Guía de Interpretación Petrifilm Placas para Recuento de E. coli y Coliformes Esta guía sirve para familiarizarse con los resultados obtenidos en las placas M Petrifilm para Recuento de E. coli y Coliformes (EC). Para más información, contactar con el distribuidor oficial de Productos M Microbiology. Las placas Petrifilm EC contienen los nutrientes del VRB, un agente gelificante soluble en agua fría, un indicador de la actividad glucuronidasa BCIG y un indicador de tetrazolio que facilita la enumeración de colonias. El film superior atrapa el gas producido por la fermentación de la lactosa por los Coliformes y E.coli. 4 El tiempo y temperatura de incubacion, así como la interpretación de las placas Petrifilm EC puede variar según el método seguido. Por lo tanto, se pueden obtener resultados ligeramente diferentes. Las temperaturas de incubación usadas normalmente en la mayoría de métodos se mencionan en el folleto del producto, y se muestran ejemplos en la sección técnica (Pág. 2 y ) de esta Guía. No contar las colonias que aparecen sobre la zona blanca, ya que no se hallan bajo la influencia selectiva del medio. Incubar a la temperatura y tiempo normalmente seguido en el laboratorio. Las temperaturas más usadas son: 5, 7, 42 ó 44ºC durante 24 a 48 horas. E. coli : E. coli es capaz de crecer en medios conteniendo 2 los nutrientes del Violeta Rojo Bilis (VRB). La mayoría de E. coli (aprox. el 97%) producen beta-glucuronidasa, que reacciona con un indicador (colorante) BCIG presente en la placa Petrifilm EC y que hace que la colonia sea de color azul a rojo-azul. Aproximadamente el 95% de E. coli producen gas a partir de la lactosa, lo que viene indicado como colonias asociadas (aproximadamente el diámetro de una colonia) a gas atrapado. Ver Círculo. Las colonias de E.coli aparecen de color azul a rojo-azul y producen gas; confirmar las colonias de color azul a rojo-azul sin gas. Ver Círculo 2. En algunos procesos de validación, esta interpretación se ha modificado: las siguientes organizaciones AOAC, NMKL, EMMAS, han validado o evaluado el uso de las Placas para Recuento de E. coli y Coliformes bajo condiciones específicas. Ver páginas 2 y de esta Guía de Interpretación. Observación : La mayoría de cepas de E. coli O57:H7 son atípicas : no crecen a temperaturas 44.5ºC, son glucuronidasa negativas, y por lo tanto, no producirán un precipitado azul. Aparecerán como Coliformes no-e. coli (rojas con gas). Coliformes : Las Placas para Recuento de E. coli y Coliformes pueden usarse también para la investigación de Coliformes. La ISO define los Coliformes por su capacidad de crecer en medios específicos y selectivos. El método ISO 482, que enumera los Coliformes por la técnica del recuento de colonias, define los Coliformes por el tamaño de las colonias y la producción de ácido en el Agar VRB con lactosa (VRBL). En las placas Petrifilm EC, estos coliformes productores de ácido se muestran como colonias rojas con o sin gas (dentro de aproximadamente el diámetro de una colonia). Ver Círculo. El método ISO 48, que enumera los Coliformes por el método del Número Más Probable (NMP), define los Coliformes por su capacidad de crecer y producir gas a partir de la lactosa en un caldo selectivo. En las placas Petrifilm EC, estos coliformes se muestran como colonias rojas asociadas a gas (dentro de aproximadamente el diámetro de una colonia). Ver Círculo 4. La AOAC INTERNATIONAL y el U.S. FDA Bacteriological Analytical Manual (BAM) definen los Coliformes como bacilos Gram negativos que producen ácido y gas a partir de la lactosa durante la fermentación metabólica. Las colonias de Coliformes que crecen en las placas Petrifilm EC producen ácido que oscurece el color del gel. El gas atrapado alrededor de las colonias de Coliformes (dentro de aproximadamente el diámetro de una colonia) indica Coliformes confirmados. Ver Círculo 4.
Interpretaciones de las Placas M Petrifilm EC Método recomendado en Francia 24h +/- 2h a 42 C +/- C. Interpretación : E. coli : Contar todas las colonias azules con o sin gas. 5 E. coli. A Lectura según la AOAC International, todos los alimentos (método 99.4) Coliformes en todos los alimentos : incubar 24h +/- 2h a 5ºC +/- ºC. Enumeración de E. coli en todos los productos, excepto los abajo mencionados : incubar 48h +/- 2h a 5 C +/- C. Lectura según la AOAC International, carnes, aves y mariscos (método 998.08) Enumeración de E. coli en Carne, Volatería y Productos del Mar, y Coliformes en todos los productos : incubar 24h +/- 2h a 5 C +/- C. Interpretación (Metodos 99.4 y 998.08) 47 E. coli, método oficial AOAC. 87 Coliformes confirmados, método oficial AOAC. B E. coli : colonias azules con gas. Coliformes confirmados : todas las colonias con gas (azules y rojas).
Lectura según la NMKL (método 47.99) 7 C +/- C. Interpretación : E. coli : Contar todas las colonias azules, con y sin gas tras 48h +/- 2h de incubación. Coliformes : Contar las colonias rojas con gas y todas las colonias azules con o sin gas después de 24 h +/- 2h de incubación. C 5 E. coli, método NMKL. 95 Coliformes totales, método NMKL. Lectura según método evaluado por la EMMAS 48h +/- 2h a 7 C +/- C. Interpretación : E. coli : Contar todas las colonias azules con y sin gas. Es aconsejable confirmar las colonias azules sin gas, en especial cuando estén presentes en una alta proporción. D 5 E. coli, método evaluado EMMAS.
Placas M Petrifilm para Recuento de E. coli y Coliformes Observar el cambio de color del gel en las figuras 2 a 8. Al incrementar el recuento de E. coli y Coliformes, el color del gel se vuelve rojo oscuro o azul-púrpura. No crecimiento Recuento de E. coli = 0 Las burbujas de fondo son una característica del gel y no resultado del crecimiento de E. coli o Coliformes. Las burbujas de fondo son pequeñas o puntiformes, de forma regular y no tienen una colonia asociada. Ver Recuadro. 2 Recuento de E. coli = Recuento de Coliformes productores de gas =28 Al igual que las placas de Agar VRB, el intervalo óptimo de recuento (colonias totales) en las placas Petrifilm EC es 5-50. No contar las colonias que aparecen sobre la zona blanca ya que no están bajo la influencia selectiva del medio. Ver Círculo. Iluminación de fondo Iluminación frontal 2 Recuento E. coli = Toda coloración azul presente en una colonia (azul a rojo-azul) indica la presencia de E. coli. Utilizando una iluminación frontal puede facilitar la visualización del precipitado azul formado por una colonia. El Círculo muestra una colonia rojo-azul usando una iluminación de fondo El Círculo 2 muestra la misma colonia con iluminación frontal. El precipitado azul en este caso se visualiza mejor. 4 Recuento E. coli = 20 Recuento total estimado = 50 El área de crecimiento circular de la placa Petrifilm EC es de aproximadamente 20 cm 2. Se pueden hacer estimaciones en placas con más de 50 colonias contando el número de colonias en uno o varios cuadrados representativos y obteniendo el promedio. Multiplicar dicho número por 20 para obtener el recuento total por placa. 5
Placas TNTC (Demasiado Numeroso Para Contar) Para obtener un recuento más preciso, diluir más la muestra. 6 7 Recuento real ~ 0 6 Las placas Petrifilm EC con colonias TNTC tienen una o más de las características siguientes: muchas colonias pequeñas, muchas burbujas de gas, y un oscurecimiento del color del gel de rojo a azul-púrpura. Recuento real ~ 0 8 Altas concentraciones de E. coli causarán que el área de crecimiento se vuelva azul-púrpura. Recuento real ~ 0 8 Altas concentraciones de Coliformes (no E. coli) causarán que el área de crecimiento se vuelva rojo oscuro. Cuando ésto ocurra, realizar diluciones adicionales para determinar la presencia de E. coli. 8 Recuento real ~ 0 8 Cuando un alto número de microorganismos no-coliformes, tales como Pseudomonas, están presentes en las placas Petrifilm EC, el gel puede virar a amarillo. 9
Burbujas 2 Las partículas alimentícias tienen forma irregular y no están asociadas a burbujas de gas. Ver Figura 0. 0 La Figura muestra como la forma de las burbujas puede variar. Algunas veces el gas deforma la colonia y hace que la colonia perfile la burbuja. Ver Círculos y 2. Pueden aparecer burbujas como artefactos debidas a una inoculación inadecuada de la placa Petrifilm EC o de aire atrapado en la muestra. En este caso, las burbujas tienen forma irregular y no están asociadas a una colonia. Ver Círculo. No contar las colonias que aparecen en la zona blanca ya que no están bajo la influencia selectiva del medio. 2 4 5 6 7 8 9 A continuación se muestran varios ejemplos de burbujas asociadas a una colonia. Todos ellos se deben tener en cuenta. 2
M Petrifilm Placas para Recuento de E. coli y Coliformes Para Advertencias, Precauciones, Responsabilidad del Usuario, Garantía Limitada, Almacenamiento y Eliminación, e Instrucciones de Uso, ver el folleto del producto. Instrucciones de uso Almacenamiento Petrifilm Petrifilm Petrifilm Conservar las bolsas cerradas a 8 C. Usar antes de la fecha de caducidad impresa en la bolsa. 2 Para cerrar las bolsas que se están utilizando, doblar los extremos y cerrarlos con celo. Mantener las bolsas una vez cerradas a 25ºC, a HR <50%. No refrigerar las bolsas abiertas. Usar las placas Petrifilm en un mes desde su apertura. Preparación 4 Pesar o pipetear el producto alimenticio en un contenedor estéril adecuado, como una bolsa Stomacher, frasco de dilución, bolsa Whirl-Pak, o cualquier otro contenedor estéril. 5 Añadir una cantidad apropiada de uno de los siguientes diluyentes estériles: tampón fosfato de Butterfield (tampón fosfato IDF, KH 2 PO 4 a 0.0425g/l, ajustar ph a 7.2), agua peptonada al 0.%, peptona sal (método ISO 6887), solución salina (0.85-0.90%) o agua destilada. 6 Mezclar u homogeneizar la muestra mediante los métodos habituales. No usar tampones que contengan citrato, bisulfito o tiosulfato. Ajustar el ph de la muestra diluida entre 6.6 y 7.2: para productos ácidos, usar NaOH N, para productos alcalinos, usar HCl N. Inoculación 7 Colocar la placa Petrifilm en una superficie plana. Levantar el film superior. 8 Con una pipeta colocada de forma perpendicular a la placa Petrifilm, colocar ml. de la muestra en el centro del film inferior. 9 Bajar el film superior con cuidado evitando introducir burbujas de aire. No dejarlo caer.
0 Con la cara lisa hacia abajo, colocar el aplicador en el film superior sobre el inóculo. Con cuidado, ejercer una presión sobre el aplicador para repartir el inóculo sobre el área circular. No girar ni deslizar el aplicador. 2 Levantar el aplicador. Esperar un minuto a que solidifique el gel. Incubación Interpretación <70 F Incubar las placas cara arriba en pilas de hasta 20 placas. El tiempo e incubación varía según el método*. Métodos aprobados más usuales : Método Oficial AOAC 99.4 : para coliformes, incubar 24h ± 2h a 5 C ± C ; para E.coli, incubar 48h ± 2h a 5 C ± C Método Oficial AOAC 998.08: para E. coli en carnes, aves y mariscos, y Coliformes en todos los alimentos, incubar 24 h +/- 2 h a 5ºC +/-ºC. Método NMKL 47.99 : Para Coliformes, incubar 24h ± 2h a 7 C ± C ; para E.coli, incubar 48h ± 2h a 7 C ± C. * Ver el folleto del producto. 4 Las placas Petrifilm pueden leerse con un contador de colonias standard u otra lente de aumento. Para leer los resultados, consultar la Guía de Interpretación. 5 Las colonias pueden aislarse para una posterior identificación. Levantar el film superior y seleccionar la colonia del gel. Comentarios adicionales Recordar inocular y repartir el inóculo en cada placa Petrifilm antes de pasar a la siguiente placa. El tiempo y temperatura de incubación puede variar según el método utilizado, ver el folleto del producto. Referencia de documento Fecha Versión Marzo 2002.0 Departamento de Microbiología M Espana, S.A. Juan Ignacio Luca de Tena, 9-25 28027 Madrid Tel : 9 2 6246 M y Petrifilm son marcas registradas de M Company. Whirl-Pak es una marca registrada de Nasco FP 0007 - Marzo 2002