Rev. Dil. Trp., 40 (1): 95-99, 1992 Valres hernatlógics y de enzimas séricas en caballs inculads cn venens de serpientes para la prducción de antivenens en Csta Rica Ricard Estrada, Fernand Chaves, Abel Rbles, Ermila Rjas, Eduard Segura y Jsé María Gutiérrez Institut Cldmir Picad, Facultad de Micrbilgía, Universidad de Csta Rica, Csta Rica. (Rec. 18-IV-1991. Acep. 4-X-I991) Abstrad: Dld cmpnents were studied in six hrses irnmunized with make venms fr the prducli. f plyva lent antivenm in Csta Rica. N significant chánges in hemglbin r hematcrit thrughut the irnmunizati. pe rid \Vere bserved, whereas a significant increment in ttal serum prteins ccurred in the sec.d half f the irnmu nizatin prcess, prbably due t an increased synthesis C irnmwlglbulins. There were n significant changes in crealine kinase, bula slight incremenlwas detected in bth transaminases, althugh they did nlexceed nrmallimits. These findings suggeslthe absence f relevanllissue damage in ske1etal musc1e, cardiac musc1e and liver. In agree menlwith these results, hrses did nl develp signs f systemic pisning, presenling 1y minr alterati.s al the site l venm injeclin, sum as edema, abscesses and fistules. The develpment l anti-phsphlipase. A2 anlibdy resps e shwed a prminent individual variability, as previusly described. Key wrds: hrse-venm-snake-irnmunizatin-enzymes-haematlgy. La prduccióp de antivenens se basa en la inmunización de equins, entre trs animales, cn venens (Latifi 1978). Dependiend del ti p de venen y del esquema de inculacines emplead, este prces de inmunización puede causar alteracines fisipatlógicas en ls ca (TP). Simultáneamente se estudiarn ls cambis clínics y la respuesta de anticuerps anti-fsflipasa A2 cm un índice del de sarr ll de la respuesta inmunlógica en ests caba balls, las cuales han sid pc estudiadas. En el cas del antivenen plivalente prdu cid en Csta Rica, ls caballs sn inculads cn una mezcla de venens de las especies MATERIAL y MElS Bthrps asper, Lachesis muta y Crtalus du rissus durissus (Blafis y Cerdas 1980). Ests venens cntienen txinas capaces de prducir lesines tisulares lcales y sistémicas, así cm alteracines hematlógicas (Gutiérrez 1980, Gutiérrez et al. 1982, 1984, Chaves e t al. 1989). En el presente trabaj se investigó un grup de caballs inmunizads pr primera vez y se evaluarn ls cambis en hematcrit, hem glbina, prteínas séricas ttales, así cm en ls niveles sérics de las enzimas creatina kina sa (CK), transaminasa glutámic-xalacética (TG) y transaminasa glutámic-pirúvica lls. Se utilizarn seis equins adults (3 a 9 afis), clínicamente sans, machs y hembras, raza crilla, entre 400 y 500 Kg. Y que nunca habían sid inculads cn venen. Antes de la inmunización, se les smetió a un períd de tres meses de adaptación a la finca, alimentán dls cn past de crta (Pennisetum purpu reum), past Estrella (Cyndn nlenfluencis), hen de Pangla (Vigitaria decumbens) y una mezcla de aliment balancead en plv. En este tiemp se integrarn a un prgrama de cntrl de enfermedades infecttransmisibles y de ect- y endparásits. El esquema de inmunización cmprende d sis crecientes de la mezcla de venens, admi nistrándse cada diez días (Cuadr 1).
REVISTA DE BILGIA TRPICAL CUADR 1 Esqwma de imlwiización utilizad para la prducción del swr amifjic plivalente Días sdev * 0.5 1.0 1.5 3.0 5.0 10.0 15.0 30.0 30.0 1 15 25 35 45 55 65 1S 90 100 S. ** Cadyuvante Freund Cmplet Alginatde sdi Freund Incmplet * Mezcla. de partes iguales de lsv sde B. asper, c. dwissus durwus y L. muta. ha lgrad el títul adecuad se repite esta d sis hasta alcanzarl.... Si 00 se Para establecer el valr basal para cada ani mal. se tmarn muestras de sangre cn antic agulante (Citrat de Sdi) y sin anticagulante (para btener el suer) qui e dias antes de ini ciar las inculacines cn venen, cn interva ls de una semana. Para la determinación de ls valres enzimátics se tmarn las muestras de sangre sin anticagulante 24 hras después de ls in6culs, se separó el suer y se determina rn tds ls valres enzimátics en las si guientes 24 hras, manteniend el suer en re frigeración a 4 "C. La determinación de enzi mas séricas se realizó cn el us de reactivs Sigma (Sigma Chemical C., Missuri, USA): CK (Kit 520; una unidad es prduct de la fs frilación de un nanml de creatina pr minu t a 25 C ), TGP (Kit 59UV; una unidad es prduct de la frmación de un micrml de NAD pr minut) y T (Kit 58UV; una uni dad es prduct de la frmación de un micr ml de NAD pr minut). La cncentración de prteínas séricas ttales se determinó pr el métd mdificad de. Biuret. usand cm patrón albúmina sérica bvina (Schsinsky el al. 1983). El hematcnt se determinó usand capilares heparinizads (Sáenz el al. 1981) Y la medición de la hem glbina se realizó pr el métd de cianmeta hemglbina (Sáenz el al. 1981). Ls valres estadístics se refieren a la t de Student. Para determinar el efect neutralizante del suer, se sangrarn ls caballs de la vena yugu lar. inmediatamente antes de cada inculación y se separó el suer. Se estudió la neutralización del efect hemlític indirect del venen de B. asper, mediante la técnica de he.mólisis ra dial en geles de agarsa (Gutiérrez et al. 1988). La Dsis Efectiva 50% se defmió cm la ra zón J.!.l de suer/mg de venen en que la activi dad hemlítica se reduj en un 50%. Para ma yr claridad gráfica. la capacidad neutralizante se expresa cm 1/DE50 x ls. RESULTADS Cambis en ls niveles de enzimas séri cas: En relación a la TGP se bservó un peque ñ per significativ (p < 0,05) aument des pués de la dsis de 1.5 mg. de venen (Fig. 1), manteniéndse valres cnsiantes hasta la se gunda dsis de refuerz de 50 mg. Sla'mente en la última dsis se di un valr superir al ámbit nrmal (Fraser 1988, Bld et al. 1979, Hward y Matsumt 1982). Se bservó un aument significativ de TG (p < 0,05) cn respect al valr basal, en tre ls días 14-98, así cm el día 202 de la in munización (Fig. 1), en tant que ls inculs del interval c mprendid entre ls días 105-191 n prdujern elevacines significati vamente diferentes (Fig.l). Sin embarg, a pe sar de que se bservarn diferencias significati vas (entre ls días 14-98 y el día 202), ningún valr btenid está fuera del ámbit nrm al (Fraser 1988, Bld el al. 1979, Hward y Matsumt 1982). Ningún valr de CK sufrió un aument sig nificativ cn respect al valr basal (Fig. 1). Además, en ningún punt fue superad el índi ce superir nrmal (Fraser 1988, Bld e l al. 1979). Cambis en ls valres hematlógics: Ls valres de hematcrit (29-36%) presenta rn niveles inferires a ls ámbits nrmales (Bld el al. 1979, Klb 1979, Hward y Matsumt 1982). Ests bajs valres se bser varn inclus antes de iniciarse el esquema de inculacine. N hub cambis significativs en el hematcrit durante la inmunización. Ls niveles de hemglbina n mstrarn fluctuacines significativas; sus valres siem pre estuviern dentr de ámbits nrmales (Klb 1979, Hward y Matsumt 1982, Bld el al 1979).
ESTRADA,t al.: Biquímica wtguúlea en cabalia 97 T G T G p 250 200 150 100 50 50 40 30 20 10-50 50 100 150 200 250 día 191 (ese día ls valres de la expresión I/DEs x ls fuern: 84, l, 61, 300, 114 y 38; prmedi: 116; DS : 94). Alteracines clínicas: Las lesines lcales apareciern cn marcadas diferencias individuales en tiemp y gravedad; en general, el edema se bservó en cinc caballs el día 14 del esquema de inmunización; el sext caball desarrlló un edema hasta el día 112. Tds presentarn abscess y l fístulas entre ls días 105-202 del esquema de inmunización. En ningún cas se bservarn alteracines sistémicas cm sangrads menres síndrmes hemrrágics, deshidratación, hiptensión chque. -50 35 50 100 150 200 250 DISCUSIN 30 25 20 e K 15 10 Ó -60 50 100 160 200 250 TIEMP (EllAS) Fi. 1. Cambis en ls niveles sérics de TP. T y CK de 6 caballs durante el esquema de inmunización pal'll la prducción del suer antifídic plivalente. La actividad enzimática de.tgp y T se expresa en Unidades/litr, en tant la actividad enzimática de CK se expresa en Uhnl. La resultads se presentan cm prmedi ± desviaci6n estándai. Slamente ls valres cn asterisc (*) fuern significativamente superires (p < 0,05) a ls valres basales de ls caballs antes de iniciar la inmunización. Ls valres de prteínas ttales se mantuviern dentr de l nrmal, aunque bservams un índice superir levemente mayr (6.93-9.37 g/di). N existió diferencia significativa en ls valres bservads entre ls días 1-58, en tant que en el interval cmprendid entre ls días 58-200 hub un aument significativ (p < 0,05) cn respect a ls valres basales. Desarrll de la respuesta de anticuerps anti-fsflipasa A2: Se bservó una gran variabilidad individual en el desarrll del títul de anticuerps anti-fsflipasa Az. Tds ls caballs lgrarn su mayr títul alrededr del La tma de muestras de sangre para el estudi de las alteracines de las enzimas séricas se realizó 24 hras después de ls ióculs, cnsiderand que ls venens inculads van disuelts en adyuvantes que permiten una liberación lenta del antígen. Pr tra parte, hems bservad que en alguns caballs que han presentad signs psterires a la inculación, ésts han aparecid entre 12-36 hras después de la inyección de la mezcla antigénica. La determinación de enzimas séricas cm TGP ayuda a diagnsticar lesión hepática, pues esta enzima está presente en el hígad encantidades much mayres (Klb 1979). De acuerd a l bservad en este trabaj, n curre lesión en tejid hepátic durante esta primera fase de inmunización, aunque,n se descarta la psibilidad de que ésta curra en un plaz mayr que el de este estudi. cm efect de inculacines crónicas de venen. La TG es un indicadr del dañ en tejid muscular, aunque un aument en ésta puede indicar tant un dañ muscular cm hepátic, pr l que su especificidad y cnfiabilidad es much menr que para la CK (Klb 1979). El hech de que la TG n superara ls valres nrmales sugiere la ausencia de lesión tisular en hígad, micardi y múscul esquelétic. La actividad de la CK es la técnica de labratri más cmúnmente usada en el diagnóstic de distrfias musculares y de infart de micardi, ya que es altamente específica para
98 REVISTA DE BILGIA TRPICAL detectar dafi de múscul esquelétic y cardía c (Bld el al. 1979). Debid a las bserva cines anterires sbre las enzimas CK y TG, y cnsiderand ests resultads, se CI1cluye que el dad muscular y cardíac induci d pr estas dsis de venen inculad es muy leve inexistente. Ls cambis detectads en hematcrit y hemglbina fuern realmente muy leves, y aunque el hematcrit se detectó en niveles menres a ls ámbits nrmales, pueden cnsi derarse aceptables para el caball crill que usams y para equins prductres de antive nens. Además, ests niveles bajs estaban ya presentes en ls caballs previamente a la in culación del venen. La aparición de valres de prteínas ttales mayres a ls infrmads pr varis autres (BId el al. 1979, Klb 1979, Hward y Matsumt 1982), se pdría explicar pr el au ment de la síntesis de inmunglbulinas, s bre td después del día 58, cuand empezó a aumentar el nivel de anticuerps anti-fsflipa sa A2 Hallazgs similares fuern descrits pr Estrada et al. (l991), en dnde se describió un aument en las prteínas ttales y una inver sión en la relación albúmina:glbulina en el curs de la inmunización. El tip y tiemp de aparición de las lesines lcales sn generalmente similares a ls bser vads en tras experiencias realizadas en este institut (Estrada el al. 1989) y sn cngruentes cn la descripción de ls efects lcales induci ds prbablemente pr varias txinas de ls ve nens que prducen edema, hemrragia y ne crsis del tejid adyacente al siti de incula ción (Gutiérrez et al. 1982, 1984). RESUMEN Se estudiarn alguns cmpnentes sanguí nes en un grup de seis caballs inmunizads pr primera vez cn venens de serpientes para la prducción de suer antifídic plivalente en Csta Rica. N hub cambis significativs en ls valres de hematcrit y hemglbina, aunque las prteínas ttales sufriern un peque ñ per significativ aument en la segunda mitad del esquema de inmunización, prbable mente relacinad cn un aument en la pr ducción de glbulmas. N hub cambis signi ficativs en ls niveles de CK, mientras que las enzimas TG y TGP aumentarn levemente, sin sbrepasar el límíte superir nrmal. Ests resultads sugieren la ausencia de lesines tisu lares imprtantes en múscul esquelétic, mús cul cardíac e hígad. Ls caballs presentan únicamente altera cines lcales en el siti de inculación del ve nen, caracterizadas pr edema, abscess y fís tulas. N se bservó ningún tip de alteración sistémica.se bservó una gran variabilidad in dividual en el desarrll de la respuesta de anti cuerps anti-fsflipasaa2. REFERENCIAS Arry,., R. Blañs & G. Muñz. 1980. The bacterial flra f venms and muth caviúes f Csta Rican sna kes.bull. Pan. Health rg. 14: 280-285. Bld, D.C., J. A. Hendersn &.M. Radstits. 1979. Veterinary Medicine. 5th. editin. Lea.& Febiger. U.SA p. 205, 227,329, 896-897. Blañs, R. & L. Cerdas. 1980. Prducción y cntrl de suers antifídics en Csta Rica. Bl. fic. Panam. 88: 189-196. AGRADECIMIENTS Ls autres agradecen a Bernard Angul, Alfred Vargas y RdrigSánchez (Institut C. Picad) su clabración. Este trabaj fue fi nanciad pr la Vicerrectría de Investigación de la Universidad de Csta Rica (741-89-057) y la InternatinalFundatin frscience (F/0883-3). F. Chaves y J.M. Gutiérrez sn miembrs del Prgrama Financier de Apy a Investigadres del Cnsej N acinal de Investigac ines Científicas y Tecnlógicas (CNICI1). Chaves, F., J.M. Guúérrez, B. Lmnte & L. Cerdas. 1989. Histpathlgica1 and bichemica1 a1teratins induced by intramuscular injectin f Blhrps asper (tercipe l) venm in mice. Txicn 27: 1085-1093. Estrada, R.; J.M. Gutiérrez, J. Alvarad, A. Rbles, C. Avila & N. Gnzález. 1989. Desarrll de la respuesta de anticuerps anti-fsflipasa Az en caballs incula ds cn venen para la prducción de suer antifídic plivalente en Csta Rica.Rev: Bil. Trp. 37: 187-191. Estrada, R., A. Rbles, J. Alvarad, E. Rjas, N. Gnzález, E. Segura & 1.M. Gutiérrez. 1991. Develpment f antibdy respnse and clinical and
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