INSTITUTO DE MEDICINA LEGAL Y CIENCIAS FORENSES ANÁLISIS BIOMOLECULAR

de 14 GUIA DE PROCEDIMIENTOS DEL LABORATORIO DE ANÁLISIS BIOMOLECULAR PARA LA DETECCIÓN DE HEMOGLOBINA A EN FLUIDO SANGUINEO Y DETECCIÓN DE ANTÍGENO PROSTÁTICO ESPECÍFICO EN LÍQUIDO SEMINAL

de 14 ÍNDICE 1. OBJETIVO 3 2. ALCANCE 3 3. DEFINICIONES 3 4. REFERENCIAS 4 5. DIAGRAMA DE FLUJO 5 6. RESPONSABILIDAD 8 7. DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO 9 7.1 RECIBO DE INDICIOS 9 7.2 ANÁLISIS 9 7.2.1 Protocolo para Detección de Sangre Humana 9 7.2.2 Protocolo para Detección de Líquido Seminal 11 7.3 RESULTADOS 13 8. FORMULARIO 14 8.1 HOJA DE TRABAJO PARA DETECCIÓN DE FLUIDO SANGUÍNEO: 14 8.2 HOJA DE TRABAJO PARA DETECCIÓN DE LÍQUIDO SEMINAL: 14

de 14 1. OBJETIVO Establecer y describir la metodología aplicada, por los Especialistas del Laboratorio de Análisis Biomolecular, para la Detección de Hemoglobina A (HbA0) en fluido sanguíneo y Detección de Antígeno Prostático específico (PSA) en líquido seminal, previa solicitud del Agente del Ministerio Público. 2. ALCANCE Este procedimiento es de aplicación para todos los peritos del Laboratorio de Análisis Biomolecular de la Agencia de Veraguas del Instituto de Medicina Legal y Ciencias Forenses. 3. DEFINICIONES Fluido Sanguíneo: Fluido biológico que es producido en la médula ósea, y contiene células como glóbulos rojos, glóbulos blancos, plaquetas y biomoléculas como proteínas. Hemoglobina A: Proteína que se encuentra dentro de los glóbulos rojos del fluido sanguíneo y se utiliza como sustrato para la determinación de sangre. Inmunocromatografía: Ensayo en donde se pone a reaccionar sobre una membrana absorbente, proteínas de la muestra en estudio con anticuerpos específicos marcados con un tinte para observar la reacción en el caso que este presente la proteína en la muestra estudiada. Prueba de Serología Forense: identificación y evaluación de evidencia biológica mediante tecnologías que utilizan anticuerpos para la detección de antígenos. Prueba de Verde de Leucomalaquita: Prueba química que se utiliza para determinar la presencia de grupo Heme de la hemoglobina. Reacción de Inmunocromatografía: Para confirmar la presencia de sangre humana. Consiste en la reacción de la hemoglobina humana (proteína HBA0) presente en la

de 14 muestra y el reactivo que contiene anticuerpos específicos (anti-hba0) marcados con partículas de color azul que forman un inmunocomplejo que migra sobre un papel de cromatografía, donde es capturado e inmovilizado por un segundo anticuerpo dirigido contra la hemoglobina humana, formando una línea azul en la prueba, lo que indica un resultado positivo. Prueba de Quimioluminiscencia: Reacción química que consiste en la detección de hemoglobina, a través de la generación de luz en forma de energía electromagnética con longitud de onda aproximada de 425 nm. Espectros de Luz: Fuente de ondas electromagnéticas de mediana energía, que provoca la excitación de los átomos de las sustancias biológicas. Fluido Seminal: Fluido biológico que es producido luego de la eyaculación, contiene biomoléculas como proteínas, y células espermáticas. Fosfatasa ácida prostática: Proteína que forma parte del fluido seminal, su detección se utiliza para determinar la presencia de fluido seminal en prueba química de tamizaje. Kit comercial: conjunto de reactivos preparados para la realización de un análisis y suministrados por una empresa acreditada que los fabrica bajo estrictas normas de calidad. PSA: Proteína producida por la glándula prostática y expulsada junto al fluido seminal luego de la eyaculación, es conocida como P-30, debido a su tamaño molecular de 30,000 Dalton. 4. REFERENCIAS Ley 50 de 13 de diciembre del 2006, por la cual se reorganiza el Instituto de Medicina Legal y Ciencias Forenses. G.O. No. 25692 de 15 de diciembre de 2006. Ley 69 de 27 de diciembre de 2007, por cual se crea la Dirección de Investigación Judicial en la Policía Nacional y se adscriben los servicios de Criminalística al Instituto de Medicina Legal y Ciencias Forenses y se dictan otras disposiciones. G.O. No. 26949 de 28 de diciembre de 2007.

de 14 Ley No. 63 de 28 de agosto de 2008, que adopta el Código Procesal Penal. G.O. No. 26114 de 29 de agosto de 2008 y sus modificaciones. Resolución No JD-05 de 22 de abril de 2009 Que adopta la estructura organizativa del Instituto de Medicina Legal y Ciencias Forenses. Resolución No JD-009-11 de 30 de marzo de 2011, que adopta el Manual de Procedimiento del Sistema de Cadena de Custodia. G.O. No. 27052 de 8 de junio de 2012. Protocolo de Utilización de Placas Detección de HbA0 en Manchas secas de uso forense, Hexagon Obti, Bluestar Forensic. Protocolo de Utilización de Placas Detección de P-30 en Manchas secas de uso forense, Standard Diagnostic. Instructivo de Operación y Mantenimiento de la Fuente de Luz Mini-CrimeScope Modelo MCS-400W, JOBIN YVON / SPEX, U.S.A. Johnson, S., et al (2003). Validation study of the Abacus Diagnostics ABAcard Hema Trace membrane test for the forensic odentification of human bood. Canadian Society of Forensic Science Journal, 36(3), 173-183. Schweers, B.A., et al. (2008). Develpmental validation of a novel lateral flow strip test for rapid identification of. Human blood (Rapid Stain Identifiaction TM -Blood). Forensic Science International: Genetics, 2, 243-247. Simich, J.P., et al. (1999). Validation of the use of a commercially available kit for the identification of prostate spe-cific antigen (PSA) in semen satins. Journal of Forensic Sciences, 44, 1229-1231. Van Oorschot, R.A.H., et al. (2009). Impact of relevant variables on the transfer of biological substances. Forensic. Science International: Genetics Supplement Series, 2, 547-548. 5. DIAGRAMA DE FLUJO A continuación se muestra el diagrama de flujo para el procedimiento de Análisis Biomolecular.

de 14 Jefe de Sección o Encargado Perito de Análisis Biomolecular Documentos Inicio 1. Recibir Solicitud de Análisis Registro de Solicitud Resultados Análisis Recibo de Indicios 6. Asignar Perito 2. Recibir Cadena de Custodia 3. Cumple? Si 5. Registrar Cadena de Custodia 7. Realizar Análisis de Indicios 8. Confeccionar Informe Pericial 9. Enviar Informe a la Autoridad No 4. Rechazar Cadena de Custodia Formato de Rechazo Registro de Cadena de Custodia Informe Pericial Fin

de 14 6. RESPONSABILIDAD Paso Entrada Actividad Responsabilidad Salida Documento, Recursos Etapas del Proceso JAB* PAB* Documento 1 Recibir Solicitud de Análisis E Registro de Solicitud 2 Recibir Cadena de Custodia E 3 Comprobar si la cadena de custodia cumple con el manual? D 4 Rechazar Cadena de Custodia E 5 Registrar Cadena de Custodia E Formato de Rechazo Registro de Cadena de Custodia 6 Asignar Perito E 7 Realizar Análisis de Indicios E 8 Confeccionar Informe Pericial E 9 Enviar Informe a la Autoridad E (**)Responsabilidad (Siglas) D= Decide E= Ejecuta P= Participa I= Es informado * (Siglas definidas en Abreviaturas) JAB= Jefe de Análisis Biomolecular PAB= Perito de Análisis Biomolecular

de 14 7. DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO 7.1 RECIBO DE INDICIOS El Jefe del Laboratorio o el Encargado, recibe la solicitud del Ministerio Público por escrito o por cualquier medio tecnológico. De igual forma, la secretaria del laboratorio verificará las solicitudes remitidas, con el objetivo de comunicárselo al Jefe o Encargado, y de llevar el registro interno de dichas solicitudes. El perito encargado del área de recibo del laboratorio, recibirá la cadena de custodia y verificará, si cumple con los requisitos establecidos en el Manual de Procedimientos del Sistema de Cadena de Custodia, y la secretaria se encargará de registrar en un control interno del laboratorio la misma. En caso que la Cadena de Custodia no cumpla con los requisitos establecidos en el Manual, confeccionará el formato de rechazo y la devolverá al funcionario que se la entregó, o la remitirá al Almacén Transitorio del Instituto. El jefe de la Sección o encargado, asigna el perito que será el responsable de llevar a cabo el peritaje o asignación. 7.2 ANÁLISIS En el Laboratorio se realizan las pericias de acuerdo a los siguientes protocolos: 7.2.1 Protocolo para Detección de Sangre Humana 1) Se solicita la evidencia asignada, al almacén del laboratorio, a través del formulario de salida de indicio. 2) Se abre el indicio sobre la mesa de trabajo y se verifica las características del mismo junto con la descripción de la cadena de custodia digitalizada. 3) Se registra el caso y los hallazgos en el formato de Hoja de Trabajo. 4) Se realiza una fijación de la evidencia con testigo métrico, en fotografía digital

de 14 5) Se realiza una observación con luz blanca para ubicar posibles patrones de manchas. 6) Si se observa manchas, se describe la forma y características de las mismas, y se delimita el área con marcador permanente y se fija con fotografía digital. 7) Se realiza una transferencia del posible fluido sanguíneo de la superficie de las evidencias hacia un hisopo humedecido en solución salina o agua destilada, sobre el cual se le añada de 2 gotas de reactivo de Verde de Leucomalaquita y 2 gotas de peróxido de Hidrógeno al 3%. De resultar negativa no se procede con dicha mancha. 8) De resultar positiva, se realiza un corte del área y se introduce una muestra en un microtubo de 1.5 ml y se añade 100 ul de solución salina estéril, se deja reposar por 10 a 20 minutos, luego se hace agitar con Vortex. 9) Si no se observa manchas y se sospecha que la evidencias este alterada o lavada, se rosea sobre la superficie, reactivo de quimioluminiscencia (Bluestar Forensic), para resaltar las áreas que contenga hemoglobina, se delimita el área y se registra en fotografía digital. 10) Se realiza un corte del área en donde se ubico la mancha de sangre, Inserte el corte de la muestra en el tubo de recogida de muestras que contienen el químico de extracción, se agita la muestra por inversión del tubo entre 5 a 10 veces. 11) Se verifica que la placa de reacción de Hemoglobina Humana esté vigente y se anota su número de lote y fecha de expiración. 12) Se añade 4 gotas de la muestra en el pocillo de la placa, se realiza la lectura de resultados entre 5 a 10 minutos.

de 14 Interpretación del Resultado: NEGATIVO: No hemoglobina o nivel de proteína por debajo de 50ng/ml de hemoglobina que es el límite de detección del kit. No aparece la Línea 1 (RESULTADO), la más próxima a la ventana circular debajo de la T que aparece en el kit. El correcto funcionamiento del test lo indica la aparición de la línea 3 (CONTROL), la más alejada de la ventana circular, debajo de la C que aparece en el kit. La línea 2 (INTERNAL ESTÁNDAR) siempre debe aparecer. Causas que provoquen resultado negativo en líquido seminal: (1) Inhibición por exceso de muestra (2) Dilución excesiva de la muestra. POSITIVO: Presencia de hemoglobina humana Aparecen línea 1 (RESULTADO) y línea 3 (CONTROL): Presencia de hemoglobina en la muestra problema. INVÁLIDO: No aparece la Línea 3 (CONTROL). 13) Se reporta los hallazgos en la hoja de trabajo, y se confecciona el informe pericial por el perito que realizó el análisis. 14) En el caso que resulto positiva la evidencia por presencia de Sangre Humana, a solicitud de la autoridad, se remitirá muestra al Laboratorio de Análisis Biomolecular en Panamá para cotejo por ADN. En el caso de resultar negativa, no se almacena muestra alguna. 15) Las evidencias analizadas se remiten junto al informe pericial, al almacén transitorio de evidencias para su remisión posterior a la autoridad. 7.2.2 Protocolo para Detección de Líquido Seminal 1) Se solicita la evidencia asignada, al almacén transitorio de indicios, a través del formulario de salida de indicio. 2) Se abre el indicio sobre la mesa de trabajo y se verifica las características del mismo junto con la descripción de la cadena de custodia digitalizada. 3) Se registra el caso y los hallazgos en el formato de Hoja de Trabajo.

de 14 4) Se realiza una fijación de la evidencia con testigo métrico, en fotografía digital 5) Se realiza una observación con luz blanca para ubicar posibles manchas. 6) Si se observa manchas, se delimita el área con marcador permanente y se fija con fotografía digital. 7) Se realiza una observación con la Fuente de Luz Mini-CrimeScope MCS-400W. 8) Si se observa manchas, se delimita con marcador fluorescente y se realiza una fijación con fotografía digital utilizando un filtro naranja en el lente de la cámara. 9) Se realiza una transferencia del posible fluido seminal de la superficie de las evidencias hacia un papel absorbente, sobre el cual se le añada de 2 a 5 gotas de reactivo de Fosfatasa Acida. De resultar negativa no se procede con dicha mancha. 10) De resultar positiva, se realiza un corte del área y se introduce una muestra en un microtubo de 1.5 ml y se añade 100 μl de solución salina estéril, se deja reposar por 10 a 20 minutos, luego se hace agitar con Vortex. 11) Se toma una muestra aproximada de 6 μl y se coloca sobre una lámina de vidrio, se extiende sobre la lámina y se deja secar a sobre un plato caliente. 12) Luego se tiñe con la tinción FAST-RED- ÍNDIGO CARMÍN (tiñe los espermatozoides de rojo mientras que las otras células de verde), se sumerge la laminilla en 12,5 g de Sulfato de Aluminio, 0,25 g de Nuclear Fast-red (para 500 ml de agua), durante 15 minutos, lavar con agua. Luego sumergir durante unos 30 segundos en (Ác. Pícrico 1,3 g, Índigo- Carmín 0,33 g en 100 ml de agua) y luego lavar con Etanol. Se Cubre con un cubre objeto y se observa al microscopio. 13) Se toma 5 gotas (aproximadamente 200 μl) de muestra y se añade en el pocillo de la prueba de Inmunocromatografía para P-30 (ventana circular pequeña) con el gotero que viene en el kit. 14) Esperar 10 minutos. Para ver el resultado. Interpretación del Resultado: NEGATIVO: No PSA o nivel de PSA por debajo de 2 ng/ml No aparece la Línea 1 (RESULTADO), la más próxima a la ventana circular debajo de la T que aparece en el kit. El correcto funcionamiento del test lo indica la aparición de la línea 3 (CONTROL), la más alejada de la ventana circular, debajo

de 14 de la C que aparece en el kit. La línea 2 (INTERNAL ESTÁNDAR) siempre debe aparecer. Causas que provocan resultado negativo en líquido seminal: (3) Inhibición por exceso de muestra (para líquido seminal e recomienda dilución 1:100). (4) Dilución excesiva de la muestra. POSITIVO: Presencia de PSA. Aparecen línea 1 (RESULTADO) y línea 3 (CONTROL): Presencia de líquido seminal en la muestra problema. INVÁLIDO: No aparece la Línea 3 (CONTROL). 15) Se reporta los hallazgos en la hoja de trabajo, y se confecciona el informe pericial por el perito que realizó el análisis. 16) En el caso que resultó positiva la evidencia por presencia de fluido seminal, a solicitud de la autoridad, se remitirá muestra al Laboratorio de Análisis Biomolecular en Panamá para cotejo por ADN. En el caso de resultar negativa, no se almacena muestra alguna. 17) Las evidencias analizadas se remiten junto al informe pericial, al almacén transitorio de evidencias para su remisión posterior a la autoridad. 7.3 RESULTADOS Una vez realizada la pericia, el perito asignado al caso confeccionará el informe pericial, detallando los resultados obtenidos en la experticia. Para la elaboración del informe el perito debe, tomar en cuenta los parámetros establecidos en el artículo 411 del Código Procesal Penal. El jefe inmediato o encargado del laboratorio, revisa el informe pericial verificando que cumpla con el procedimiento requerido, para la pericia solicitada. En caso que el jefe realice observaciones al Informe Pericial, el perito asignado al caso es el responsable de corregirlo.

de 14 Cuando el Informe Pericial este correcto, el perito confecciona la nota remisoria para que el jefe de la sección la firme, y luego el perito envía los resultados de la experticia al agente del Ministerio Publico. 8. FORMULARIO 8.1 HOJA DE TRABAJO PARA DETECCIÓN DE FLUIDO SANGUÍNEO: Documento en donde se describe detalles del caso analizado, tipo de reactivo utilizado, la garantía de calidad (lote, fecha de expiración), resultados de los ensayos, observaciones y hallazgos descritos por el perito. 8.2 HOJA DE TRABAJO PARA DETECCIÓN DE LÍQUIDO SEMINAL: Documento en donde se describe detalles del caso analizado, tipo de reactivo utilizado, la garantía de calidad (lote, fecha de expiración), resultados de los ensayos, observaciones y hallazgos descritos por el perito.