Caso 314: Cálculo de velocidades iniciales 1 Caso 314: Cálculo de velocidades iniciales en Cinética. Discriminación entre modelos, cálculo de pendientes y asíntotas (F.J. Burguillo) CASO PRÁCTICO La siguiente tabla de datos corresponde a un estudio de hidrólisis de p-nitrofenil palmitato catalizada por la actividad lipásica de células enteras de la levadura Yarrowia lipolytica. Se midió, a distintos tiempos de reacción, la absorbancia de la muestra debida al p-nitrofenol liberado (4 nm), previo congelado de la reacción al tiempo de muestreo y centrifugación de las células que interferirían en la medida de absorbancia. Se hicieron 3 réplicas a cada tiempo y el resultado se expresó en velocidad actual (mmol/min/mg Pesohumedo de células). La variación de la velocidad actual con el tiempo, presenta la forma de una curva creciente que se puede interpretar con diferentes ecuaciones que se analizan a continuación en el apartado de teoría. t (horas) 1. 1. 1. 2. 2. 2. 3. 3. 3. 4. 4. 4. 5. 5. 5. 6. 6. 6. 7. 7. 7. Velocidad 1.38 1.4 1.42 2.49 2.51 2.41 3.46 3.24 3.31 4.19 4.17 4.13 4.77 4.67 4.69 5.23 5.12 5.3 5.64 5.72 5.67 El objetivo de este ejercicio es ajustar estas ecuaciones a los datos experimentales y discriminar, a partir de la bondad de los ajustes, cual de ellas proporciona el mejor ajuste. Encontrada la curva de ajuste, la derivada analítica de dicha función a tiempo cero será la velocidad inicial del proceso. Teoría Los modelos habituales para el ajuste de curvas cinéticas son los siguientes; 1. Modelo lineal... (1 ó 2 parámetros) f(t)=bt + C Cuando los datos de la cinética estudiada siguen un comportamiento prácticamente lineal este es el modelo a utilizar. 2. Modelo cuadrático... (2 ó 3 parámetros) f(t)=at + Bt 2 + C Es útil cuando se dispone unicamente de los datos iniciales de la cinética estudiada y se quiere estimar con ellos los datos de velocidad inicial.
2 Caso 314: Cálculo de velocidades iniciales 8. 8. 8. 9. 9. 9. 6.7 5.72 5.57 6.3 5.8 6. 3. Modelo exponencial (2 ó 3 parámetros) f(t)= [1 1 ( t) ]+C Util para estimar tanto velocidades iniciales de reacción como asíntotas horizontales a tiempos finales. Proporciona buenos ajustes cuando se dispone de un seguimiento completo de la reacción. 4. Modelo de Hill/Michaelis-Menten (2, 3 ó 4 parámetros) f(t)= V max t n Km n + t n Sobre todo es útil para estimar asíndotas horizontales en los tiempos finales de una cinética. si n= 1 también puede dar una buena estima de las velocidades iniciales de la reacción. + C 5. Modelo de fase de latencia/fase exponencial (3 ó 4 parámetros) f(t)=p t + Q [1 1 ( R t) ]+C Este modelo es adecuado para estimar las velocidades iniciales de reacción, tiempos de inducción o latencia, asíndotas lineales inclinadas, etc. Es un modelo que ajusta bien datos provenientes de cinéticas con una fase de inducción más o menos larga, seguida de una fase exponencial brusca. El programa INRATE del paquete SIMFIT realiza todos estos ajustes automáticamente, proporcionando, para cada uno de los modelos, una serie de tablas y tests estadísticos que permiten discriminar cual es el mejor modelo de ajuste. Así mismo, calcula la velocidad inicial y las asíntotas respectivas sobre cada ecuación ajustada. Como es sabido, dados n pares de observaciones (x 1,y 1 ), (x 2,y 2 ), (x 3,y 3 ),... (x n,y n ), el método general de los mínimos cuadrados para estimar θ, consiste en calcular el valor θ que minimice la suma de cuadrados de los residuales: WSSQ = w i (y i f(x i, )) 2 donde WSSQ es la llamada suma de residuales al cuadrado con pesos estadisticos (weighted sum of squares). Siendo w i el peso estadístico calculado como el inverso de la varianza de la medida ( 2 w i = 1/ i ). En el caso práctico que nos ocupa, hablaríamos de una Regresión no lineal con pesos estadísticos, tomando los pesos como 2 w i = 1/s i, siendo la desviación estándar de la muestra de las 3 réplicas que tenemos a cada tiempo. s i PROCEDIMIENTO PASO A PASO 1.- Crear archivo con los datos (o abrir en su momento C:\curso\caso314.dat )
Caso 314: Cálculo de velocidades iniciales 3 2.- Ajuste de los datos a las diferentes ecuaciones Seleccionar en el menú principal la opción Ajustes y en el submenú que se despliega pulsar en vel. iniciales/tiempos de inducción/asíntotas (inrate). A continuación aparece una pantalla con opciones: Seleccionar Ejecutar. En el menú de entrada de datos: Seleccionar Introducirlos desde archivo Abrir el archivo: c:\curso\caso314.dat Usa esta fila?, contestar Sí. A continuación aparece la siguiente pantalla con los modelos: dejar las opciones que hay por defecto y marcar, además, la opción f()=: Forzar la curva de ajuste a pasar por el origen a t= (C=). A continuación van saliendo los resultados de todos los ajustes. Para ir avanzando, basta con ir pulsando, según sea necesario, los botones: OK, Sí o Cancelar. Al terminar todos los ajustes pulse Salir para abandonar el programa.
4 Caso 314: Cálculo de velocidades iniciales 3.- SOLUCIONES 1) El mejor ajuste es el del modelo 3: 2) Los valores de los parámetros y de la velocidad inicial son: 3) La gráfica del ajuste al modelo 3 y la tangente de velocidad inicial es:
Caso 314: Cálculo de velocidades iniciales 5 4) Si se quiere editar la gráfica anterior se puede pulsar en Advanced y luego en Transfer the control to SIMPLOT, aparecerá un entorno muy poderoso de edición, en el que basta pulsar en el botón deseado y seleccionar lo que se requiere, por ejemplo para dibujar las barras de error hay que pulsar en Data y luego en Error bars y seleccionar el tipo de barra deseado.