METAGENÓMICA DEL ACUÍFERO DE YUCATÁN: ESCRUTINIO DE UNA GENOTECA PARA LA BÚSQUEDA DE NUEVOS METABOLITOS CON ACTIVIDAD BIOLÓGICA

Transcripción

1 METAGENÓMICA DEL ACUÍFERO DE YUCATÁN: ESCRUTINIO DE UNA GENOTECA PARA LA BÚSQUEDA DE NUEVOS METABOLITOS CON ACTIVIDAD BIOLÓGICA Miguel David Marfil Santana, Aileen O Connor Sánchez, Alejandra Prieto Davó

2 Acuífero de Yucatán: el río subterráneo más grande del mundo Sistema en flujo constante Disolución de CaCO 3 en plataforma Kárstica Mezcla de agua de mar y dulce Muy poco contenido de materia orgánica Diversidad de microorganismos poco estudiada

3 Estudio de un metagenoma microbiano Imagen: Lewin et al., 2013 (Handlesman et al., 1998)

4 CONSTRUCCIÓN DE LIBRERÍA METAGENÓMICA

5 Aunque el fabricante del kit te da las instrucciones, la construcción no es trivial

6 Cepa y fósmido vector Escherichia coli EPI300

7 ANÁLISIS DESCRIPTIVO DEL METAGENOMA es.mesoamericanreef.org

8 Diversidad de microorganismos en muestras de agua de pozo (acuífero de Yucatán) MG Rast

9 Presencia de microorganismos con gran capacidad de producción de metabolitos secundarios MG-Rast MG Rast

10 Diversidad funcional demuestra potencial del metagenoma en metabolismo secundario MG-Rast

11 Crecimiento exponencial del número de artículos relacionados con metagenomas y antibióticos/antimicrobianos Primeros compuestos antimicrobianos aislados a partir de un metagenoma (Gillespie et al., 2002) Garmendia, et al., 2012

12 Estrategia experimental Metagenóma del acuífero de Yucatán Biblioteca metagenómica del acuífero de Yucatán pirosecuenciación Escrutinio por actividad fenotípica (inhibición de crecimiento del patógeno) Identificación y Aislamiento de clonas positivas por hibridación DNA-DNA (sondas para PKS y NRPS) Escrutinio molecular in silico (por secuencia de PKS y NRPS) Secuenciación de clonas positivas Análisis de los fragmentos en la bases de datos del NCBI Análisis de los fragmentos positivos en la bases de datos del NCBI Análisis de resultados Miguel David Marfil Santana

13 Culturacolectiva.com ESCRUTINIO MOLECULAR Trabajo de doctorado de Miguel David Marfil Santana

14 Miguel Marfil, modificado de Robinson JA (1991) Policétidos: por lo general, compuestos biológicamente activos 45,000 pb Región reguladora Región reguladora 23,000 pb TE

15 Péptidos no ribosomales: Biosíntesis por módulos utilizando aminoácidos Condensación hidrolisis Miguel Marfil, modificado de Sieber and Marahiel 2003

16 Uso de secuencias reportadas para dominios de ceto-sintasa (PKS) y de adenilación (NRPS) (Zhao et al., 2008) KS AMDPQQWLVLEVSWHALENANLAPDKLVGSRSGVYMGISTHDYSGLHMKQGDETAVDMYVSTGNAANVAAGRLSYLLGLQGP SMAIDTACSSSLVAVYLACQSLRSGDSDLALAGGVNLVLAPEVSIMLSKAHMMSPDGRCKTFDAGANGFVRGEGCGVVVLKR LSDAQAANDTIVAVIRGWACNQDGRSSGLTAPNGVAQQAVVRQALACGGVKPHQIGYVETHGTGT Dominio A AGGAYVPLDPAYPAGRQAQMLNDCSARCVLTCKIVAFSLYWYTRRYIWICQCPRYNYVTLAYVMYTSGSTGKPKGVRIGHPS IINFLLSMNDRLQVTTETQLLAITTYAFDISILELLIPLMYGGVVHVCPREVSQDGNQLVDYLNAKSINILQATPASWKMLL Moffit y Neilan, 2001; Neilan et al., 1999 DSEWSGNARLTALCGGEALDTILAEKLLGKVGCLWNVYGPTETTVWSSAARITDAKYIDLGEPLANTQLYVLDEQQRLVPPG VMGELWIGGDGLAVDYWHRSELTDAQFRTLPSLPNAGRLYRTGDKVCLRTDGRLTHHGRLDLQVKIRGY PerfectBlast (Santiago-Sotelo y Ramírez Prado, 2012) para encontrar secuencias similares en base de datos creada con el metagenoma PKS I: 125 secuencias con mas del 80 % de similitud con secuencias ya reportadas NRPS: 85 secuencias con mas del 80% de similitud con secuencias ya reportadas

17 PKS La función asignada a las secuencias obtenidas por PerfectBlast se comprobó al comparar con NCBI RNPS

18 ESCRUTINIO FUNCIONAL

19 Escrutinio funcional: método doble capa Cepa patógena Incubación 12 hrs Temperatura 37 C 0.5 DO Inoculación Medio solido a 45 C 1 ml de cepa patógena en 100 ml de medio 0.5 DO Biblioteca metagenómica Incubación 12 hrs Temperatura 37 C Secado por 2 horas Doble capa Incubación hrs Temperatura 37 C Capa de 15mm resultados Miguel Marfil

20 Estandarización de técnica de doble capa con controles positivos Sensi-disco: estreptomicina 100μg/ml EPI300 1TZA11 2TZA16 1TZA17 1XHA25 E. coli Cellulomonas sp. B. subtilis Cepas control obtenidas de cenotes del acuífero (Susana de la rosa, 2007) Miguel Marfil

21 Resultados después de modificación del método de escrutinio

22 Resultados fortuitos del escrutinio vs Staphylococcus aureus

23 A DÓNDE VAMOS?

24 Construcción de genoteca en cepas distintas a E. coli y con capacidad de producción de antibióticos Deletion of S. lividans endogenous antibiotic gene clusters. Martinez A et al. Appl. Environ. Microbiol. 2004;70:

25 Comparación de metagenomas en distintos puntos del acuífero Geological Survey of Canada

26 Cultivo de bacterias productoras de compuestos bioactivos

27 Agradecimientos Amigos y compañeros de laboratorio Dr. Cesar de los Santos Briones Max Mizrain Apolinar Hernández Yokojushy Cerón Raziel Cachón Herrera Lidia Ek Novelo Judyt Caamal Chan Abril Morales

28 Gracias por su atención! Becas de licenciatura y tesis de licenciatura disponibles Además: Posgrados de excelencia CONACyT (maestría y doctorado) en Ciencias del Mar y Limnología (UNAM, Sisal) Ciencias Biológicas con opción a biotecnología (CICY, Mérida) Posgrado institucional en ciencias agropecuarias y manejo de recursos naturales tropicales (UADY)