CA PROMEP Morfofisiología y Nutrición Animal Clave: UAQ-CA-38

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1 Efecto de componentes dietéticos antinutricionales y funcionales sobre la salud intestinal en dos modelos animales: ratas y lechones CA PROMEP Morfofisiología y Nutrición Animal Clave: UAQ-CA-38 Reporte metas 1 y 2 Este reporte corresponde a los trabajos realizados para cubrir las metas 1 y 2 Introducción La calidad de las pastas de oleaginosas como fuentes de proteína depende de diversos factores dentro de los que se encuentran: la variedad y el método empleado en su procesamiento. La pasta de soya es la más demandada entre las oleaginosas, sobre todo por su alto valor proteínico y su excelente perfil de aminoácidos. La pasta de soya se obtiene como un producto residual, del proceso de obtención del aceite, se caracteriza por su enorme cantidad de proteínas y minerales que se mantienen aún después del proceso. La pasta de soya presenta una gran cantidad de factores antinutricionales, entre los que se incluyen al inhibidor antitrípsico, lectinas, proteínas antigénicas como la glicinina y β-conglicinina (proteínas de reserva), el ácido fítico, taninos, entre otros. El ácido fítico es la principal fuente de almacenamiento de fósforo en los granos de cereales y oleaginosas como fuente de energía, minerales y antioxidantes para la semilla durante la germinación. El fósforo fítico tiene una muy baja disponibilidad, así como la de otros minerales como el Ca, Mg, Fe y Zn; de aminoácidos como la lisina, histidina y arginina; y carbohidratos (almidón) en los ingredientes de origen vegetal. El ácido fítico tiene un efecto limitante sobre la digestibilidad y pérdidas endógenas de minerales, proteínas y aminoácidos, e inhibe las enzimas proteolítica como la pepsina y la tripsina bajo condiciones gastrointestinales (Adeola y Sands, 2003). 1

2 Las proteínas antigénicas actuar como antígenos, causando alteraciones en la pared intestinal y reacciones inmunológicas, causando ciertas respuestas inflamatorias intestinales, produciendo daños en la mucosa intestinal que afectan a los procesos de digestión y absorción, presentándose diarrea, pérdidas de peso, disminución de la digestibilidad de la proteína y ocasionalmente muertes en lechones y terneros. En el caso particular de la soya, las globulinas glicinina y ß-conglicinina han sido implicadas en este fenómeno. Estas proteínas son resistentes al tratamiento térmico, siendo necesario altas temperaturas para afectar su antigenicidad, aunque esto produce un efecto negativo sobre la calidad de la proteína (L Hocine y Boye, 2007). Objetivo de la Meta 1 Analizar el contenido de los principales factores antinutricionales (lectinas, factor antitrípsico y proteínas antigénicas) en pastas de soya comerciales. Objetivo de la Meta 2 Estandarización del procedimiento para la obtención del extracto de proteína de pasta de soya (PPS) en calidad y cantidad suficiente para su empleo en los ensayos biológicos. Resultados Se evaluaron 14 muestras de pastas de soya empleadas en la elaboración de alimentos balanceadas en la zona del bajío. Las pastas se molieron a través de una malla de 0.5 mm y se secaron en una estufa de recirculación de aire forzado a 60 C para determinar su contenido de materia seca. Posteriormente se realizaron las determinaciones de proteína cruda por el método de Kjeldahl, cenizas y extracto etéreo (AOAC, 2002), energía bruta (Bateman, 1980) y fibra detergente neutro (Van Soest et al., 1991). En cuanto a los FAN se determinó la concentración de ácido fítico por colorimetría (Vaintraub y Lapteva, 1988) y Los resultados de la composición química de las PS se presentan en el Cuadro 1. Donde se observa que su composición es homogénea, ya que su desviación estándar es baja, a excepción del contenido de EE y FDN. El bajo contenido de EE se debe al método de extracción del aceite a la que fue sometida la semilla, el cual seguramente fue mediante solventes haciendo más eficiente su extracción. En general el contenido de FDN y EB está en función de la presencia o ausencia de cascarilla. El contenido de ácido fítico fue bastante constante entre las diferentes pastas de soya evaluadas, presentando valores un poco más elevados a los reportados de % (Gilani et al., 2012). Para el análisis de proteínas antiinutricias, lectinas e inhibidores de proteasas, se obtuvo el extracto crudo y protéico de acuerdo al método descrito por García-Gasca y col.,

3 Brevemente, el extracto de proteínas se realizó mezclando 100 g de harina desgrasada en 500 ml de agua desionizada, y se con agitación constante a 4º C durante 12 horas. El contenido de proteína fue de 2.07 g de proteína/g de pasta en base húmeda. El perfil electroforético de la fracción proteínica de la PS en SDS PAGE se muestra en la Figura 1. De un total de 922 g pasta se obtuvieron 27.9 g de liofilizado (0.03 g de liofolizado/g de pasta en base húmeda), cada gramo de liofilizado P70 contiene 0.52 g de proteína. Cuadro 1. Composición química de las pastas de soya Pasta de soya Materia seca, % ± 0.70 Proteína cruda (%N x 6.25), % ± 0.93 Cenizas, % 7.32 ± 0.35 Extracto etéreo, % 1.02 ± 0.23 FDN, % ± 2.44 Energía bruta, Kcal/Kg ± Ácido fítico, g fitato de 4.78 ± 0.27 sodio/100g Figura 1. Perfil electroforético de la fracción de la PS en SDS PAGE. Se observa en los diversos pozos, tratamientos. (M) Marcador de peso molecular, (1) muestra tratada con dilución 1:500 extracto crudo, (2) muestra tratada con dilución 1:500 P-40, (3) muestra tratada con dilución 1:500 P-70, (4) muestra tratada con dilución 1:500 extracto crudo, (5) muestra tratada con dilución 1:500 P-40, (6) muestra tratada con dilución 1:500 P-70. Se procedió a obtener el precipitado al 40% con sulfato de amonio, y el sobrenadante se llevó al 70% (P-70). Se determinó el contenido de lectinas de acuerdo al método de 3

4 diluciones dobles seriales utilizando eritrocitos humanos A + con un valor de 13,363 UA/g de pasta en base húmeda para el extracto crudo. Se determinó la afinidad de las lectinas de pasta soya por eritrocitos humanos, en donde se observó una mayor afinidad por los eritrocitos humanos O+ a diferencia de los de tipo A+, B+ y AB+, de acuerdo a la actividad aglutinante medida por número de pozo (Cuadro 2). No se detectó actividad de IPs Cuadro 2. Afinidad de las lectinas de soya a cierto grupo sanguíneo. Dilución de PS 100g/mL Eritrocitos A+ Eritrocitos B+ Eritrocitos O+ Eritrocitos 1:500 P AB+ (+++) Máxima aglutinación en el 6to pozo (++) media aglutinación en el 3er pozo (+) Mínima aglutinación en los primeros 2 pozos (--) Sin aglutinación El perfil de aminoácidos de la pasta de soya se realizó mediante HPLC. La extracción, separación y concentración de proteínas antigénicas (Liu et al., 2007). Para realizar la extracción de las proteínas antigénicas las pastas, ya molidas, se desgrasaron en frío con cloroformo:metanol (Folch XXXXX). Primeramente, la técnica de extracción de proteínas antigénicas fue implementada bajo las condiciones del laboratorio, con base en su solubilidad en agua y al pi de cada proteína (glicinina (globulina 11S) y ß-conglicinina (globulina 7S)). Las fracciones 7S y 11S extraídas se liofilizaron. Para realizar la separación de las subunidades de cada fracción proteica (β-conglicinina (7S) y glicinina (11S)) por medio de una electroforesis SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) (Laemmli, 1970) a una concentración de acrilamida de 12%, las muestras de cada fracción se desnaturalizaron con calor y se redujeron con mercaptoetanol para romper los enlaces disulfuro. Los geles se tiñeron con azul Coomassie R-250 y se digitalizaron mediante un fotodocumentador Bio-Rad para analizar los geles por medio del programa Imagen Lab de Bio-Rad para estimar el peso molecular (PM) y la concentración expresada como densidad y volumen en INT x mm 2 de cada subunidad de las fracciones 7S y 11S, comparando su movilidad electroforética con la de un estándar de PM de proteínas de amplio espectro. Para calcular la concentración de las fracciones se empleó una curva estándar de albúmina sérica. En el Cuadro 2 se muestra el perfil de aminoácidos de las pastas de soya Los pesos moleculares (PM) de las subunidades α, α y ß de la fracción ß-conglicinina (7S) y de las ácidas (A3 y A1A2A4) y básicas (B3 y B1B2B4) de la fracción glicinina (11S) de la pasta de soya se presentan en el Cuadro 3, donde se observa una buena homogeneidad entre los PM entre las pastas de soya evaluadas. 4

5 Cuadro 2. Perfil de aminoácidos de las pastas de soya Aminoácidos % Aminoácidos esenciales Arginina 3.50 ± 0.65 Histidina 1.61 ± 0.14 Isoleucina 2.01 ± 0.19 Leucina 3.58 ± 0.38 Lisina 3.24 ± 0.35 Met Fenilalanina 2.63 ± 0.27 Treonina 1.89 ± 0.18 Valina 2.03 ± 0.20 Aminoácidos no esenciales Alanina 1.94 ± 0.19 Ácido aspártico 4.73 ± 0.53 Cistina 0.71 ± 0.18 Ácido glutámico 7.08 ± 0.74 Glicina 1.84 ± 0.19 Prolina 2.46 ± 0.40 Serina 2.31 ± 0.24 Tirosina 1.89 ± 0.16 Cuadro 3. Peso molecular de subunidades de β-conglicinina (7S) y glicinina (11S) Subunidades de β- conglicinina (7S) Subunidades de glicinina (11S) Peso molecular (kda) α α ß 88.6 ± ± ± 1.2 A3 A1, A2, A4 Btotales 34.1 ± ± ± 0.5 Otros autores han publicado los pesos moleculares de las subunidades de la β- conglicinina: α (80-93 kda), α ( kda) y β (48 55 kda); y de la glicinina: la ácida ( kda) y la básica ( kda). El perfil electroforético SDS-PAGE de las fracciones de ß-conglicinina (7S) y glicinina (11S) se presenta en las Figuras 1 y 2a y 2b. Donde se observa que la fracción extraída de ß- conglicinina (7S) mostró bien definidas sus subunidades α, α y ß, sin embargo, se 5

6 Intensidad Intensidad Intensidad presentó contaminación de las subunidades de glicinina (11S) (Figura 1). La fracción extraída de glicinina (11S) presentó bien definidas sus subunidades ácidas A3 y A1A2A4, y básicas totales (B1B2B3B4). En esta fracción se presentó contaminación con las subunidades de ß-conglicinina (7S) en un 35.7% de las pastas y el 64.3% solo presentó contaminación por la subunidad ß (Figura 2ª y 2b). Estas contaminaciones han sido observadas por otros autores (Liu et al., 2007). ß-conglicinina (7S) Glicinina (11S) A 1,A 2, A 4 B 1,B 2,B 3,B α α ß A 3 PM, kda Figura. 1. Perfil electroforético SDS-PAGE de las fracciones de ß-conglicinina a ß-conglicinina Glicinina (11S) A 1,A 2,A 4 b A 1,A 2,A 4 Glicinina (11S) ß-conglicinina (7S) ß A 3 PM, kda A 3 B 1,B 2, B 3,B 4 PM, kda Figura. 2. Perfil electroforético SDS-PAGE de las fracciones de glicinia extraídas de pastas de soya con poca contaminación (a) y con contaminación de ß-conglicinina (b) α α ß B 1,B 2,B 3,B Conclusiones La composición química, la concentración de ácido fítico y el perfil electroforético de las fracciones de proteínas alergénicas, ß-conglicinina (7S) y glicinina (11S), mostraron pocos cambios entre las pastas de soya evaluadas. La técnica de extracción de las proteínas alergénicas de la pasta de soya mostró buenos resultados en ambas proteínas, y con poca contaminación en el caso de la glicinina. Es importante determinar y cuantificar la 6

7 presencia de compuestos alergénicos de las pastas de soya comerciales, ya que estas proteínas (ß-conglicinina y glicinina) reducen las vellosidades intestinales disminuyendo la digestibilidad de las proteínas en lechones que consumen niveles alto de pasta de soya. No se detectaron inhibidores de tripsina sin embargo, se detectó cantidad importante de lectinas en la pasta de soya. Referencias Adeola O and Sands JS Does supplemental dietary microbial phytase improve amino acid utilization? A perspective that it does not. Journal of Animal Science 81, E AOAC Official Methods of Analysis, 17th ed. Association of Official Analytical Chemists, Arlington, VA. Folch J, Lee M and Stanley SGH A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. Journal of Biological Chemistry 226, García-Gasca T., García-Cruz M., Hernandez-Rivera E., López-Matínez J., Castañeda-Cuevas A. L.,Yllescas-Gasca L, Rodríguez-Méndez A. J., Mendiola-Olaya E., Castro-Guillén J. L. y Blanco-Labra A Effects of Tepary Bean (Phaseolus acutifolius) Protease Inhibitor and Semipure Lectin Fractions on Cancer Cells. Nutrition and Cancer, 64(8), Gilani GS, Xiao CW and Cockell KA Impact of antinutritional factors in food proteins on the digestibility of protein and the bioavailability of amino acids and on protein quality. British Journal of Nutrition 108, S315 S332. Laemmli HK Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature 227, L Hocine L and Boye JI Allergenicity of soybean: New developments in identification of allergenic proteins, cross-reactivities and hypoallergenization technologies. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 47, Liu Ch, Wang H, Cui Z, et al Optimization of extraction and isolation for 11S and 7S globulins of soybean seed storage protein. Food Chemistry 102,

8 Vaintraub IA and Lapteva NA Colorimetric determination of phytate in unpurified extracts of seeds and the products of their processing. Analytic Biochemistry 15, Van Soest PJ, Robertson J and Lewis BA Methods for dietary fiber neutral detergent fiber and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition. Journal of Dairy Science 74,