PORQUE BUSCAMOS LA HEPATITIS C? ESTE INDIVIDUO TIENE HCV? ESTA PERSONA (POTENCIAL DONANTE DE SANGRE) PUEDE ESTAR EXPUESTO A HCV? QUE EFECTOS TIENE LA INFECCION POR HCV EN EL HIGADO? CUAL ES LA PROBABILIDAD QUE EL TRATAMIENTO SEA EFECTIVO EN ESTE PACIENTE? EXISTEN TRATAMIENTOS EFECTIVOS?
QUIENES SON LOS CANDIDATOS A ESTUDIAR EL HCV? 1- AQUELLOS QUE TIENEN FACTORES DE RIESGO PARA LA INFECCION POR HCV 2- AQUELLOS CON RESULTADOS DE SU FUNCION HEPATICA ANORMAL 3- LOS DONANTES DE SANGRE 4- PACIENTES INFECTADOS CON TERAPIA ANTIVIRAL
IMPACTO DE LA INFECCION
HISTORIA NATURAL DE LA HEPATITIS C GRAN COHORTE DE PACIENTES AMBOS SEXOS Y DE DIFERENTES ETNICIDAD FECHA DE INFECCION: HEPATITIS C AGUDA SIN TRATAMIENTO CONOCIMIENTO DE COFACTORES
ESTRATEGIAS PARA EL ESTUDIO DE LA HISTORIA NATURAL DE HCV INFECCION INICIAL FASE TEMPRANA HEPATITIS CRONICA 20 A 40 AÑOS FASE TARDIA HEPATITIS CRONICA (CIRROSIS) ESTUDIOS RETROSPECTIVOS ESTUDIOS PROSPECTIVOS ESTUDIOS RETROSPECTIVOS - PROSPECTIVOS Leonard Seeff 2002; Hepatology
DINAMICA DE LA INFECCION TEMPRANA POR HCV INFECCION POR HCV CLEARANCE VIRAL TRANSMISSION PATOGENESIS PERSISTENCIA VIRAL
HCV RNA 4-7 log Doubling Time Viral :10,8 a 17 horas
SCREENING SEROLÓGICO Concentración Relativa Período de Ventana Serológica Infección Ag/Ac 4ª Anti-HCV 3 ra Anti-HCV 2 da Anti-HCV 1 ra 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Eclipse Días
ALGORITMO DIAGNÓSTICO Relación S/CO EIA para Anti HCV + - NEGATIVO Alto S/CO Bajo S/CO RIBA Anti HCV - RT-PCR HCV - IND + + POSITIVO NEGATIVO INDETERMINADO POSITIVO Evaluación adicional (PCR, ALT, etc) Alter et al, Recommendations and Reports, CDC,2003
SCREENING SEROLÓGICO ELISA CORE E1 E2 NS1 NS2 NS3 NS4 NS5 S 1º c100-3 80% 2º C22-3 c200 95% 3º C22-3 c200 NS5 97%
Falso positivo? Anti-HCV (+) La Pregunta Inicial Verdadero positivo? Pacientes sanos No antecedentes parenterales ALT normal Pruebas Suplementarias: RIBA-LIA HCV RNA Transfusiones o drogas IV Incremento de ALT Enfermedad hepática
Limitaciones del Anti-HCV No mide la presencia de virus circulante No distingue entre infección aguda, crónica o resuelta Es negativo en alrededor del 10% de los pacientes con infección crónica C No es útil para el diagnóstico de infección aguda (seroconversión en semanas) En poblaciones de bajo riesgo la tasa de resultados falsos positivos es alta
EN LOS INMUNOENSAYOS MUESTRAS QUE PERMANECEN POSITIVAS Y QUE SON NEGATIVAS POR UN TEST CONFIRMATORIO INESPECIFICA O FALSA REACTIVIDAD FALSOS POSITIVOS O BFR
2- LAS CAUSAS INMUNOENSAYOS La causa primaria de BFR es la reactividad de anticuerpos No específicos ya sea contra epitopes virales o no virales contaminantes Vacunación contra FLU o Rabia Infecciones agudas recientes o Alergias Agentes relacionados inmunologicamente
CARACTERISTICAS DE LOS BFR 1- RELACIONADOS AL ENSAYO 2- CAMBIOS DE LA TASA DE BFR CON LOS LOTES 3- VARIACIONES DE BFR DEBIDO A LAS MODIFICA CIONES DEL ENSAYO 4- RESULTADOS DE BFR TRANSITORIO 5- LA SEÑAL S/CO
CARACTERISTICAS DE LOS BFR 5- LA SEÑAL S/CO ENSAYOS DE MICROPLACAS ENSAYOS EN TUBOS HCV BFR S/CO : 1.524 ANTI HCV (+)/ RNA (-) S/CO: 4.546 ANTI HCV (+) RNA(+) S/CO: 6.467
MÉTODOS SUPLEMENTARIOS RIBA O LIA Mayor Especificidad y menor Sensibilidad que EIA de 3º Generación
LUDWIG VAN BEETHOVEN 1770-1827
El término música clásica es un amplio, a veces impreciso, término que se refiere a la música producida o arraigada en la tradición INTERPRETACION La Biología Molecular es una ciencia cuyo objetivo fundamental es la comprensión de todos aquellos procesos celulares, que contribuyen a que la información genética se transmita eficientemente de unos seres a otros, y se exprese en los nuevos individuos.
MUSICA CLASICA INTERPRETACION LA BIOLOGIA MOLECULAR ORQUESTA ENSAYOS VIOLINES, VIOLAS, FLAUTAS, VIOLONCELOS CONTRABAJO, OBOE, FAGOT, CLARINETE HIBRIDACION, CLONACION PLASMIDOS, TRANSFECCION AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS, SATELITISMO OBRA MUSICAL (SINFONIA) HEPATITIS C
SINFONIA 1º Allegro 2º Adagio o Andante 3º Minuetto o Scherzo 4º Allegro Finale o Rondó HEPATITIS C Replicación y Persistencia Interacción con el SI Mutaciones Carga Viral CARGA VIRAL HCV
EL MOVIMIENTO DE ESTA SINFONIA : NAT LOS INSTRUMENTOS : PCR CUANTITATIVA TMA REAL TIME PCR bdna ARMONIA : LOS ACORDES LIMITE DE DETECCION Y CUANTIFICACION
Utilidad Clínica del HCV RNA Marcador directo de replicación viral Diagnóstico de infección aguda Diagnóstico de infección oculta Transmisión vertical Transmisión por órganos sólidos Recurrencia de HCV post-trasplante Confiabilidad de los productos sanguíneos Accidentes de trabajo Monitoreo del tratamiento antiviral
Para qué sirve la carga viral de HCV? ❶Para estimar la respuesta al tratamiento antiviral ❷Para evaluar la respuesta virológica precoz (12 semanas de tratamiento): HCV RNA negativo o >2 log Qué valor tienen la carga viral para evaluar la severidad o el pronóstico de una hepatitis crónica C? Ninguno fehacientemente comprobado
Tecnología Real time Taqman Syber Green Easy Q (Molecular Beacon) A. Martinez-Lab Virología-CEMIC
REAL TIME PCR Sondas de hibridización Molecular beacons Syber Green HCV RNA Tecnología Taqman Journal of Molecular Endocrinology (2000) 25,169-193
HEPATITIS VIRALES-CARGA VIRAL REAL TIME PCR : BAJA CONTAMINACION AUMENTO DEL RANGO DINAMICO : LOG DE 8 O 9 BAJO LIMITE DE DETECCION RESULTADOS EN UI/mL REPRODUCIBILIDAD HIT RATE 95%
Workflow 48 muestras DIA 1 DIA 2 9:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 9:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 PCR Extracción, automatizada Amplificación Detección RT Extracción, automatizada Amplificación Detección
SCOTT JD, GRETCH DR. JAMA 2007; 21:724-732
ENSAYOS MOLECULARES PARA HCV NASBA HCV QT (BIOMERIEUX) 278 UI/mL Procleix HIV 1/ HCV (Gene Probe ) 5 UI/mL AmpliScreen HCV (Roche) 50 UI/mL
HCV RNA CUANTITATIVO MONITOREO TRATAMIENTO SCOTT JD, GRETCH DR. JAMA 2007; 21:724-732
* LOS ENSAYOS MOLECULARES DEBEN ESTAR VALIDADOS * LOS ENSAYOS MOLECULARES: ESTANDARIZADOS * LOS ENSAYOS MOLECULARES: CONTROLES DE CALIDAD * ENSAYOS MOLECULARES COMERCIALES : TRAZABILIDAD PERO CUIDADO!!
CAP/ CTM SOBREESTIMACION DE LA CARGA VIRAL SUBESTIMACION DE LA CARGA VIRAL GENOTIPO 2 (15%) GENOTIPO 4 (30%) PAWLOTSKY JM, 2007 Hepatology ;46: 22-31
LOS ENSAYOS DE BIOLOGIA MOLECULAR CONSTITUYEN EL NUEVO PARADIGMA EN LAS HEPATITIS VIRALES NUEVAS TECNOLOGÍAS : ARRAY LÍQUIDO (LUMINEX) NUEVOS MARCADORES : cccdna (HBV) INTERPRETACION