CERTEST. S. pneumoniae+legionella ONE STEP COMBO CARD TEST CERTEST BIOTEC S.L. For information purposes only
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- Juan Francisco Ávila Salinas
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1 ERES S. pneumoniae+ Legionella ONE SEP S. pneumoniae+legionella OMO RD ES ERES IOE S.L.
2 ERES S. pneumoniae+legionella ENGLISH INENDED USE erest S. pneumoniae+legionella one step combo card test is a coloured chromatographic immunoassay for the simultaneous qualitative detection of Streptococcus pneumoniae and Legionella pneumophila serogroup 1 in human urine samples. erest S. pneumoniae+legionella combo card test offers a simple and highly sensitive screening assay to make a presumptive diagnosis of pneumoniae and/or legionellosis in infected humans. INRODUION Gram positive bacteria, Streptococcus pneumoniae is one of the most important pathogen that affects mainly children and elderly and can cause life-threatening diseases. Streptococcus pneumoniae infection leads to many clinical manifestations including meningitis, septicaemia, bacteraemia, pneumonia, acute otitis media, and sinusitis. It has caused great morbidity and mortality worldwide, especially in children. Pneumococcal infection annually has caused approximately 14.5 million cases of invasive pneumococcal disease (IPD) and million deaths in children under five years old, mostly in developing and underdeveloped countries. ased on differences in the polysaccharide capsules of the pneumococcal cell wall, Streptococcus pneumoniae is classified into over 90 serotypes, which present different antigenic properties and induce different inflammatory responses. Legionnaires Disease, named after the outbreak in 1976 at the merican Legion convention in Philadelphia, is caused by Legionella pneumophila and is characterized as an acute febrile respiratory illness ranging in severity from mild illness to fatal pneumonia. he disease occurs in both epidemic and endemic forms and sporadic cases are not easily differentiated from other respiratory infections by clinical symptoms. n estimated 25,000 to 100,000 cases of Legionella infection occur in the United States annually. he resulting mortality rate, ranging from 25% to 40%, can be lowered if the disease is diagnosed rapidly and appropriate antimicrobial therapy is instituted early. Known risk factors include immunosuppression, cigarette smoking, alcohol consumption and concomitant pulmonary disease. he young and the elderly are particularly susceptible. Legionella pneumophila is responsible for 80-90% of reported cases of Legionella infection with serogroup 1 accounting for greater than 70% of all legionellosis. urrent methods for the laboratory detection of pneumonia caused by Legionella pneumophila require a respiratory specimen (e.g. expectorated sputum, bronchial washing, transtracheal aspirate, lung biopsy) or paired sera (acute and convalescent) for an accurate diagnosis. he erest S. pneumoniae+legionella allow for early diagnosis of S. pneumoniae and/or Legionella pneumophila serogroup 1 infection through detection of some specific soluble antigens present in the urine of patients with S. pneumoniae and/or L. pneumophila. he test is rapid, giving a result at 15 minutes, and utilizes a urine specimen which is convenient for collection, transport, and subsequent detection of early, as well as later, stages of disease. ES PRINIPLE erest S. pneumoniae+legionella is based on the principle of a qualitative immunochromatographic assay for the determination of Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) and Legionella pneumophila (L. pneumophila) in urine samples. Strip consists of a nitrocellulose membrane pre-coated with monoclonal antibodies on the test line (), in the results window, against S. pneumoniae and with rabbit polyclonal antibodies, on the control line (), against a specific protein. he label/sample absorbent pad is sprayed with test label solution (monoclonal antibodies anti-s. pneumoniae) conjugated to red polystyrene latex and control label solution (specific binding protein) conjugated to blue polystyrene latex, forming two coloured conjugate complexes. Strip consists of a nitrocellulose membrane pre-coated with polyclonal antibodies on the test line (), in the results window, against L. pneumophila and with rabbit polyclonal antibodies, on the control line (), against a specific protein. he label/sample absorbent pad is sprayed with test label solution (polyclonal antibodies anti-l. pneumophila conjugated to red polystyrene latex and control label solution (specific binding protein) conjugated to blue polystyrene latex, forming two coloured conjugate complexes. If the sample is Streptococcus pneumoniae positive, the antigens of the diluted sample react with the red-coloured conjugate complex (anti-s. pneumoniae monoclonal antibodies-red polystyrene microspheres) in the strip, and if the sample is L. pneumophila positive, the antigens of the diluted sample react with the red-coloured conjugated complex (anti-l. pneumophila polyclonal antibodies-red polystyrene microspheres) in strip, which were previously pre-dried on the absorbent pad. he mixture then moves upward on the membrane by capillary action. s the sample flows through the test membrane, the binding conjugate complexes migrate. he anti-s. pneumoniae antibodies present on the membrane of strip (test line) and the anti-l. pneumophila antibodies present on the membrane of strip (test line) capture the coloured conjugate and the red line will be visible in both strips. hese bands are used to interpret the result. If the sample is negative, there is no S. pneumoniae and L. pneumophila presence and yet, the antigens may be present in a concentration lower than the detection limit value, for which the reaction will not take place with any red-coloured conjugate complex. he anti-s. pneumoniae 1 IU-NL88 rev 00 January 2017 Revision 00 1 erest IOE S.L. Pol. Industrial Río Gállego II, alle J, Nº 1, 50840, San Mateo de Gállego, Zaragoza (SPIN)
3 ERES S. pneumoniae+legionella and anti-l. pneumophila antibodies present on the membranes (test lines) will not capture the antigen-red -coloured conjugate complex (not formed), for which the red lines will not appear. Whether the sample is positive or not, in both strips, the mixture continues to move across the membranes to the immobilized specific antibodies placed in the control lines. he anti-specific protein antibodies present on both membranes will capture control blue-conjugate complex and both control lines will always appear. he presence of these blue lines serve as: 1) verification that sufficient volume is added, 2) that proper flow is obtained and 3) an internal control for the reagents. SORGE ND SILIY Store as packaged in the sealed pouch at 2-30º. he test is stable until the expiration date marked on its sealed pouch. he test must remain in the sealed pouch until use. Do not freeze. PREUIONS - For professional in vitro diagnostic use. - Do not use after expiration date. - ll the specimens should be considered potentially hazardous and handled in the same manner as an infectious agent. new test must be used for each sample to avoid contamination errors. - he tests should be discarded in a proper biohazard container after testing. - Reagents contain preservatives. void any contact with skin or mucous membrane. onsult safety data sheet, available on request. - omponents provided in the kit are approved for use in the erest S. pneumoniae+legionella combo card test. Do not use any other commercial kit component. - Follow Good Laboratory Practices, wear protective clothing, use disposal gloves, goggles and mask. Do not eat, drink or smoke in the working area. SPEIMEN OLLEION ND PREPRION Urine specimens should be collected in standard containers. he samples can be stored at room temperature (15-30 ) if assayed within 24 hours of collection. lternatively, specimens may be stored at 2-8 for up to 14 days or at -10 to -20 for longer periods before testing. When necessary, urine specimens should be shipped in leak-proof containers at 2-8 or frozen. llow all specimens to equilibrate to room temperature before testing. MERILS MERILS PROVIDED MERILS REQUIRED U NO PROVIDED - erest S. pneumoniae+legioenella combo card tests - Specimen collection container - Plastic pipettes - Disposable gloves - esting tubes - imer - Reagent (sample and controls diluent) - Positive ontrol Swab: Inactivated S. pneumoniae swab + testing tube+ pipette - Positive ontrol Swab: Inactivated L. pneumophila swab + testing tube + pipette - Negative ontrol Swab: negative swab + testing tube + pipette - Instructions for use ES PROEDURE llow tests, urine samples, diluent and controls to reach room temperature (15-30º) prior to testing. Do not open pouches until the performance of the assay Procedure : Patient samples 1. Using a separate testing tube or vial for each sample. dd 6 drops of urine sample (1). 2. dd 2 drop of Reagent into the testing tube or vial and mix (2). Homogenize the sample. 3. Remove erest S. pneumoniae+legionella card test from its sealed bag just before using it. 2 IU-NL88 rev 00 January 2017 Revision 00 2 erest IOE S.L. Pol. Industrial Río Gállego II, alle J, Nº 1, 50840, San Mateo de Gállego, Zaragoza (SPIN)
4 ERES S. pneumoniae+legionella 4. Use a separate pipette and device for each sample or control. Dispense 3 drops from the testing tube in the circular window marked with the letter (3) and 3 drops, using the same testing tube, in the circular window marked with the letter (4). 5. Read the results at 15 minutes. Do not read the test result later than 15 minutes. Procedure : Positive ontrol Swabs. 1. Hold Reagent vertically. dd slowly 13 free falling drops of Reagent into the testing tube (1a). 2. Immediately remove S. pneumoniae Positive ontrol swab from the pouch and put the swab into the testing tube with reagents, mix 1 minute and extract as much liquid possible from the swab, squeezing the sides of the tube as the swab is withdrawn. Discard the swab (2a). 3. Remove the erest S. pneumoniae+legionella device from its sealed bag just before using. 4. Use a separate pipette and device for each sample or control. Dispense 3 drops from the testing tube, into the circular window marked with the letter (3a). 5. Read the result at 15 minutes. Do not read the test result later than 15 minutes. Repeat the procedure for Positive ontrol Swabs using erest Legionella Positive ontrol swab (1b, 2b), to dispense 3 drops from the testing tube, into the circular window marked with the letter (3b). Procedure : Positive ontrol Swabs Results window ontrol Line () est Line () Sample (S) circular Window for samples (/) S. pneumoniae Strip -procedure dd 3 drops in -circular window (3) (1) dd 6 drops of Urine Sample (2) dd 2 drops of Reagent and mix Legionella Strip -procedure dd 3 drops in -circular window (4) dd 3 drops in -circular window (1a) dd 13 drops of Reagent (2a) Introduce the erest S. pneumoniae Positive ontrol swab and mix 1 minute. Extract the liquid (3a) 3 IU-NL88 rev 00 January 2017 Revision 00 3 erest IOE S.L. Pol. Industrial Río Gállego II, alle J, Nº 1, 50840, San Mateo de Gállego, Zaragoza (SPIN)
5 ERES S. pneumoniae+legionella dd 3 drops in -circular window (1b) dd 13 drops of Reagent Procedure : Negative ontrol Swab. 6. Hold Reagent vertically. dd slowly 13 free falling drops of Reagent into the testing tube (1). 7. Immediately remove Negative control swab from the pouch and put the swab into the testing tube with reagents, mix 1 minute and extract as much liquid possible from the swab, squeezing the sides of the tube as the swab is withdrawn. Discard the swab (2). 8. Remove the erest S. pneumoniae+legionella device from its sealed bag just before using. 9. Use a separate pipette and device for each sample or control. Dispense 3 drops from the testing tube, into the circular window marked with the letter (3) and other 3 drops from the same testing tube into the circular window marked with the letter (4). 10. Read the result at 15 minutes. Do not read the test result later than 15 minutes. Procedure : Negative ontrol Swab (1) dd 13 drops of Reagent (2b) Introduce the erest Legionella Positive ontrol swab and mix 1 minute. Extract the liquid (2) Introduce the erest Negative ontrol swab and mix 1 minute. Extract the liquid (4) Positive and negative controls should be tested once for each new test kit opened and as otherwise required by your laboratory s standard quality control procedures. INERPREION OF HE RESULS (please refer to the illustration below) dd 3 drops in -circular window (3b) (3) dd 3 drops (from the same tube) in - circular window : lue Negative S. pneumoniae : lue/red Positive S. pneumoniae : lue/red Positive S. pneumoniae : lue Negative S. pneumoniae : lue Negative Legionella : lue/red Positive Legionella : lue Negative Legionella : lue/red Positive Legionella 4 IU-NL88 rev 00 January 2017 Revision 00 4 erest IOE S.L. Pol. Industrial Río Gállego II, alle J, Nº 1, 50840, San Mateo de Gállego, Zaragoza (SPIN)
6 ERES S. pneumoniae+legionella INVLID RESULS 5. (S. pneumoniae) (Legionella) Interpretation of the results here is no S. pneumoniae or L. pneumophila presence. No LUE LUE infection caused by S. pneumoniae or L. pneumophila serogroup 1. Negative control result here is S. pneumoniae and L. pneumophila presence. Infection LUE-RED LUE-RED caused by S. pneumoniae and L.pneumophila serogroup 1. Positive controls result here is S. pneumoniae presence. Infection caused by S. pneumoniae. LUE-RED LUE S. pneumoniae Positive control result here is L. pneumophila presence. Infection caused by L. LUE LUE-RED pneumophila serogroup 1. Legionella Positive control result. 5. ny other result ny other result Invalid result either or, we recommend repeating the assay using the same sample with another test. INVLID: otal absence of any control coloured line (LUE) regardless the appearance or not of the test lines (RED). Insufficient specimen volume, incorrect procedural techniques or deterioration of the reagents are mostly the main reasons for control lines failure. Review the procedure and repeat the assay with a new test. If the symptoms or situation still persist, discontinue using the test kit and contact your local distributor. NOES ON HE INERPREION OF RESULS he intensity of the red coloured bands in the test lines () in the results windows will vary depending on the concentration of antigens present in the specimen. However, neither the quantitative value nor the rate of increase in antigens can be determined by this qualitative test. QULIY ONROL Internal procedural controls are included in the test. he blue lines appearing in the control lines () in the results windows are internal controls, which confirm sufficient specimen volume and correct procedural technique. External Positive and Negative ontrols are included in the kit (see procedure and ). he use of positive and negative controls is recommended to assure functionality of reagents and proper performance of assay procedure. LIMIIONS 1. he test must be carried out within 2 hours after opening the sealed bag. 2. erest S. pneumoniae+legionella should be used only with human urine samples. he use of other samples (e. g. plasma, serum or other body fluids or environmental samples (water)) has not been established. 3. Positive results determine the presence of S. pneumoniae and/or Legionella serogroup 1 in urine samples; nevertheless, a positive result should be followed up with additional laboratory techniques to confirm the results. confirmed infection should only be made by a physician after all clinical and laboratory findings have been evaluated and must be based in the correlation of the results with further clinical observations. 5 IU-NL88 rev 00 January 2017 Revision 00 5 erest IOE S.L. Pol. Industrial Río Gállego II, alle J, Nº 1, 50840, San Mateo de Gállego, Zaragoza (SPIN)
7 ERES S. pneumoniae+legionella 4. negative result is not meaningful because of it is possible the antigens concentration in the urine sample is lower than the detection limit values. If the symptoms or situation still persist, a S. pneumoniae and/or L. pneumophila serogroup 1 determination should be carried out from a culture or other methods. 5. Excretion of S. pneumoniae and Legionella antigen in urine may vary depending on the individual patient. For legionella antigen excretion may begin as early as 3 days after onset of symptoms and persist for up to 1 year afterwards. positive erest S. pneumoniae+ Legionella result can occur due to current or past infection and therefore is not definitive for infection without other supporting evidence. 6. It has been proven that although the test is compatible with boric acid, its presence increases the reactivity and can lead to false positives, so it is not recommended as a preservative. EXPEED VLUES Streptococcus pneunoniae is the main cause of community acquired pneumonia, but also responsible cause of other diseases: meningitis, bloodstreem infection, otitis. In United States of merica, some analysis estimated that this pathogen was responsible of more than 4 million of illness episodes, hospitallization and deaths per year. he performance of the erest Streptococcus pneumoniae test has been evaluated by using positive and negative urine samples from European patients, as well as spiked urines. More than 50 Legionella species have been characterized, and 25 species are known to cause human disease. Most human infections are caused by Legionella pneumophila, which is responsible for approximately 90% of the identified clinical cases, and the predominant serogroup is serogroup 1. In recent years, hot springs have been recognized as a major source of outbreaks of legionellosis. Several outbreaks and a number of cases of Legionella infection that were associated with hot springs have been reported in Japan, Spain and France. PERFORMNE HRERISIS nalytical sensitivity (detection limit) Detection limit value of erest S. pneumoniae+legionella is: 0.25ng/mL of WPS for strip (S. pneumoniae) and 12.5ng/mL (pool of several serovars of Legionella pneumophila) for strip (Legionella). linical sensitivity and specificity n evaluation was performed, with urine samples, comparing the results obtained by the immunocromatographic test (erest S. pneumoniae+legionella, erest) and other commercial rapid test (inaxnow Streptococcus pneumoniae ntigen ard, lere) for strip. he results were as follows: I test: erest S. pneumoniae+legionella (S. pneumoniae) I test: inaxnow Streptococcus pneumoniae ntigen ard + - otal otal erest S. pneumoniae+legionella (S. pneumoniae) vs inax NOW Streptococcus pneumoniae ntigen ard Mean Value 95% confidence interval Sensitivity 89.20% % Specificity 98.60% % PPV 97.10% % NPV 94.80% % 6 IU-NL88 rev 00 January 2017 Revision 00 6 erest IOE S.L. Pol. Industrial Río Gállego II, alle J, Nº 1, 50840, San Mateo de Gállego, Zaragoza (SPIN)
8 ERES S. pneumoniae+legionella nother evaluation was performed, with urine samples, comparing the results obtained by an immunochromatographic test (erest S. pneumoniae+legionella, erest) and other commercial rapid test (inax NOW Legionella Urinary ntigen ard, lere) for strip. he results were as follows: I test: erest S. pneumoniae+legionella (Legionella) I test: inax NOW Legionella Urinary ntigen ard + - otal erest S. pneumoniae+legionella (Legionella) vs inax NOW Legionella Urinary ntigen ard Mean Value 95% confidence interval Sensitivity % % Specificity 99.20% % PPV 96.90% % NPV % % he results showed a high sensitivity and specificity to detect S. pneumoniae and Legionella pneumophila serogroup 1 using erest S. pneumoniae+legionella. ross reactivity n evaluation was performed to determine the cross reactivity of erest S. pneumoniae+legionella; no cross reactivity against other pathogens occasionally present in urine: Legionella (Strip ) Streptococcus pneumoniae (Strip ) Reproducibility Study Evaluation studies were performed to determine reproducibility of the erest S. pneumoniae+legionella, including inter-day, inter-laboratory, inter and intra lot, showing high reproducibility in all cases. 7 IU-NL88 rev 00 January 2017 Revision 00 7 erest IOE S.L. Pol. Industrial Río Gállego II, alle J, Nº 1, 50840, San Mateo de Gállego, Zaragoza (SPIN)
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10 ERES S. pneumoniae+legionella One Step test for detection of S. pneumoniae and Legionella in combo card format/ Prueba combo de un solo paso para detección de S. pneumoniae+legionella en formato cassette ESPÑOL USO PREVISO erest S. pneumoniae+legionella combo card test es una prueba inmunocromatográfica de un solo paso para la detección cualitativa simultánea de Streptococcus pneumoniae y Legionella pneumophila serogrupo 1 en muestras de orina humana. erest S. pneumoniae+legionella combo card test ofrece un ensayo de cribado sencillo y de alta sensibilidad para realizar un diagnóstico presuntivo de pneumonia (causado por Streptococcus pneumoniae) y/o legionelosis (causada por Legionella pneumophila serogrupo 1) en personas infectadas. INRODUIÓN La bacteria Gram positiva Streptococcus pneumoniae es uno de los patógenos más importantes y que afecta principalmente a los niños y personas de edad avanzada. Puede causar enfermedades que amenazan la vida. La infección por Streptococcus pneumoniae lleva a muchas manifestaciones clínicas incluyendo meningitis, septicemia, bacteriemia, neumonía, otitis media aguda y sinusitis. Ha causado gran morbilidad y mortalidad en todo el mundo, especialmente en los niños. La infección neumocócica ha causado aproximadamente 14.5 millones de casos de enfermedad neumocócica invasiva (ENI) y millones de muertes en niños menores de cinco años por año, la mayoría en países en desarrollo y subdesarrollados. En base a las diferencias en las cápsulas de polisacáridos de la pared celular neumocócica, Streptococcus pneumoniae se clasifica en más de 90 serotipos diferentes que presentan propiedades antigénicas e inducen diferentes respuestas inflamatorias. La legionelosis, que lleva ese nombre a raíz de un brote ocurrido en 1976 en una convención de la Legión mericana en Filadelfia, está causada por Legionella pneumophila y se caracteriza por una infección aguda febril de las vías respiratorias, cuya intensidad varía de una afección leve a una neumonía mortal. La enfermedad se presenta de forma epidémica y endémica y se dan casos esporádicos, cuyos síntomas clínicos no se diferencian fácilmente de otras infecciones respiratorias. Se estima que cada año se presentan de a casos de legionelosis en Estados Unidos. Un diagnóstico rápido y la administración temprana de una terapia antimicrobiana apropiada pueden reducir la tasa de mortalidad, que oscila entre el 25% y el 40%. Los factores de riesgo conocidos son la inmunosupresión, el tabaquismo, el consumo de alcohol y afecciones pulmonares concomitantes. Los jóvenes y ancianos son particularmente susceptibles. Legionella pneumophila es el agente responsable del 80-90% de los casos mencionados de infección por el serogrupo 1 de Legionella, lo que representa más del 70% de todos los casos de legionelosis. Los métodos de laboratorio actuales para la detección de la neumonía causada por Legionella pneumophila requieren una muestra respiratoria (por ejemplo: esputo, lavado bronquial, aspirado trans-traqueal, biopsia pulmonar) o sueros pareados (agudo y convaleciente). El test erest S. pneumoniae+legionella permite el diagnóstico precoz de la infección por Streptococcus pneumoniae y/o por serogrupo 1 de Legionella pneumophila a través de la detección de unos antígenos solubles específicos presentes en la orina de pacientes con infección por Streptococcus pneumonia y/o L. pneumophila. La prueba es rápida -dando un resultado en 15 minutos- y utiliza una muestra de orina - conveniente para la recogida, el transporte, y la posterior detección de principios, tanto en fase temprana como en otras etapas de la enfermedad. FUNDMENO DEL ES erest S. pneumoniae+legionella es una prueba cualitativa inmunocromatográfica para la detección cualitativa de Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) y Legionella pneumophila (L. pneumophila) en muestras de orina. ira consiste en una membrana de nitrocelulosa fijada previamente con anticuerpos monoclonales frente a S. pneumoniae en la línea de test (), en la ventana de resultados, y en la línea de control (), con anticuerpos policlonales de conejo frente a una proteína específica. En el material absorbente para la muestra se ha dispensado una preparación de reactivos de la línea de test (anticuerpos monoclonales frente a S. pneumoniae) conjugada con látex de poliestireno rojo y otra preparación para la línea de control (proteína específica de unión) conjugada con látex de poliestireno azul, formando dos complejos coloreados conjugados. ira consiste en una membrana de nitrocelulosa fijada previamente con anticuerpos policlonales frente a L. pneumophila en la línea de test (), de la ventana de resultados, y en la línea de control (), con anticuerpos policlonales de conejo frente a una proteína específica. En el material absorbente para la muestra se ha dispensado una preparación de reactivos de la línea de test (anticuerpos policlonales frente a L. pneumophila) conjugada con látex de poliestireno rojo y otra preparación para la línea de control (proteína específica de unión) conjugada con látex de poliestireno azul, formando dos complejos coloreados conjugados. Si la muestra es S. pneumoniae positiva, los antígenos de la muestra diluida reaccionan con el complejo conjugado coloreado rojo (anticuerpos monoclonales anti-s. pneumoniae-microesferas rojas de látex) en la tira, y si la muestra es L. pneumophila positiva, los antígenos de la muestra diluida de orina reaccionan con el complejo conjugado coloreado rojo (anticuerpos policlonales anti-l. pneumophila-microesferas rojas de látex) en la tira, los cuales fueron secados previamente en el material absorbente. Esta mezcla avanza por capilaridad a través de la IU-NL88 rev 00 January 2017 Revision 00 9 erest IOE S.L. Pol. Industrial Río Gállego II, alle J, Nº 1, 50840, San Mateo de Gállego, Zaragoza (SPIN)
11 ERES S. pneumoniae+legionella membrana. onforme la muestra va migrando también lo hacen los complejos conjugados. Los anticuerpos anti-s. pneumoniae presentes en la membrana de la tira (línea de test) y los anticuerpos anti-l. pneumophila presentes en la membrana de la tira (línea de test) capturarán el complejo coloreado del test y la línea roja aparecerá en ambas tiras. Estas líneas se usarán para interpretación del resultado. Si la muestra es negativa, no hay presencia de S. pneumoniae ni de L. pneumophila o los antígenos están presentes en una concentración inferior al límite de detección y no se produce reacción con ningún complejo coloreado rojo. Los anticuerpos anti-s. pneumoniae y anti-l. pneumophila presentes en las membranas (líneas de test) no capturarán el antígeno-complejo coloreado rojo (no formado) y no aparecerán las líneas rojas. Independientemente de que la muestra sea positiva o no, en ambas tiras, la mezcla continuará moviéndose a través de las membranas hacia los anticuerpos inmovilizados frente a la proteína específica localizados en las líneas de control. Estos anticuerpos anti-proteína específica presentes en ambas membranas capturarán el complejo conjugado de control y las líneas de control azules siempre aparecerán. La aparición de estas líneas se utiliza: 1) para verificar que se ha añadido el volumen de muestra suficiente, 2) que el flujo ha sido apropiado y 3) como control interno de los reactivos. ONDIIONES DE LMENMIENO El producto debe ser almacenado entre 2 y 30º en su envase original sellado, para conseguir un óptimo funcionamiento hasta la fecha de caducidad impresa en el envase. No debe abrirse hasta el momento de su uso. No congelar. PREUIONES - Sólo para uso profesional in vitro. - No utilizar después de la fecha de caducidad. - Las muestras se deben considerar potencialmente peligrosas y deben ser manipuladas de la misma forma que a un agente infeccioso. Un nuevo test deberá utilizarse para cada muestra para evitar errores de contaminación. - Los tests usados deben ser gestionados como residuos sanitarios (contenedor de residuos sanitarios). - Los reactivos contienen conservantes. Debe evitarse cualquier contacto con la piel o las mucosas. onsultar fichas de seguridad, disponibles bajo petición. - Los componentes proporcionados con el kit son aprobados para su uso con erest S. pneumoniae+legionella combo card test. No se deben usar con componentes de otros kits comercializados. - Seguir las uenas Prácticas de Laboratorio, llevar ropa de protección adecuada, usar guantes desechables, gafas de protección y mascarilla. No comer, ni beber o fumar en la zona de trabajo. REOGID DE MUESRS Y PREPRIÓN ome las muestras de orina en envases normales para este tipo de muestras. Dichas muestras se podrán almacenar a temperatura ambiente (15-30 ) si la prueba se va a realizar dentro de las 24 horas de la toma de muestras. omo alternativa, se podrán almacenar las muestras a 2-8 por un máximo de 14 días o entre -10 y -20 durante periodos más largos antes de realizar la prueba. Si fuera necesario trasladar las muestras de orina, transpórtelas en envases herméticos a 2-8 o congeladas. ntes de realizar este test es preciso que todas las muestras alcancen la temperatura ambiente. MERILES MERILES SUMINISRDOS MERILES NEESRIOS NO SUMINISRDOS - erest S. pneumoniae+legionella combo card tests - Recipiente para recogida de muestras - Pipetas de plástico - Guantes desechables - ubos de ensayo - ronómetro - Reactivo (diluyente de muestra y controles) - ontrol Positivo: hisopo con S. pneumoniae inactivada + tubo ensayo+ pipeta - ontrol Positivo: hisopo con L. pneumophila inactivada + tubo ensayo+ pipeta - ontrol Negativo: hisopo negativo + tubo ensayo + pipeta - Instrucciones de uso 10 IU-NL88 rev 00 January 2017 Revision erest IOE S.L. Pol. Industrial Río Gállego II, alle J, Nº 1, 50840, San Mateo de Gállego, Zaragoza (SPIN)
12 ERES S. pneumoniae+legionella One Step test for detection of S. pneumoniae and Legionella in combo card format/ Prueba combo de un solo paso para detección de S. pneumoniae+legionella en formato cassette PROEDIMIENO Previamente los tests, las muestras de orina, el reactivo y los controles se deben acondicionar a la temperatura ambiente (15-30º). No abrir los envases hasta el momento de la prueba. Procedimiento : Muestra de pacientes 1. Utilice un vial o tubo de ensayo diferente para cada muestra. ñada 6 gotas de muestra de orina (1). 2. ñada 2 gotas del Reactivo dentro del tubo de ensayo o vial y mezclar (2). Homogeneizar la muestra. 3. Sacar el test erest S. pneumoniae+legionella de su envase antes de utilizarlo. 4. Usar una pipeta y un test diferente para cada muestra o control. ñadir 3 gotas a partir del vial en la ventana circular marcada con la letra (3) y añadir 3 gotas, del mismo tubo, en la ventana circular marcada con la letra (4). 5. Leer el resultado a los 15 minutos. No leer el resultado superados los 15 minutos. Procedimiento : Hisopos ontrol Positivo Ventana de resultados (/) ontrol Line () est Line () Ventanas (S) circulares para la muestra (/) Procedimiento para la tira de S. pneumoniae ñadir 3 gotas en la ventana circular () (3) Procedimiento para la tira de Legionella ñadir 3 gotas en la ventana circular () 1. olocar el bote de Reactivo verticalmente. ñadir lentamente 13 gotas del Reactivo en el tubo de ensayo (1a). 2. Sacar inmediatamente erest S. pneumoniae Positive control de su envase e introducir dentro del tubo de ensayo con el reactivo, mezclar durante 1 minuto y extraer la mayor cantidad posible de líquido del hisopo, presionando las paredes del tubo. Desechar el hisopo (2a). 3. Sacar el test erest S. pneumoniae+legionella de su envase antes de utilizarlo. 4. Usar una pipeta y un test diferente para cada muestra o control. ñadir 3 gotas desde el tubo de ensayo, en el pocillo marcado con una (3a). 5. Leer el resultado a los 15 minutos. No leer el resultado tras superar los 15 minutos. Repita el procedimiento para controles positivos utilizando el hisopo erest Legionella Positive control swab (1b, 2b), se deben dispensar otras 3 gotas del mismo tubo, en la ventana circular marcada con la letra (3b). (1) ñadir 6 gotas de orina ñadir 2 gotas de Reactivo y mezclar (4) (2) IU-NL88 rev 00 January 2017 Revision erest IOE S.L. Pol. Industrial Río Gállego II, alle J, Nº 1, 50840, San Mateo de Gállego, Zaragoza (SPIN)
13 Procedimiento : Hisopos ontrol Positivo ERES S. pneumoniae+legionella ñadir 3 gotas en la ventana circular () (1a) ñadir 13 gotas de Reactivo (1b) ñadir 13 gotas de Reactivo Procedimiento : hisopo ontrol Negativo. 6. olocar el bote de Reactivo verticalmente. ñadir lentamente 13 gotas del Reactivo en el tubo de ensayo (1). 7. Sacar inmediatamente erest Negative ontrol de su envase e introducir dentro del tubo de ensayo el reactivo, mezclar durante 1 minuto y extraer la mayor cantidad posible de líquido del hisopo, presionando las paredes del tubo. Desechar el hisopo (2). 8. Sacar el test erest S. pneumoniae+legionella de su envase antes de utilizarlo. 9. Usar una pipeta y un test diferente para cada muestra o control. ñadir 3 gotas desde el tubo de ensayo, en el pocillo marcado con una (3) y otras 3 gotas del mismo tubo en el pocillo marcado con la letra (4). 10. Leer el resultado a los 15 minutos. No leer el resultado tras superar los 15 minutos. Procedimiento : Hisopo ontrol Negativo (1) ñadir 13 gotas de Reactivo (2a) Introducir el hisopo erest S. pneumoniae Positive ontrol y mezclar 1 minuto. Extraer el líquido. (2b) Introducir el hisopo erest Legionella Positive ontrol y mezclar 1 minuto. Extraer el líquido (2) Introducir el hisopo erest Negative ontrol y mezclar 1 minuto. Extraer el líquido ñadir 3 gotas en la ventana circular () ñadir 3 gotas en la ventana circular () (3a) (3b) Y añadir otras 3 gotas, del mismo tubo, en la ventana circular () Los controles positivos y negativos deberían usarse cada vez que se utilice un nuevo kit o según indiquen los controles establecidos por su laboratorio para los procedimientos de control de calidad. 12 IU-NL88 rev 00 January 2017 Revision erest IOE S.L. Pol. Industrial Río Gállego II, alle J, Nº 1, 50840, San Mateo de Gállego, Zaragoza (SPIN)
14 ERES S. pneumoniae+legionella One Step test for detection of S. pneumoniae and Legionella in combo card format/ Prueba combo de un solo paso para detección de S. pneumoniae+legionella en formato cassette INERPREIÓN DE RESULDOS (por favor, fíjese en el siguiente dibujo) : zul Negativo S. pneumoniae : zul/rojo Positivo S. pneumoniae : zul/rojo Positivo S. pneumoniae : zul Negativo S. pneumoniae : zul Negativo Legionella : zul/rojo Positivo Legionella : zul Negativo Legionella : zul/rojo Positivo Legionella RESULDOS INVÁLIDOS 5. Interpretación de los resultados (S. pneumoniae) (Legionella) No hay presencia de S. pneumoniae o L. pneumophila. No hay infección causada por S. pneumoniae o L. pneumophila serogrupo 1. ZUL ZUL Resultado del control negativo Hay presencia de S. pneumoniae y L. pneumophila. Infección causada por S. pneumoniae y L. pneumophila. ZUL-ROJO ZUL-ROJO Resultado controles positivos Hay presencia de S. pneumoniae. Infección causada por S. pneumoniae. ZUL-ROJO ZUL Resultado S. pneumoniae Positive control Hay presencia de L. pneumophila. Infección causada por L. pneumophila. ZUL ZUL-ROJO Resultado L. pneumophila Positive control 5. ualquier otro resultado ualquier otro resultado ualquier resultado inválido en o en : se recomienda repetir la prueba con la misma muestra y otro test. INVÁLIDO: uando alguna línea de control (ZUL) no aparece, independientemente de que aparezcan o no las líneas de test (ROJ). Las causas más comunes por las que puede aparecer un resultado inválido son: un volumen insuficiente de muestra, una forma de proceder incorrecta o un deterioro de los reactivos. Si ocurriera esto, debe revisar el procedimiento y repetir la prueba con un nuevo test. Si los síntomas o la situación persisten, debe dejar de utilizar la prueba y contactar con su distribuidor. OSERVIONES La intensidad de las líneas de color rojo en las líneas de test () en la ventana de resultados variará dependiendo de la concentración de antígenos presente en la muestra. Sin embargo, esta prueba es cualitativa, por lo que, ni la cantidad ni la tasa de aumento de antígenos pueden ser determinados por la misma. IU-NL88 rev 00 January 2017 Revision erest IOE S.L. Pol. Industrial Río Gállego II, alle J, Nº 1, 50840, San Mateo de Gállego, Zaragoza (SPIN)
15 ERES S. pneumoniae+legionella ONROL DE LIDD Los controles internos de funcionamiento vienen incluidos en la prueba. Las líneas azules que aparecen en las líneas de control () en las ventanas de resultados son los controles internos del proceso, comprobando que el volumen de muestra es suficiente y que el procedimiento seguido ha sido el adecuado. ontroles externos Positivos y negativos se incluyen en el kit (ver procedimiento ). Se recomienda el uso de controles positivos y negativos para asegurar el correcto funcionamiento de los reactivos y la realización correcta de la muestra. LIMIIONES 1. Una vez abierto, el test no debe usarse después de 2 horas. 2. erest S. pneumoniae+legionella debería utilizarse sólo con muestras de orina humanas. El uso de otras muestras (por ejemplo plasma, suero u otros fluidos del cuerpo o muestras ambientales (agua)) no ha sido evaluado. 3. Los resultados positivos determinan la presencia de S. pneumoniae y/o L. pneumophila serogrupo 1 en muestras de orina; sin embargo, un resultado positivo debería ser contrastado con otras técnicas de laboratorio para confirmar los resultados. La infección debe confirmarse por un especialista o médico cualificado, tras evaluar las pruebas clínicas y los hallazgos de laboratorio teniendo en cuenta la correlación que puede existir con todas las observaciones clínicas. 4. Un resultado negativo no se debe considerar como concluyente, puede darse que la concentración de antígenos en la muestra de orina sea inferior a los valores del límite de detección. Si los síntomas o la situación persisten, la determinación de S. pneumoniae y/o L. pneumophila serogrupo 1 se debería realizar con un cultivo u otros métodos. 5. La excreción de antígenos de S. pneumoniae y Legionella en la orina puede variar para cada paciente. La excreción de antígeno de Legionella puede iniciarse a los 3 días del inicio de los síntomas y mantenerse hasta un año después. Es posible que se produzca un resultado positivo con erest S. pneumoniae+legionella, debido a una infección presente o pasada y, por lo tanto, dicho resultado positivo no es definitivo para la infección a menos de existir otra evidencia. 6. Se ha comprobado que si bien el test es compatible con ácido bórico, su presencia incrementa la reactividad pudiendo conducir a falsos positivos, por lo que no se recomienda su uso como preservante. VLORES ESPERDOS El Streptococcus pneunoniae es la principal causa de neumonía adquirida en la comunidad, sino que también causa responsable de otras enfermedades: la meningitis, septicemia, otitis. En los Estados Unidos de mérica, algunos análisis estiman que este patógeno fue responsable de más de 4 millones de episodios de enfermedad, hospitalizaciones y muertes por año. El rendimiento de la prueba de erest Streptococcus pneumoniae ha sido evaluado mediante el uso de muestras de orina positivas y negativas de los pacientes europeos, así como muestras de orina preparadas. Han sido caracterizadas más de 50 especies de Legionella, y se sabe que 25 especies causan enfermedad en humanos. La mayoría de estas infecciones humanas son causas por Legionella pneumophila, la cual es identificada como responsable de aproximadamente el 90% de los casos clínicos, y el serogrupo predominante es el serogrupo 1. En los últimos años, las primaveras calurosas se han reconocido como el principal origen de los brotes de legionelosis. Varios brotes y un gran número de casos de infección por Legionella que se asociaron con primaveras calurosas se registraron en Japón, España y Francia. RERÍSIS DEL ES Sensibilidad analítica (límite de detección) El límite de detección de erest S. pneumoniae+legionella es 0.25ng/mL de WPS para la tira (S. pneumoniae) y 12.5ng/mL (mezcla de varios serovares de Legionella pneumophila) para la ira (Legionella). Sensibilidad y especificidad clínica Se llevó a cabo una evaluación, con muestras de orina, comparando los resultados obtenidos por un test inmunocromatográfico (erest S. pneumoniae+legionella erest) y otro test rápido comercializado (inax NOW Streptococcus pneumoniae ntigen ard, lere) para la tira. Los resultados se muestran a continuación: 14 IU-NL88 rev 00 January 2017 Revision erest IOE S.L. Pol. Industrial Río Gállego II, alle J, Nº 1, 50840, San Mateo de Gállego, Zaragoza (SPIN)
16 ERES S. pneumoniae+legionella One Step test for detection of S. pneumoniae and Legionella in combo card format/ Prueba combo de un solo paso para detección de S. pneumoniae+legionella en formato cassette I test: inax NOW Streptococcus pneumoniae ntigen ard I test: erest S.pneumoniae+Legionella (S. pneumoniae) + - otal otal erest S. pneumoniae+legionella (S. pneumoniae) vs inax NOW Streptococcus pneumoniae ntigen ard Mean Value 95% confidence interval Sensibilidad 89.20% % Especificidad 98.60% % VPP 97.10% % VPN 94.80% % Se llevó a cabo otra evaluación, con muestras de orina, comparando los resultados obtenidos por un test inmunocromatográfico (erest S. pneumoniae+legionella erest) y otro test rápido comercializado (inax NOW Legionella Urinary ntigen ard, lere) para la tira. Los resultados se muestran a continuación: I test: erest S. pneumoniae+legionella (Legionella) I test: inax NOW Legionella Urinary ntigen ard + - otal erest S. pneumoniae+legionella (Legionella) vs inax NOW Legionella Urinary ntigen ard Mean Value 95% confidence interval Sensitivity % % Specificity 99.20% % PPV 96.90% % NPV % % Los resultados mostraron que erest S. pneumoniae+legionella presenta una alta sensibilidad y especificidad para detectar Streptococcus pneumoniae y Legionella pneumophila serogrupo 1. Reacciones cruzadas Se realizó una evaluación para determinar posibles reacciones cruzadas del test erest S. pneumoniae+legionella, no se detectó reacción cruzada con varios patógenos ocasionalmente están presentes en la orina: Legionella (ira ) Streptococcus pneumoniae (ira ) Estudio reproducibilidad Se realizó una evaluación para determinar la reproducibilidad del test erest S. pneumoniae+legionella, incluyendo ensayos inter-día, interlaboratorio, inter e intra lote que mostraron una alta reproducibilidad en todos los casos. IU-NL88 rev 00 January 2017 Revision erest IOE S.L. Pol. Industrial Río Gállego II, alle J, Nº 1, 50840, San Mateo de Gállego, Zaragoza (SPIN)
17 REFERENES/ILIOGRFÍ ERES S. pneumoniae+legionella 1. Montagnani F, Fanetti, Stolzuoli L, roci L, rena F, Zanchi, ellesi. J. Pneumococcal disease in a paediatric population in a hospital of central Italy: a clinical and microbiological case series from 1992 to 2006, Infect Mar;56 (3): doi: /j.jinf Epub 2008 Jan Liu Y, Wang H, hen M, Sun Z, Zhao R, Zhang L, Wang H, Zhang H, Wang L, hu Y, Liu Y, Ni Y. Serotype distribution and antimicrobial resistance patterns of Streptococcus pneumoniae isolated from children in hina younger than 5 years. Diagn Microbiol Infect Dis Jul;61(3): doi: /j.diagmicrobio Epub 2008 Mar VPD Surveillance Manual, 5th Edition, 2012, 11 Pneumococcal Disease: hapter ROIG, J. et. al. omparative study of Legionella pneumophila and other nosocomial-acquired pneumoniaes. hest. 1991;99: ERDL,.P., et al. Detection of Legionella pneumophila antigen in urine by enzyme-linked immunospecific assay. J. lin. Microbiol. 1979;9: WHIE., et al. Rapid diagnosis of Legionnaires disease. rans m lin. limatol. ssoc.l 1982;93: SYMOLS FOR IVD OMPONENS ND REGENS/SÍMOLOS PR REIVOS Y PRODUOS PR DIGNÓSIO IN VIRO ontrol + In vitro diagnostic device Producto para diagnóstico in vitro onsult instructions for use onsultar las instrucciones de uso Positive ontrol. ontrol Positivo ontrol - Keep dry lmacenar en lugar seco emperature limitation Limitación de temperatura Negative ontrol. ontrol Negativo Use by Fecha de caducidad ontains sufficient for <n> test ontiene <n> test DIL Manufacturer Fabricante Sample diluent Diluyente de muestra atch code Número de lote atalogue number Número de referencia 16 IU-NL88 rev 00 January 2017 Revision erest IOE S.L. Pol. Industrial Río Gállego II, alle J, Nº 1, 50840, San Mateo de Gállego, Zaragoza (SPIN)
18 erest IOE S.L. Pol. Industrial Río Gállego II, alle J, Nº 1, 50840, San Mateo de Gállego, Zaragoza (SPIN)
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