TP 3 LIPIDOS. Introducción Los lípidos, son un grupo heterogéneo de compuestos insolubles en agua y solubles en solventes orgánicos. No poseen pesos moleculares elevados forman polímeros de alto peso molecular a diferencia de otras biomoléculas. Los lípidos llevan a cabo múltiples funciones en el organismo, como: almacenamiento de energía, de transporte, cumplir funciones hormonales, actuar como vitaminas, formar parte de las membranas celulares confiriéndoles la propiedad de permeabilidad selectiva, al permitir el paso o no de algunas sustancias y en determinada dirección, así como la conducción nerviosa y el transporte activo. La característica química mas común es la de poseer una función éster, resultado de la unión de un grupo alcohólico y un grupo ácido. Una forma de clasificarlos es la siguiente: Lípidos simples: Ceras Triglicéridos: grasas y aceites. Lípidos complejos: Fosfolípidos: Fosfogliceridos Fosfoesfingosidos Glicolípidos: Glicoesfingosidos Sustancia relacionadas: Derivados del CPPHF Los lípidos simples estan formados por C, H y O. Las ceras son completamente hidrofobicas; por lo que se encuentran en la superficie de plantas y animales, donde funcionan como impermeabilizante, están constituidas por ácidos grasos esterificado alcoholes de cadena larga 14
(de 10 a 30 carbonos). Los ácidos grasos que forman parte de estos lípidos, pueden ser ramificados, insaturados o formar anillos. La mayor parte de los lípidos abundantes en la naturaleza son triacilgliceridos, están formados por ácidos grasos de cadenas hidrocarbonadas pares, saturadas o insaturadas esterificando una molécula de glicerol. Dependiendo si los ácidos grasos son saturados o insaturados, tendremos grasas o aceites respectivamente. Triglicerido En los fosfogliceridos uno de los ácidos grasos es remplazado por ácido fosfórico el cual a su vez puede ser esterificado por otros alcoholes. Los fosfogliceridos son los principales componenetes de las membranas biologicas. Los principales fosfolípidos presentes en los seres vivos son: - LECITINAS: uno de los grupos OH del fosfato lleva unido el amino alcohol colina. - CEFALINAS: uno de los grupos OH del fosfato lleva unido el amino alcohol etanolamina. - FOSFATIDIL SERINAS: el OH del fosfato está esterificado con el aminoacido L-serina. - FOSFATIDIL GLICEROLES: el OH del fosfato se esterifica con glicerol. - CARDIOLIPINAS: dos grupos fosfato esterifican los grupos OH del glicerol. Los fosfoesfingosidos están representados por una sola sustancia: la esfingomielina. El alcohol es una amino alcohol de 18 carbonos llamado esfingosina, el cual no se halla libre en la naturaleza, sino en forma de ceramida (esfingosina + acido graso). En la esfingomielina, el grupo alcohol primario en C-1 de la esfingosina está esterificado con la colina a través de un enlace fosfodiéster del tipo que se encuentra en los acilglicerofosfolípidos y el grupo amino de la esfingosina está unido a un ácido graso de cadena larga mediante un enlace amida. Esfingosina 15
Esfingomielina. La esfingomielina es particularmente abundante en la membrana de las células nerviosas. La esfingomielina de la mielina contiene predominantemente ácidos grasos de cadenas muy largas, principalmente lignocérico y nervónico, mientras que la sustancia gris contiene mayoritariamente ácido esteárico. La esfingosina también participa en la estructura de los llamados glucoesfingósidos, entre los que encontramos cerebrósidos y gangliósidos. Los cerebrósidos resultan de la unión glucosídica de una ceramida y una hexosa que puede ser glucosa o galactosa, dando origen a los glucocerebrósidos y los galactocerebrósidos respectivamente. Los gangliósidos son esfingolípidos más complejos, en su estructura puede identificare: ceramida, hexosas, hexosamina, y ácido siálico o N-acilneuramínico El CPPHF es el núcleo de todos los esteroides. Consta de cuatro anillos: tres hexacíclicos y uno pentacíclico. Casi todos los esteroides añaden al núcleo de CPPHF una cadena lateral variable en C17, un hidroxilo en C3 mediante el que sufren reacciones de esterificación, dos metilos en C10 y C13 y un doble enlace en C5 o en otro sitio, que dan reacciones de hidrogenación y halogenación. En este grupo encontramos el colesterol, acidos biliares, algunas hormonas y vitaminas liposolubles. Los acidos biliares son esteroides derivados del colesterol que se sintetizan en el hígado. Los principales son ácido cólico y el ácido quenodesoxicólico que se conjugan con los aminoácidos glicina y taurina para formar las sales biliares. El colesterol es el precursor que da origen a las hormonas esteroideas de la corteza suprarrenal: cortisol y aldosterona. También es precursor de hormonas sexuales: femeninas como estrógenos y progesterona y masculinas como los andrógenos. Parte experimental Objetivos -Separar lípidos a partir de diferencias de solubilidad. -Comprobar la presencia de los lípidos a partir de características estructurales. 16
Actividades Extracción de lípidos Basados en la solubilidad de los lípidos en solventes orgánicos, es posible extraer y purificar lípidos del cerebro por sucesivas extracciones con diferentes solventes y posterior fraccionamiento de los extractos para obtener fracciones ricas en: esteroles, glicerofosfolípidos y esfingolípidos. El esquema se basa en los siguientes hechos: Los esteroles son solubles en acetona, al contrario de lo que sucede con otros lípidos complejos. Algunos glicerofosfolípidos, como las lecitinas, la fosfatidiletanolamina y la fosfatidilserina, son solubles el éter e insolubles en acetona. Los glucósidos de esfingosina se disuelven en alcohol caliente y son insolubles en acetona y éter. Pesar 20 g de cerebro triturarlo en mortero y secarlo parcialmente en un vaso de precipitado. Agregar 50 ml de alcohol etílico, llevar a ebullición y mantenerlo por 3 minutos, luego filtrar por gasa. El filtrado se concentra en manta calefactora hasta unos 30 ml y se agregan luego 25 ml de éter, agitar y separar en ampolla de decantación. Se obtienen dos fracciones: Fracción superior A : etérea, que tendrá disueltos lecitina, cefalina, grasas, colesterol y restos de esfingomielina y cerebrósidos. Fracción inferior B : alcohólica que tendrá disueltos esfingomielina y cerebrósidos. Fracción A: concentrar en baño María a mitad de volumen inicial y agregar 25 ml de acetona: se observará un precipitado que corresponde principalmente a fosfolípidos, quedando en solución el colesterol y las grasas. Separar por centrifugación obteniendo un sobrenadante C y un precipitado D. Sobrenadante C: separar en dos fracciones, en una reconocer grasas y en la otra extraer el colesterol con 10 ml de éter. Precipitado D: reconocer lecitina y cefalina como fosfolípidos. Fracción B: reconocer cerebrósidos. Reacciones de reconocimiento Reconocimiento de grasas: Es una prueba para identificar ácidos grasos, por lo tanto, general para los lípidos que los contengan. Los jabones se define químicamente como, las sales metálicas de los ácidos grasos superiores. 17
Prueba de saponificación Se separan las grasas por saponificación, para esto se coloca 1 ml de la muestra, 1 ml de etanol y 0,5 ml de hidróxido de sodio al 40%. Calentar suavemente. Agregar unas gotas de ácido sulfúrico. La presencia de enturbiamiento indica liberación de ácidos grasos. 2 - Reconocimiento de colesterol: Retirar la fracción etérea obtenida y secar la muestra en manta calefactora. Resuspender en 2 ml de cloroformo y agregar 2 ml de H 2 SO 4. Observar e interpretar los resultados. La coloración observada se debe a la acción del ácido sulfúrico. Inicialmente se deshidratan dos moléculas de colesterol, las cuales se dimerizan en posición 3 (bi colestadieno). El cual luego es sulfatado formándose el compuesto de coloración roja (ácido bisulfónico bi- colestadieno). 18
3 - Reconocimiento de cerebrósidos: Mediante la reacción de Molish para hidratos de carbono. ( Ver TP H de Carbono). 4 - Reconocimiento de fosfolípidos: lecitina y cefalina mediante la determinación de la presencia de fósforo. La reacción se basa en que el fosfato inorgánico, en medio ácido, con el molibdato (reactivo 1) da fosfomolibdato, color amarillo, que es reducido luego por el ácido ascórbico (reactivo 2) a azul de molibdeno, color azul verdoso. El reactivo 3 (arsenito/citrato) se combina con el exceso de molibdato impidiendo su reacción posterior con fosfatos liberados de ésteres lábiles, lo que se aprovecha cuando se quiere determinar fosfato inorgánico libre en presencia de, por ejemplo, fosfolípidos (que no es nuestro caso). Agregar 1ml de la muestra soluble de precipitado D Agregar 0,5 ml de Reactivo 1 Mezclar y esperar 30 segundos. Agregar 0,5 ml de Reactivo 2 Mezclar y esperar 30 segundos Mezclar. Luego de 10 minutos la presencia de color azul demuestra la presencia de fosfato unido a lecitina y cefalina en el tejido. 19
Actividades complementarias 1. Indica las distintas funciones de los lípidos en los seres vivos. 2. Cual es el papel de los lípidos en la regulación de la fluidez de la membrana plasmática? 3. Cuáles son las distintas funciones del tejido adiposo? 4. Cuál es la función de las prostaglandinas? 5. Que son los ácidos grasos esenciales? 6. Completa las siguientes formulas Acidos grasos SATURADOS: Láurico Mirístico: Palmítico : Esteárico: INSATURADOS: Palmitoleico: Oleico Linoleico: Linolénico: 7. Completa las siguientes estructuras MONOGLICERIDO DIGLICERIDO TRIGLICERIDO 20
Fosfolípidos ACIDO FOSFATIDICO LECITINA O FOSFATIDIL COLINA CEFALINA O FOSFATIDILETANOL AMINA FOSFATIDIL SERINA FOSFATIDIL INOSITOL CARDIOLIPINA 21
COLESTEROL ERGOSTEROL 22