), C-35, Flying Dragón; Abajo: Amb Rubidoux, Amb. + carrizo, Amb. + Benton (4x), Amb. + Benton (6x), Amb. + Sofd (4x) (la hoja más pequeña en el centro), Amb. + C-35, Amb. + Flying Dragon y mandarino Amblicarpa (unifoliado). Nivel de ploidía de los híbridos somáticos intergenéricos Amblicarpa + C-35 y Amblicarpa + Benton. Determinación con citometría de flujo. Partec, Münster, 107 Alemania. Nivel de ploidía de los híbridos somáticos intergenéricos Amblicarpa + Flying Dragon (FD) y Amblicarpa + Sofd. Determinación con citometría de flujo. Partec, 108 Münster, Alemania. Nivel de ploidía registrado por los diferentes híbridos somáticos Amblicarpa + Rubidoux (Rub) y Amblicarpa + Carrizo. Determinación por citometría de flujo. 109 Partec, Münster, Alemania. Los patrones de bandeo en las líneas 2, 3 y 4 (iniciador C-11) y 10, 11 y 12 (iniciador C 64) corresponden a C-35, Amblicarpa + C-35 y Amblicarpa respectivamente. Mientras que en la línea 5, 6 y 7 (iniciador C-11) y 12, 14 y (iniciador C-64) se ubican Amblicarpa + Benton, Benton y Amblicarpa. El marcador de referencia fue de 100 pares de bases. Polimorfismo mostrado por los materiales Flying Dragon, Amblicarpa + Flying, Dragón y Amblicarpa ubicados en las líneas 2, 3, 4 (C-11) y también en 12, 13 y 14 (C-64) respectivamente; así como Amblicarpa + Sofd y Sofd en las líneas 5 y (iniciador C-11) y 15 y 16 (iniciador C-64) respectivamente. El marcador de referencia es de 100 pares de bases (carriles 1 y 11). Patrones de bandeo RAPD de dos híbridos intergenéricos y sus genotipos parentales. Productos amplificados por los indicadores C-11 (Gel lado izquierdo) y C 64 (Gel lado derecho). Marcador 1 Kb (línea 1 y 8); Rubidoux 112 (líneas 2 y 9 ); Amblicarpa + Rubidoux (líneas 3 y 10); Amblicarpa (líneas 4, 7, 11 y 14); Amblicarpa + Carrizo (líneas 5 y 12); Carrizo (líneas 6 y 13). Polimorfismo del ADN mitocondrial (ADN mt ). En los híbridos somáticos Amblicarpa + C-35 (carril 3) y Amblicarpa + Rubidoux (carril 7). Los progenitores 113 se localizan en los carriles 2, 4, 6 y 8. El marcador se ubica en el carril 5. Detección de ADN mitocondrial (ADN mt ) en los híbridos somáticos de Amblicarpa más Citranges y sus respectivos progenitores 114 Polimorfismo del ADN mitocondrial (ADN mt ) mostrado por un híbrido somático tetraploide (abajo) hexaploide (arriba) 114 Perfil de bandeo del ADN de cloroplastos mostrado por el mandarino Amblicarpa y variedades del género P. trifoliata así como sus híbridos somáticos: Flying Dragón (carril 2), Amb. + Flying dragon (3); Amb. (4), Benton (5); Amb. + Benton (6); Amb. (7); Sofd (8); Amb. + Sofd (9); Amb. (10); C-35 (11), Amblicarpa + C (12); Amblicarpa (13). Los pares de iniciadores utilizados fueron: TrnD-TrnT, cortar con Taq I, y gel en metaphoragarosa Continúa INDICE DE FIGURAS...

11 ...continuación INDICE DE FIGURAS Figura Descripción Página Morfología de las hojas de las combinaciones mandarino Amblicarpa (Citrus amblycarpa) más dos líneas de Pomelo. Las hojas del centro corresponden a los híbridos somáticos. La del lado izquierdo al mandarino y la derecha al Pomelo. Proceso de fusión y regeneración de híbridos somáticos. (A) Callo embriogénico en suspensión. Liberación enzimática de protoplastos de callo embriogénico (B) y tejido foliar (C). Anillo de protoplastos purificado del progenitor de callo (D) y de hoja (E). Inicio de fusión de protoplastos (F). Embriones somáticos en crecimiento (G). Plantas híbridas somáticas de Amblicarpa + Pomelo en medio de cultivo (H). Grupo de trabajo de laboratorio al centro el Prof. Jude Grosser (I). Nivel de ploidia de híbridos somáticos interespecíficos entre Amblicarpa y dos línea de Pomelo Lian Pin Yau. Nivel de ploidía de híbridos somáticos interespecíficos entre Amblicarpa y dos variedades de Pomelo Hirado Buntan Pink y Large Pink. Perfil de bandeo mostrado por los híbridos somáticos (indicado con una flecha) de Amblicarpa (Citrus amblycarpa) + Pomelos (Citrus máxima ó C. grandis) y sus respectivos progenitores. Se utilizaron los iniciadores BDB-CC5. Polimorfismo mostrado por híbridos somáticos de Amblicarpa + Pomelo y sus respectivos materiales parentales utilizando los iniciadores C-11 y C-64. Morfología de tetraploide (centro) entre Macrofila (C. macrophylla) (izquierda) y Citropsis gilletiana (derecha) y materiales parentales. Ploidía mostrada por el testigo Macrofila (pico 1) y el candidato a híbrido somático (pico 2) resultante de la combinación de Macrofila + Citrange C-35 (arriba) y la ploidía del testigo Macrofila (pico 1), limón Persa (pico 2) y Macrofila + Sofd (Pico 3) correspondiente a materiales diploides, triploides y tetraploides. Ploidía de las combinaciones interespecíficas Macrofila + Pomelo (arriba) e intergenérica Macrofila + Citropsis gilletiana (abajo). Nótese los picos de ploidía del testigo (pico 1) y de los híbridos (pico 2) En ambos casos el pico 2 corresponde a materiales tetraploides. Patrones de bandeo de Macrofila + Citropsis, Macrofila + Citrange C-35 y Macrofila + Pomelo Ling Pin Yau línea ª y sus respectivos progenitores. El gel del lado izquierdo corresponden a fragmentos amplificados con el iniciador C-11. En los geles del centro y lado derecho se utilizó el iniciado C-64 Perfil de distribución de ADN de mitocondrias en diferentes híbridos somáticos y sus materiales parentales. C-35 carril (1); Macrofila + C-35 Carril (2); Macrofila (3); Sofd (4); Macrofila + Sofd (5); Macrofila (6); Marcador de 100 pares de bases (7); C-35 (8); Macrofila + C-35 (9); Macrofila (10); Sofd (11); Macrofila + Sofd (12); Macrofila (13). Los perfiles en los carriles 1-6 se obtuvieron utilizando el par de iniciadores siguiente: Nad4Exon ½ y los carriles del 8-13 con 185/5ArRNA cortados con Taq I y visualizados con un gel de metaphoragarosa al 3%. Perfil de distribución de ADN de cloroplastos en diferentes híbridos somáticos y sus materiales parentales. 1 = C-35; 2 = Macrofila + C-35; 3 = Macrofila; 4 = Sofd; 5 = Macrofila + Sofd; 6 = Macrofila; 7 = marcador 100 pares de bases. Morfología de hojas de la combinación Amblicarpa + Volkameriana (centro) y de sus respectivos progenitores: Amblicarpa (izquierda) y Macrofila (derecha) Ploidía del testigo Amblicarpa (pico 1) y de los híbridos somáticos (pico 2) correspondientes A a las combinaciones B Amblicarpa + Volkameriana C (arriba) y Amblicarpa + Macrofila (abajo). Nótese que la diferencia en la ubicación entre ambos picos es del doble, lo que indica que estos corresponden a materiales diploides y tetraploides, respectivamente Patrones de bandeo de dos híbridos somáticos y sus respectivos progenitores iniciador HVHTCC5, lado izquierdo y con el iniciador BDBTCC5 lado derecho. Volkameriana (carriles 1 y 7), Amblicarpa + Volkameriana (carriles 2 y 8), Amblicarpa (3 y 9), Amblicarpa + Macrofila (4 y 10) y Macrofila (5 y 11). Marcador 100 pb (6 y 12)

12 RESUMEN La base genética de portainjertos de limón Mexicano [Citrus aurantifolia (Christm) Swingle] es estrecha, lo que propicia que las plantaciones sean altamente vulnerables a diversos problemas fitosanitarios. La hibridación somática vía fusión de protoplastos es una alternativa de mejoramiento genético que se ha utilizado en otros cítricos para desarrollar genotipos tetraploides con características de interés. El presente trabajo se realizó con el fin: a) de adecuar un protocolo de fusión de protoplastos para los portainjertos Macrofila y Amblicarpa, como prerrequisito para la hibridación somática; b) desarrollar nuevos híbridos somáticos a partir de protoplastos de callo embriogénico de Macrofila y Amblicarpa, combinados con protoplastos de hoja de los genotipos de Poncirus trifoliata, Pomelo, Macrofila y Volkameriana. Los resultados indican que ambos portainjertos requieren un protocolo diferente para lograr un elevado rendimiento de protoplastos, el portainjerto Amblicarpa requirió menor período de incubación que Macrofila. A su vez, este portainjerto incrementó la producción de protoplastos al emplearse concentraciones más altas de medio de cultivo BH3 que el Amblicarpa. El medio de cultivo BH3, resultó más idóneo que el EME y/o que la mezcla de los dos, para ambos portainjertos. El tiempo y velocidad de centrifugación así como la concentración de sacarosa durante la purificación, no influyeron en el rendimiento de protoplastos. El alejamiento genético entre los géneros Citrus y Poncirus, no fue obstáculo para desarrollar cinco nuevos híbridos somáticos intergenéricos tetraploides y un hexaploide entre mandarino Amblicarpa y variedades de Poncirus trifoliata. Así mismo, se obtuvieron dos nuevos híbridos somáticos entre Amblicarpa (callo embriogénico) y dos genotipos de Pomelo (hoja). Una de cinco plantas de Macrofila + Citropsis también se identificó como híbrido somático; Así como también Amblicarpa + Volkameriana. Otras tres combinaciones de Amblicarpa y distintas líneas de Pomelo, así como Macrofila + Pomelo y Macrofila más C-35 resultaron ser tetraploides mediante pruebas morfológicas y citológicas, pero no mediante pruebas moleculares. Estos resultados permiten ampliar al abánico de patrones disponibles para limón con características de interés para hacer frente a problemas de VTC, Virus, Viroides, nemátodos, tamaño de árbol y adaptación a suelos calcáreos previas evaluaciones biológicas y agronómicas.

13 ABSTRACT The genetic basis of the rootstocks for Mexican lime is very limited and this causes that the commercial plantations of mexican lime are highly susceptible to different plant sanitation and soil problems. The somatic hybridization via fusion of protoplasts is an alternative of citrus breeding to develop new desirable genotypes. This study was carried out to: a) develop a local protocol for fusion of protoplast to Macrophylla and Amblycarpa rootstocks, as a prerequisite to somatic hybridization; b) develop new somatic hybrids based on Macrophylla and Amblycarpa rootstocks as embryogenic callus and Poncirus trifoliate, Pummelo genotypes, Macrophylla and Volkamer lemon as a leaf source of protoplast. Results indicated that both Macrophylla and Amblicarpa rootstocks required a different protocol. Amblycarpa required a shorther period of time (8 hr) for isolation in order to get the highest yield of protoplast than Macrophylla (32 hr). During isolation, Macrophylla achieved the highest yield of protoplasts with 0.8 and 0.9 M, BH3 concentrations and Amblycarpa with 0.6 M BH3. The genetic distance between Citrus and Poncirus genera did not affect the fusion and regeneration of new somatic hybrids. Six new intergeneric somatic hybrids (five tetraploids and one hexaploid) between Amblycarpa (embryogenic callus) and selections of Poncirus trifoliate (leaf protoplasts) were obtained. Also two somatic hybrids were obtained from the combination between Amblycarpa and Pummelo genotypes (leaf protoplasts). Some candidate somatic hybrids between Amblycarpa and Pummelo resulted in autotetraploids. Macrophylla + Citropsis and Amblicarpa + Volkamer lemon were also regenerated as tetraploid somatic hybrids. These new citrus rootstocks can be of high potential to face CTV, virus, viroids, nematode, tree size and calcareous soil problems in the future for Mexican lime trees.

14 I. INTRODUCCIÓN El uso de portainjertos de cítricos está ampliamente difundido en las principales regiones productoras de cítricos del país. Sin embargo, el número de especies utilizadas como portainjerto en las diferentes variedades es reducido. En el caso de la naranja (Citrus sinensis), toronja (Citrus paradisi), mandarina (Citrus reticulata) y limón Persa (Citrus latifolia) el portainjerto más utilizado es naranjo agrio (Citrus aurantium L) el cual se encuentra en el 90% de las plantaciones; mientras que Macrofila (Citrus macrophylla) es el más utilizado en las plantaciones de limón mexicano con un 81% (Rocha-Peña y Lee, 2000; Coelim, 2002). El hecho de depender de un solo portainjerto en las plantaciones, incrementa el riesgo de daño por enfermedades desvastadoras como el virus de la tristeza de los cítricos (VTC), gomosis, nemátodos, blight, declinamiento repentino entre otras (Newcomb, 1978; Del Valle-Valdez, 1997). Aparte de que un portainjerto no siempre se adapta aceptablemente a las distintas condiciones de clima y suelo que prevalecen en las diferentes regiones productoras. Además, hay que tomar en cuenta que los portainjertos controlan características hortícolas importantes tales como: el tamaño del árbol, tolerancia a frío, tamaño de fruta, rendimiento y calidad de fruta, entre otras, las cuales son determinantes para hacer de la citricultura un negocio rentable (Castle, 1987). Por lo tanto, se requiere ampliar la base genética de portainjertos con el objeto contar con un mayor número de nuevos genotipos que contengan a su vez características que les permitan hacer frente al mayor número de problemas posible. Para ampliar la base genética es necesario implementar un programa de mejoramiento genético de portainjertos. El mejoramiento por métodos convencionales como la hibridación sexual, presenta barreras tales como la esterilidad e incompatibilidad sexual, alta heterocigosis, elevada apomixis y poliembrionía y largo período juvenil, las cuales impiden ó dificultan la obtención de portainjertos con características deseables (Grosser y Gmitter, 1990 a). Para el mejoramiento genético por selección de mutantes 1

15 naturales se requiere estudiar minuciosamente grandes poblaciones de árboles en edad productiva, lo cual en portainjertos es un tanto inusual (Castle et al., 1993); la mutagenesis inducida con agentes mutágenos tales como rayos gamma o rayos X, ha sido poco estudiada en el caso de portainjertos debido a que los cambios provocados son muy aleatorios. El mejoramiento por medio de transformación genética tiene implicaciones metodológicas complicadas y por este medio es posible introducir una sola característica específica a la vez, por ejemplo en naranjo agrio se busca incorporar tolerancia a tristeza (Gutiérrez, et al., 1997). Por lo tanto, la hibridación somática vía fusión de protoplastos, constituye la alternativa de mejoramiento genético con mayor viabilidad, no solo porque permite superar las barreras de mejoramiento por hibridación sexual antes mencionadas, sino que además, con esta metodología es posible incorporar el genoma completo de dos materiales diploides, y producir otro individuo tetraploide que lleva en paquete mayor número de características deseables y por lo tanto una mayor base genética (Grosser y Gmitter, 1990 a; Ollitrault et al., 1996 b). Desde que apareció el primer reporte sobre fusión de protoplastos en cítricos (Ohgawara et al., 1985) con esta técnica biotecnológica se han venido obteniendo nuevos patrones y variedades con mejores características en diversos laboratorios del mundo (Grosser et al., 2000; Ollitrault et al., 1998; Kobayashi et al., 1988). Sin embargo, para tener éxito con la hibridación somática mediante la fusión de protoplastos, como prerrequisito se requiere contar con protocolos eficientes de embriogénesis somática y de fusión de protoplastos (Torres, 1989; Bengochea y Dodds, 1986). En la literatura no existen reportes de estudios al respecto para los portainjertos Macrofila y Amblicarpa, los cuales se han seleccionado para realizar el presente trabajo en base a su excelente comportamiento como portainjertos de limón Mexicano (Medina- Urrutia, 1996) y limón Persa (del Valle-Valdez, 1997). De ahí que resulte necesario realizar estudios para determinar las condiciones de aislamiento, incubación, medios de cultivo y condiciones de purificación para optimizar el rendimiento de protoplastos a partir de callo embriogénico de los portainjertos Macrofila y Amblicarpa y con ello aumentar la posibilidad de obtener mayor número de híbridos somáticos en base a estos dos portainjertos. 2

16 Para preservar la agroindustria del limón mexicano, es necesario contar con combinaciones variedad-portainjerto que reúnan las siguientes características: tolerancia a tristeza y otros virus y viroides; así como gomósis y nemátodos, tolerancia a suelos calcáreos y a sequía y que además sean de crecimiento achaparrante. Independientemente de que los portainjertos puedan contener tolerancia a tristeza, esta característica debe ser incorporada directamente a la variedad, debido a que esta especie es la más sensible a esta enfermedad. Por ello los estudios para generar variedades de limón tolerantes a tristeza mediante transformación genética están en marcha (Robles González, et al., 2004). En el caso de los portainjertos, con este trabajo se pretende iniciar un programa de mejoramiento genético por fusión de protoplastos para ampliar la base genética de portainjertos, con el fin de que se tengan materiales que en un solo individuo reúnan el mayor número de características deseables que permitan hacer frente a los desafíos actuales y futuros. Y en este caso se han seleccionado a los portainjertos Macrofila y Amblicarpa para utilizarlos como modelo. EL PROBLEMA Se desconoce la capacidad que tienen Macrofila y Amblicarpa como progenitores de callo embriogénico para producir protoplastos y que factores durante el aislamiento e incubación son los que mayor influencia ejercen sobre la producción de protoplastos. Así mismo, tampoco se conoce la capacidad de respuesta de cada portainjerto para regenerar híbridos somáticos en fusiones con otros cítricos que tienen diferente grado de compatibilidad o parentesco. LA PREGUNTA CIENTÍFICA Que factores durante el aislamiento e incubación de protoplastos son los que ejercen mayor influencia sobre la producción de protoplastos de los progenitores Macrofila y Amblicarpa; y si la eficiencia en la producción de híbridos somáticos será igual entre Macrofila y Amblicarpa con otras especies y géneros de cítricos?. 3

17 LA HIPÓTESIS Las condiciones de aislamiento y purificación empleados en otros cítricos no ejercen influencia sobre la producción de protoplastos y por tanto afectan de igual manera a los dos materiales Macrofila y Amblicarpa. La eficiencia en la producción de híbridos somáticos de Macrofila y Amblicarpa utilizados como donadores de protoplastos de callo embriogénico es la misma y no depende de su grado de parentesco ó compatibilidad sexual con las otras especies y géneros de cítricos utilizadas como donadores de protoplastos de hoja. OBJETIVOS Determinar el efecto del tiempo de aislamiento, y medio de cultivo, sobre el rendimiento de protoplastos en callo embriogénico de los portainjertos Macrofila y Amblicarpa. Conocer el potencial de producción de híbridos somáticos intergenéricos e interespecíficos del patrón Amblicarpa con variedades de Pomelo (Citrus máxima) y Poncirus trifoliata; y de Macrofila con Citrus máxima, Poncirus trifoliata y Citropsis gilletiana. 4

18 II. ANTECEDENTES 2.1 Importancia de la agroindustria del limón Hasta el año 2001, en México se cultivaron poco más de 95,000 ha de limón mexicano las cuales produjeron alrededor de 1 200,000 ton de fruta; de esta cantidad aproximadamente el 34% de la fruta se procesó en 100 empaques para su comercialización en fresco en diferentes mercados del país, y el resto se destinó a la industria para la extracción de aceite esencial el cual tiene mercado de exportación (Coelim, 2002; González-Sanchez y Silva-Echevarria, 2003; Medina-Urrutia, 2004). En torno a esta cadena agroalimentaria conformada por 9,500 productores, numeroas empresas y prestadores de servicios, cerca de 100 empaques, 28 industrias y gran cantidad de comerciantes, laboran más de 35,000 familias en el País. Las cifras anteriores ubican a México como el principal productor de este cítrico y el más importante exportador de aceite esencial (González-Sánchez y Silva-Echevarria, 2003; Coelim, 2002). 2.2 Perspectivas de la agroindustria de limón Otros países importantes productores de limón son la India (30,000 ha) y Perú (18,000 ha); de ellos, el más serio competidor es Perú que también exporta a E. U importantes cantidades de aceite destilado, y que cuenta con condiciones de clima y suelo apropiadas para su expansión, además de que en ese país la producción por hectárea es similar a la que se obtiene en México, pero a un menor costo de producción, por lo que la rentabilidad en Perú tiende a ser más alta (Ginocchio, 2003). Se anticipa que en los próximos años México continúe creciendo con plantaciones nuevas en estados como Michoacán, Guerrero, Sinaloa y Colima, a un ritmo mayor que en Perú. Por lo tanto, se estima que México podría continuar posicionado como el más importante productor de aceite esencial en el mundo (Medina-Urrutia, 2004). 2.3 La tristeza la principal amenaza del limón A pesar de la importancia del limón en el mundo, esta agroindustria se encuentra amenazada por la tristeza de los cítricos, la enfermedad más destructiva que ha causado la muerte de millones de árboles de cítricos en las regiones donde se ha 5

19 presentado de manera endémica (Orozco-Santos, 1994; Rocha-Peña y Lee, 2000; Rocha-Peña et al., 1995). La tristeza se encuentra presente de manera asintomática en la mayoría de regiones productoras de cítricos y hasta la fecha se han identificado 6 aislados de los cuales dos parecen ser severos mientras que cuatro resultaron ser suaves (Isidron-Herrera, et al., 2001). Hasta ahora esta enfermedad ha sido dispersada por el hombre al movilizar plantas de cítricos de áreas infectadas a regiones libres. Sin embargo, el pulgón café de los cítricos principal vector de las razas de tristeza, se encuentra presente en Veracruz y se anticipa que en poco tiempo infectará los árboles de limón en la Costa del Pacífico. El limón Mexicano es la especie de cítricos más sensible a tristeza y por tanto la que tiene mayor riesgo de ser afectada, aún cuando se injerte sobre patrones tolerantes, lo que ocasionaría grandes pérdidas en el campo y consecuentemente un colapso de la agroindustria del limón, afectando el patrimonio de miles de familias. Además de la variedad de limón mexicano, también el portainjerto Macrofila que es utilizado en más del 80% de las plantaciones, también es sensible a esta enfermedad (Coelim, 2002). Por lo tanto, la manera de hacer frente a esta enfermedad tan destructiva y eliminarla de forma definitiva es desarrollando una combinación patrón-injerto que sea resistente. Esto es posible lograralo mediante mejoramiento genético utilizando como herramienta la biotecnología, por un lado introduciendo genes de resistencia a la variedad de limón vía transformación genética Peña et al., 1995 a, 1995 b; Robles González et al., 2004 y obteniendo un portainjerto con características de resistencia al VTC y a otros problemas fitosanitarios, hortícolas y de suelos vía fusión de protoplatos (Grosser et al., 2000; Ollitrault et al.,1996 b). 2.4 Clasificación taxonómica de la subfamilia de cítricos Aurantioideae. Los cítricos y géneros relacionados pertenecen a la familia Rutaceae subfamilia Aurantioideae. En el Cuadro 1, se muestran las tribus, subtribus y géneros, perteneceientes a la subfamilia Aurantioideae, según la clasificación de Swingle y Reece (1967). La subfamilia está dividida en dos tribus Clausenaeae (árboles con frutos citroides remotos muy remotos) y Citreae (árboles con frutos citroides y cítricos), cada una de ellas con 3 subtribus. El género Citrus, que según esta clasificación cuenta con 16 especies, pertenece a la subtribu 2 de la tribu Citreae. La taxonomía del género Citrus ha despertado 6

20 controversias por la disparidad de criterios aplicados por los distintos autores para otorgar el rango de especie. Los dos principales sistemas taxonómicos son el de Swingle y Reece (1967), que reconoce 16 especies dentro del género, y el de Tanaka (1961), que incluye 157 especies. La primera aproximación es posiblemente más cercana a la realidad, pero la segunda resulta más práctica desde un punto de vista agronómico. Otros sistemas de clasificación consideran únicamente a las especies reconocidas. La clasificación consignada por Ortiz (1985), basada en las modificaciones propuestas por Carpenter y Reece (1969), propone agrupar a los cítricos cultivados en ochos grupos bien definidos, atendiendo a sus características agronómicas: 1) cidros (Citrus medica L.); 2) limoneros (C. limon (L) Burm F.); 3) limas, entre los que destacan el limón mexicano (C. aurantifolia (Christm) Swingle) y la lima Rangpur (C. limonia Osb); 4) mandarinos, al cual pertenecen las satsumas (C. unshiu (Mak.) Marc.) y los clementinos (C. clementina Hort. Ex Tan.), el mandarino común (C. reticulata Ten.) y el mandarino Cleopatra (C. reshni Hort. Ex Tan.); 5) naranjos agrios (C. aurantium L.); 6) naranjos dulces (C. sinensis (L.) Osb.); 7) toronjos (C. paradisi Macf.) y 8) pomelos (C. grandis (L.) Osb; ó Citrus máxima). Estudios, basados en caracteres morfológicos (Barret y Rhodes, 1976), en metabolitos secundarios (Scora y Kumamoto, 1983; Scora y Mallik, 1970), patrones de restricción de ADN mitocondrial (Green et al.,1986; Vardi, 1988), isoenzimas (Torres et al., 1978; 1996b; Ollitrault, 1990), RFLPs (polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción) (Roose, 1988), RAPDs (polimorfismos de ADN amplificado aleatoriamente) (Luro et al., 1992) y cantidad de ADN nuclear (Ollitrault y Michaux, 1992), indican que el género Citrus tiene tres especies básicas: el pomelo, el cidro y el mandarino (C. reticulata (L.) Blanco), a partir de las cuales y por medio de hibridaciones se han obtenido todas las especies de cítricos. Recientemente éste concepto ha ganado soporte adicional de varios estudios basados en términos bioquímicos y molecualres entre las que se incluyan las isoenzimas (Herrero et al., 1996 a); y los microsatélites (Fang y Roose, 1997; Fang, et al., 1998). 7

21 Cuadro 1. Taxonomía de la subfamilia Aurantioideae (1967). según Swingle y Reece Tribu Subtribu Género 1. Micromelinae (frutos 1. Micromelium citroides muy remotos) Clauseneae 2. Clauseninae (frutos Glycosmis (x) (frutos citroides Clausena (x,y) citroides remotos) remotos y muy Murraya 3. Merrillinae (frutos citroides remotos) Merrillia remotos de gran tamaño) Wenzelia Grupo Wenzelia Monanthocitrus 2. Citreae (frutos citroides y cítricos) 1. Triphasiinae (frutos citroides menores) 2. Citrinae (frutos cítricos) 3. Balsamocitrinae (frutos citroides de piel dura) Tomado de: Louzada y Grosser, 1994 (x) Limitada compatibilidad por injerto con Citrus (y) Algo de éxito en Hibridación somática con Citrus (z) Compatibilidad por injerto con Citrus (z) Algo de éxito en hibridación sexual con Citrus Grupo Triphasia Grupo Luvunga A: Frutos cítricos primitivos B: Frutos cercanos a los cítricos C: Frutos cítricos verdaderos Swinglea (z) Aegle (x, z) Afraegle (x) Aeglopsis (x) Balsamocitrus (x, y) Feronia Feroniella (z) Oxanthera Merope (x) Tripashia (x) Pamburus (x) Luvunga Paramingnya Severinia (y, w, z) Pleiospermium (x) Burkillanthus Limnocitrus (x) Hesperothusa (z) (y, z) Citropsis (x, y) Atalantia (y, z, w) Fortunella Eremocitrus (z) (y, z, w) Poncirus Clymenia (z) (z, w) Microcitrus (y, z, w) Citrus 8 (x)

22 Las especies C. halimii B., C. Stone (Stone et al., 1974) y C. tachibana (Mack) Tan., se consideran también como especies básicas debido a caracteres morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y moleculares (Cameron y Soost, 1982; Herrero et al., 1996 a, b; Luro et al., 1992; Scora y Kumamoto, 1983). El número total de especies del resto de los géneros de la subfamilia Aurantioideae asciende a 187. Casi todas ellas son árboles o arbustos de hoja perenne, excepto los tres géneros monoespecíficos Poncirus, Aegle y Feronia, tres especies del género Clausena y una del género Murraya, y poseen flores generalmente blancas y muy fragantes. Muchos géneros producen frutos de color verde, amarillo o naranja, y con numerosas glándulas de aceite. La subtribu Citrinae, que incluye al género Citrus, aglutina 13 géneros que difieren mucho del resto de géneros de la subfamilia por sus frutos jugosos con vesículas de zumo en la pulpa, carácter que no se ha encontrado en otras plantas de la familia Rutaceae ni en ninguna otra planta superior. 2.5 Origen y dispersión de los cítricos Los cítricos son originarios de una área que se extiende desde las faldas del Himalaya en India a la China Central y las Islas Filipinas por el este y Birmania, Tailandia, Indonesia, Nueva Guinea, noreste de Australia y Nueva Caledonia por el sudeste (Cameron y Soost, 1976; Gmitter y Hu, 1990; Spiegel y Vardi, 1984; Swingle, 1943; Scora, 1975; Webber et al., 1967; Swingle y Reece, 1967; Iwamasa, 1977). Olivares-Fuster (1998), cita que algunos autores consideran que su centro de origen está en las zonas montañosas del sur de China y noreste de la India, mientras que otros consideran que se originaron en el noreste de la India y Birmania. Las especies actualmente cultivadas posiblemente se originaron en uno de los centros de diversidad de plantas cultivadas propuestos por Vavilov (1951): el naranjo dulce y el mandarino en el centro chino, y el naranjo agrio, el cidro, el limonero, el pomelo y la lima en el centro indo-malayo. Los cítricos se introdujeron a América por Cristóbal Colón en 1493, el cual trajo semillas de naranjo, limonero y cidro a Haití, y desde aquí se extendieron a México en El 9

23 establecimiento de estos cultivos en Brasil se realizó hacía la mitad del siglo XVI, la introducción en Florida entre 1515 y 1565 y en California hacía Las especies de Naranja, limón y pomelo llegaron a Sudáfrica a mitad del siglo XVII y a Australia a final del siglo XVIII (1788). El comercio mundial era ya importante durante la segunda mitad del siglo XIX, y desde entonces ha ido creciendo en volumen, número de variedades y países productores y consumidores. El desarrollo del conocimiento en torno a los cítricos ha permitido la evolución de las técnicas de cultivo, un mejor control de las enfermedades y la selección de variedades nuevas y mejor adaptadas posibilitando el mantenimiento de un elevado nivel de desarrollo de la citricultura mundial. 2.6 Necesidades de mejoramiento de los cítricos Los cítricos se cultivan en distintas zonas tropicales y subtropicales del mundo y en una gran diversidad de suelos y condiciones climáticas, por lo que están sometidos a diferentes condiciones de estrés tales como: suelos ácidos, alcalinos ó salinos, inundaciones y sequías, heladas y altas temperaturas; además están expuestos a muchas plagas y enfermedades causadas por hongos, bacterias, spiroplasmas, fitoplasmas, virus y viroides. Algunas enfermedades están presentes en la mayoría de las regiones cítricolas y causan grandes pérdidas lo que restringe el potencial de uso de determinados patrones. Entre las enfermedades importantes sobresalen la gomosis, producida por el hongo Phytophthora sp. (Timmer y Menge, 1988) y la tristeza de los cítricos (VTC), producida por un closterovirus que se transmite por diferentes especies de pulgones (Bar-Joseph y Marcus, 1989; Garnsey y Lee, 1988). Otras enfermedades están restringidas a ciertas regiones productoras, por ejemplo el Huanglongbing ( greening ) producido por la bacteria Liberobacter asiaticum y transmitido naturalmente por Diaphorina citri, que es el principal factor limitante de la citricultura del sudeste asiático. Otra bacteriosis conocida como la clorosis variegada, causada por la bacteria Xylella fastidiosa y transmitida por cicadélidos, fue detectada por primera vez en Brasil en 1987 y actualmente está causando la muerte de miles de árboles en este país (Oliveira et al., 2000). 10

24 Otro problema de la citricultura moderna es la reducida disponibilidad de fruta para satisfacer las exigencias de calidad de los mercados, las cuales son distintas para la industria y para el consumo en fresco. Los mercados de los países desarrollados demandan frutos cada vez de mayor calidad, que son difíciles de producir debido a la falta de variedades adecuadas o a la imposibilidad de cultivar los genotipos de alta calidad en muchas áreas debido a su susceptibilidad a diversos factores bióticos y abióticos. En consecuencia, a pesar de la variabilidad genética existente, el número de patrones y variedades disponibles para cultivarse en cada una de las diferentes regiones citricolas es limitado, por lo que la producción no está bien adaptada a las demandas del mercado y en consecuencia el beneficio económico para los agricultores se reduce de manera importante. La solución a esta problemática requiere la realización de programas de mejoramiento genético de patrones y variedades con objetivos específicos para las distintas regiones de cultivo. Los países productores que tienen un mercado de exportación, para mantenerse competitivos, requieren de la disponibilidad de variedades y patrones de calidad, dada la importancia del consumo y exportación de fruta fresca. Por lo tanto, las variedades representan sin ninguna duda la principal prioridad de los citricultores en Países desarrollados como España, Japón, Estados Unidos y Africa del Sur. La competencia en los mercados está aumentando de forma espectacular en los últimos años debido a distintos factores, entre los que se puede citar la aplicación de mejores técnicas de producción, la mayor eficacia y rapidez de los medios de transporte marítimo a largas distancias y la apertura de los mercados como consecuencia de los acuerdos para lograr una más libre comercialización. Es conveniente, contar con una base genética a partir de la cual se puedan iniciar programas de Mejoramiento. Así por ejemplo, el banco de germoplasma del IVIA en España dispone de plantas libres de patógenos de todas las variedades españolas de interés comercial y de las principales variedades extranjeras (Navarro, 1992, 1994; Navarro et al., 1975; 1988). A partir de este banco de germoplasma, los viveros han suministrado a los agricultores cerca de 65 millones de plantas desde 1982, lo que supone unas 135,000 hectáreas y más del 50% de la citricultura española. 11

25 A pesar de la aparentemente amplia colección de variedades disponibles para la propagación comercial en todo el mundo, existen lagunas importantes en algunos grupos de especies, por lo que varios países como España, Estados Unidos, Africa del Sur, Israel, Australia y Brasil entre otros, han considerado necesario abordar programas de investigación para la obtención de nuevas variedades. Entre las características importantes que debe reunir una variedad de cítricos para el consumo en fresco en se señalan las siguientes: a) elevada producción; b) época de maduración adecuada; c) color de fruto atractivo; d) tamaño de fruto relativamente grande, e) facilidad de pelado; f) fácil separación de segmentos; g) sabor y textura agradables; h) buena aptitud para la manipulación y el transporte; i) ausencia de semillas. Este último aspecto es absolutamente esencial, ya que el consumidor de los países importadores no acepta variedades con semillas (Olivares-Fuster, 1998). Los patrones también presentan una importante problemática en la citricultura mundial, dado que deben reunir necesariamente las siguientes características: a) tolerancia al virus de la tristeza y otros viroides; b) tolerancia a Phytophthora sp. y nemátodos; c) adaptación a suelos con elevados contenidos de caliza; d) producción de fruta de aceptable calidad en la variedad injertada; e) elevada producción de semillas con alta poliembrionía; f) buen crecimiento en vivero; g) facilidad en la plantación y crecimiento posterior en los huertos de los agricultores; h) tolerancia a problemas de suelo de manera que permita abarcar una superficie de cultivo más amplia (Castle, 1987; Castle, et al., 1993). Evidentemente es muy difícil reunir todas estas características en un solo patrón. Entre los diversos patrones tolerantes a tristeza utilizados en el mundo tan solo los citranges Troyer y Carrizo (C. sinensis x Poncirus trifoliata (L.) Raf.) y el citrumelo Swingle (C. paradisi x P. trifoliata L. Raf) y el mandarino Cleopatra se han utilizado de manera extensiva como portainjerto de naranjos y mandarinos. Entre ellos, el citrange Carrizo y el Citrumelo Swingle ha dado resultados globales muy superiores al resto y en la actualidad se usan en la mayoría de las nuevas plantaciones de España y Estados Unidos (Castle 1987; Olivares-Fuster,1998). 12

26 Las variedades de cítricos sobre citrange Carrizo y Citrumelo Swingle desarrollan fruta de buena calidad y presentan un comportamiento agronómico aceptable, pero no se adaptan a suelos salinos o calcáreos con elevado contenido en caliza activa (Castle, et al., 1993; Del Valle-Valdéz, 1997; Medina-Urrutia, 1996). Independientemente de los problemas específicos que pueda presentar su empleo, no es conveniente basar la citricultura de cualquier región en un solo patrón. En el caso de la aparición de una nueva enfermedad, si el portainjerto es sensible, aquella podría causar una verdadera catástrofe. De hecho, en diversas regiones se observa la muerte de algunos árboles aislados que puede ocurrir de manera paulatina o repentina que sólo podrían explicarse por la utilización de patrones fuera de tipo ó por la presencia de algún patógeno desconocido. Dentro del género Citrus existen otros patrones que presentan características agronómicas de gran interés, pero con inconvenientes específicos que hacen que su utilización sea muy limitada. Por ejemplo, el naranjo agrio es posiblemente el patrón más importante por su amplia adaptación a diversas condiciones del medio ambiente y por su excelente comportamiento hortícola, pero su gran sensibilidad a tristeza ha propiciado que comience a entrar en desuso (Rocha-Peña, et al.,1995; Castle, et al, 1993) en todo el mundo. El Alemow ó Macrofila (Citrus macrophylla Wester), promueve una elevada y rápida entrada en producción y se adapta muy bien a suelos salinos y con elevado contenido en caliza, pero su susceptibilidad a tristeza restringe su empleo para los cítricos dulces (Medina-Urrutia, 1996; Newcomb, 1978). Además de que induce un menor contenido de sólidos solubles en frutos de naranjo Valencia (Pérez et al., 2000). El mandarino Cleopatra es tolerante a tristeza y se adapta bien a suelos calcáreos, pero su crecimiento y entrada en producción en muy lenta (Castle, et al., 1993). La lima Rangpur tiene una excelente adaptación a condiciones de sequía, pero induce frutos de calidad inadecuada para el consumo en fresco (Castle, 1987). Por tanto, sería muy importante desarrollar nuevos genotipos que logren aglutinar los caracteres deseables de diversos patrones ya conocidos. Por otra parte, existen parientes de los cítricos que conservan en su genoma características de interés para el mejoramiento de portainjertos. Así por ejemplo algunos parientes de cítricos son resistentes o tolerantes a enfermedades y fisiopatías. 13