TRABAJO PRÁCTICO N 6 FERTILIZANTES BIOLÓGICOS: DESARROLLO Y CONTROL DE CALIDAD DE INOCULANTES
Objetivos Conocer los parámetros para la selección de cepas. Conocer las metodologías y procedimientos microbiológicos para la evaluación y control de los inoculantes más utilizados en la actualidad. Adquirir habilidades y/o destrezas para la evaluación de la inoculación a campo. Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto para fomentar una eficiente labor grupal.
Fertilizantes Fertilizantes no biológicos Fertilizantes biológicos Formulados con compuestos químicos orgánicos: compost, lombricompuesto, estiércol, abonos verdes, etc. Formulados con organismos vivos Formulados con compuestos inorgánicos: fosfato de amonio, nitrato de amonio, etc.
Inoculantes o Fertilizantes biológicos Productos que contienen uno o varios microorganismos como principal componente Microorganismos Viables Benéficos Seleccionados Para favorecer la nutrición y/o promover el crecimiento de las plantas.
Inoculantes o Fertilizantes biológicos PGPR (promotores del crecimiento) Fijadores de N 2 Microorganismos solubilizadores de P de vida libre Hongos micorríticos Mezcla de microorganismos no definidos Rizobios Azospirillum sp. Anabaena INOCULANTE Fertilizante biológico que se aplica a la semilla en el momento de la siembra
Clasificación de Inoculantes Según el soporte Líquidos Sólidos (turba) Según la cantidad de cepas que contengan Una: Monocepa Varias: Multicepa
Inoculante efectivo Formulado con microorganismos seleccionados por su capacidad fijadora. Microorganismos específicos para el cultivo a tratar y adaptados a las condiciones ambientales del lugar del cultivo. Con un número adecuado de microorganismos. Ley Nº 20466/80. Presentar un soporte que proteja al rizobio, de fácil aplicación y buena adherencia a la semilla. No deben poseer contaminantes. Envase adecuado y con instrucciones claras
Inoculante efectivo CEPA + SOPORTE = CALIDAD Eficiencia (Especificidad y adaptación) que garantice viabilidad de microorganismos
Desarrollo de un inoculante para leguminosas nódulos cortar la raíz lavar seleccionar nódulos turgentes extraer los nódulos macerar en 1 ml de H 2 O estéril enjuagar con H 2 O estéril desinfectar con H 2 O 2 (5 minutos) incubar colorear (Gram -) estriar en medio YEM repicar (pico de flauta) incubar conservar
Aislamiento de microorganismos: rizobios Raíz de leguminosa 1º Extraer los nódulos 3º Enjuagar con H 2 O estéril 2º Desinfectar con H 2 O 2 (20%) 5 minutos
Aislamiento de microorganismos: rizobios 4º 5º Colocar los nódulos en un tubo con 1mL de agua estéril Macerar con varilla de vidrio 8º Incubar a 28-30 C 7º Estriar en medio YEM 6º Extraer una alícuota
Aislamiento de microorganismos: rizobios Cultivo de rizobio 9º Colorear y observar 11º Incubar y conservar 10º Repicar a pico de flauta
Producción de inoculante Primera etapa: Selección de cepas Testigo medio sin N sin inocular Control medio sin N inoculado con cepa eficiente Tratamientos medio sin N inoculados con cepas a testear Testigo medio con N sin inocular
Selección de cepas: parámetros de evaluación Ensayos de infectividad: Cantidad de nódulos Ubicación en la raíz
Selección de cepas: parámetros de evaluación Ensayos de infectividad: Tamaño de nódulos Calidad al corte (color rojo) Actividad fijadora de nitrógeno.
Selección de cepas: parámetros de evaluación Ensayos de efectividad: Nodulación Materia seca % de nitrógeno Evaluación final a campo: Nodulación Peso seco de nódulos % de nitrógeno Rendimiento en grano
Producción de inoculante Segunda etapa: Preparación a nivel industrial
Producción de inoculantes Mangueras Tapones Filtro de aire Biodigestores Mechero Aireador
Planta industrial Producción de inoculantes
Control de calidad de inoculantes Para inoculante sólido suspensión Inoculante sólido 1 ml inoculante sólido (X g + X ml de solución salina estéril) 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 9 ml de solución salina estéril 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 1 ml 1 ml 1 ml medio Y.E.M. incubar calcular
Para inoculante líquido Control de calidad de inoculantes
Preparación del inoculante Inoculación a campo 1º - Dilución: para una distribución más homogénea 2º - El volumen total de líquido (agua + inoculante + curasemilla) para la dilución, depende del tamaño de las semillas: semillas grandes: hasta 2,4 litros cada 100 kg de semilla (Soja: 900 ml / 100 kg) semillas chicas: hasta 4 litros cada 100 kg de semillas (Alfalfa: 1000 ml / 100 kg)
Inoculación a campo Recomendaciones generales Realizar la inoculación a la sombra. Inocular la cantidad necesaria para un día de siembra. Si debe aplicar curasemillas, realice la mezcla de ambos productos respetando el volumen de agua y sembrar inmediatamente.
Inoculación a campo No conservar el inoculante mezclado con el curasemillas durante mucho tiempo. No usar herramientas o recipientes que hayan estado en contacto con combustibles o pesticidas.
Si en la inoculación también aplicamos curasemillas, debemos respetar las normas para manejo seguro de agroquímicos Inoculación a campo
Inoculación a campo Utilizar protección en rostro y cuerpo No mezclar y/o conservar los productos en botellas de bebida
TRABAJO DE LABORATORIO 1. Aislamiento de rizobios y visualización de bacteroides a partir de nódulos de leguminosas. a- Cortar las raíces de plantas noduladas. b- Lavar las raíces con cuidado y sin romper los nódulos. c- Extraer de 5 a 10 nódulos turgentes d- Desinfectar los nódulos extraídos con agua oxigenada durante 5 minutos.
e- Enjuagar los nódulos con agua destilada estéril. f- Macerar los nódulos extraídos en 2 ml de agua destilada estéril. g- Realizar estrías en medio Y.E.M. e incubar durante 7 días a 28-30 C. h- A partir del macerado realizar una coloración de Gram. i- Visualizar el carácter Gram y la forma de los bacteroides.
TRABAJO DE LABORATORIO Nódulos (A; B; C) y bacteroides (D; E; F) de P. sativum (arveja).
TRABAJO DE LABORATORIO 2. Control de inoculantes para soja. a- Bajo condiciones de asepsia, realizar la siembra de 2 inoculantes para soja. b- Realizar diluciones al décimo (1/10) en solución salina estéril. c- Sembrar 1 ml de las últimas tres diluciones en cajas de Petri estériles, utilizando 20 ml de medio Y.E.M. previamente fundido y atemperado a 45-50 C. d- Incubar durante 7 días a 28-30 C.