Técnicas de Ingeniería Genética

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María Soler Ortíz
hace 5 años
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1 Técnicas de Ingeniería Genética

2 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA: PCR Kary Mullis de Cetus Corporation.1985

4 Video PCR

6 Tapa que calienta Termociclador

7 Tubos de pared delgada

8 Taq polimerasa

9 Taq polimerasa: ADN polimerasa termoestable aislada de la bacteria termofílica Thermus acuaticus por Thomas Brock en 1965 Características: Temperatura óptima ºC., vida media 9 min. a 97,5 ºC. No tiene actividad 3 a 5 exonucleasa baja fidelidad Deja A en extremos 3 Otras ADN polimerasas: Pfu ADN polimerasa, aislada la bacteria termofílica Pyrococcus furiosus.tiene actividad 3 a 5 exonucleasa alta fidelidad

10 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase

11 FIDELIDAD Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Error rates of different DNA polymerases. Fidelity assays were done using lac I-based method modified from Frey & Suppmann, 1995.

12 PROCESSIVITY Extreme processivity: The Phusion polymerase has the highest processivity of all thermostable DNA polymerases tested A 3.8 kb human beta globin gene was amplified according to supplier's recommendations using varying extension times.

14 Templado ADN: moléculas blanco 1 μg ADN humano, copia simple 10 ng ADN de levadura 1 ng ADN E. coli Taq: 1-2,5 u dntps : μm Mg ++ : mm Primers: μm

15 Diseño de primers Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG) Evitar fragmentos largos de Gs (problema en síntesis) Largo nuc. El largo de los primers no debe diferir en más de 3 nuc. Extremo 3 : G o C, pero evitar 3 o más Gs o Cs seguidas Tm ºC Contenido de GC: % Evitar palindromos y repeticiones invertidas

16 Evitar complementariedad entre los pares de primers Controlar la formación de dímeros y horquillas : evitar estructuras con ΔG<-5kcal/mol Primers muy largos, > 50 b deben, ser purificados Verificar que los primers estén diseñados y encargados en la orientación correcta Sitios de corte en extremos, agregar bases extra.

17 Primers degenerados Amplificación de un mismo gen de distinto organismo Diseño de primers basado en la sec. de aa. de la proteína Buscar zonas conservadas para ubicar los primers Largo de primers 6 a 7 aa, (agregar colas) Buscar el primer menos degenerado Fragmento de PCR: alrededor de 400 pb Desventaja: baja especificidad Touchdown PCR: gradual de la temperatura

18 1 opción M W 2 opciones F Y H Q N K D E C 3 opciones I 4 opciones V P T A G 6 opciones L S R Cálculo de degeneración DEWVP: 2x2x1x4x4= 64

19 Condiciones de reacción Temperatura de Annealing /hibridación: 5ºC por debajo de la Tm Elongación: 0,5-3 min (2 min para 1 kb), ºC Ciclos: el número depende de la cc. del ADN blanco

20 Causas del plateau: degradación de dntps y enzima, depleción de primers y dntps, inhibición por formación de producto (pirofosfato), competición por reactivos por productos inespecíficos,

21 IMPUREZAS QUE INHIBEN LA PCR Impureza SDS Fenol Etanol Isopropanol Acetato de sodio Cloruro de sodio EDTA Hemoglobina Heparina Urea Mezcla de reacción de RT Concentración inhibitoria > % (p/v) > 0.2 % (p/v) > 1 % (v/v) > 1 % (v/v) > 5 mm > 25mM > 0.5 mm > 1 mg/ml > 0.15 UI/ml > 20 mm > 15 % (p/v)

22 Aditivos Condiciones de desnaturalización del ADN más fuertes: para ADN con alto contenido de G+C DMSO DMF UREA FORMAMIDA hasta 10 % (V o P/P) Para amplificar secuencias muy largas: DMSO.ayuda en productos >1 kb FORMAMIDA mejora especificidad GLICEROL templados con alto contenido de G+C PEG cc. de templado muy baja

23 ALGUNOS TIPOS DE PCR PCR ANIDADA PCR IN SITU PCR MULTIPLEX RT-PCR PCR EN TIEMPO REAL= PCR cuantitativa (qpcr) PCR DIGITAL

24 PCR ANIDADA = NESTED PCR Especificidad

25 PCR in situ 1º: amplificación del ADN blanco. 2º: hibridación in situ con sonda

26 PCR multiplex Uso de varios primers al mismo tiempo

27 RT PCR

29 PCR en tiempo real Amplificación y detección simultánea, en el mismo vial cerrado Se puede medir en cada momento la cantidad de ADN sintetizado, por lo tanto permite conocer la cinética de la reacción de amplificación Se mide la fluorescencia emitida por agentes intercalantes o por sondas específicas marcadas con fluorocromos

30 FASES DE LA PCR Log [ADN] Nº DE CICLO 3 replicados de una misma muestra

34 Curva de amplificación El programa calcula el número de ciclo en el que el lector empieza a detectar un incremento de fluorescencia significativo con respecto a la señal de base : ciclo umbral (CT: threshold cycle)

35 PCR EN TIEMPO REAL

36 Colorantes que se unen a ADN ds: SYBR Green, fluoresce al unirse al ADN Barato Se une a productos inespecíficos como dímeros de primers Sondas de hibridación Caras Específicas Se puede usar en PCR multiplex

37 PCR EN TIEMPO REAL sondas de hibridación específicas Sondas de hidrólisis Molecular beacons Sondas FRET

38 PCR DIGITAL

40 MUTAGÉNESIS DIRIGIDA

41 VECTOR CON ORI DE BACTERIÓFAGO Vectores con ori de fago: se coinfectan con fago helper para generar viriones simple cadena Preparar DNA del fago e hibridar con oligo Mutagénico (dot blot) para identificar positivos

42 MUTAGÉNESIS POR PCR

43 Phusion Site-Directed Mutagenesis Kit Thermo Fisher Because minute amounts of template DNA are exponentially amplified in this method, the fraction of non-mutated template is minimal. Thus there is no need to destroy it in a separate step. Phusion Hot Start II DNA Polymerase ensures high fidelity for the exponential amplification, thus reducing unwanted secondary mutations and enabling amplification of large plasmids up to 10 kb

44 Primers mutagénicos DpnI Stratagene

45 CASSETTE MUTAGÉNESIS

48 SECUENCIACIÓN DE ADN

49 SECUENCIACIÓN DE ADN Degradación química: Maxam y Gilbert Terminación de cadena: Sanger didesoxi

50 SECUENCIACIÓN DE ADN POR DEGRADACIÓN QUÍMICA- MAXAM Y GILBERT Corte específico de bases por reactivos químicos de una molécula de ADN marcada en el extremo y posterior electroforesis 1º se modifican las bases (G, G+A, C+T, C) y luego se incuban con piperidina caliente que rompe el enlace azúcar fosfato Ventajas. La secuencia se obtiene de la molécula original Se puede determinar la sec. muy cerca del extremo marcado (2 o 3 bases) Se puede determinar la sec. de ADN totalmente desconocido Desventajas Diferentes condiciones para cada reacción.+ lento y menos reproducible Sec. Más cortas

51 MÉTODO DE TERMINACIÓN DE LA CADENA: SANGER DIDESOXI Emplea a la ADN polimerasa para extender la hebra de ADN hasta que se termina por incorporación de un 2,3 -didesoxinucleótido (ddntp) Marcación de la hebra de ADN Extremo 5 : primer marcado con [γ- 32 P]ATP por T4 polinucleótido quinasa Hebra sintetizada: se usa un dntp radiactivo (en general 35 S) Extremo didesoxi. Cada didesoxi está marcado con un colorante fluorescente distinto. Para sec. automático.

52 AZT

55 Gel de secuencia

56 Video secuenciación

57 Secuenciación de ADN (automática en gel) a) Reacción de secuenciación b) Análisis de la reacción

59 Secuenciación de ADN (automática en capilar)

61 Video sec. automática

68 PRIMER WALKING

69 SHOT GUN Método para determinar secuencias de fragmentos de ADN muy grandes

Strand Sequence Origin First shotgun sequence Second shotgun sequence Reconstruction AGCATGCTGCAGTCATGCTTAGGCTA AGCATGCTGCAGTCATGCT-------------

70 Strand Sequence Origin First shotgun sequence Second shotgun sequence Reconstruction AGCATGCTGCAGTCATGCTTAGGCTA AGCATGCTGCAGTCATGCT TAGGCTA AGCATG CTGCAGTCATGCTTAGGCTA AGCATGCTGCAGTCATGCTTAGGCTA

73 Principio general de los diferentes sistemas de pirosecuenciación APS: adenosina fosfo sulfato Ronaghi M Genome Res. 2001;11: by Cold Spring Harbor Laboratory Press

76 PIROSECUENCIACIÓN Sample Input and Fragmentation Library Preparation

77 PCR One Fragment = One Bead empcr (Emulsion PCR) Amplification

78 PIROSECUENCIACIÓN APS:Adenosina fosfo sulfato Se agregan los dntps secuencialmente. Después de cada agregado se lava

79 Data Analysis

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