cualitativos para la detección n de STEC en alimentos Martes 16 de mayo

IV CURSO AVANZADO WHO GSS 2006 Buenos Aires, 15-24 de Mayo Validación n de métodos m cualitativos para la detección n de STEC en alimentos Martes 16 de mayo Gerardo Leotta Servicio Fisiopatogenia, Departamento Bacteriología INEI - ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán

CODIGO ALIMENTARIO ARGENTINO El 11 de mayo de 2004, se incluyó en el Código Alimentario Argentino el artículo 156tris y se modificaron los artículos 255 y 302. Especificaciones microbiológicas Productos preparados a base de carne picada una vez cocidos: ausencia de E. coli/g y ausencia de E. coli O157:H7/NM en 5 muestras de 65 g cada una Carne picada fresca y chacinados frescos: E. coli máximo 5 x 10 2 UFC/g, y ausencia de E. coli O157:H7/NM en 5 muestras de 65g cada una. Para la detección de E. coli O157:H7 y O157:NM en productos cárnicos se recomienda la metodología validada por USDA/FSIS.

Detección de E. coli O157:H7/NM según USDA/FSIS Muestra 65 g TAMIZAJE Caldo de enriquecimiento ECm + novobiocina 585 ml, 37ºC, 18 h (Figura 1) AISLAMIENTO Inmunocromatografía ELISA PCR MK Resultado positivo Separación inmunomagnética Resultado negativo Medios selectivos y diferenciales 37 ºC 20 h PCR múltiple Identificación y caracterización de una colonia aislada

Tipos de pruebas diagnósticas para la detección de STEC O157:H7/NM Tamizaje Aislamiento Confirmatorio inmunocromatografía ELISA aglutinación n reversa pasiva (RPLA) PCR separación inmunomagnética inmunocaptura inmunoconcentración medios cromogénicos nicos, fluorogénicos nicos,, selectivos PCR identificación n bioquímica serotipificación citotoxicidad en células c Vero aglutinación n reversa pasiva (RPLA)

Validación Capacidad de medir aquello que se pretende medir respecto a un patrón n oro externo

Validación de métodos analíticos Métodos del propio laboratorio (In house) para su uso adecuado deben estar perfectamente documentados y validados. Métodos de revistas científicas (Literature methods) deben usarse con suma precaución y con previa validación. Métodos oficiales son de uso exigido por organismos gubernamentales y satisfacen regulaciones estatales. Los mismos fueron previamente validados. Métodos estándar son los de mayor calidad analítica. Son desarrollados por organizaciones de prestigio y están rigurosamente validados.

Validación de métodos analíticos Método cualitativo Método de análisis cuya respuesta está basada en la presencia o ausencia del analito, detectado directa o indirectamente (AOAC 2002) La mayoría de los parámetros cualitativos se expresan en términos probabilísticos (Trullols 2004)

Validación de métodos analíticos Método cualitativo Rango de trabajo Selectividad Límite de detección Límite de corte Inclusividad Exclusividad Robustez

Detección de E. coli O157:H7/NM según USDA/FSIS Muestra 65 g TAMIZAJE Caldo de enriquecimiento ECm + novobiocina 585 ml, 37ºC, 18 h (Figura 1) AISLAMIENTO Inmunocromatografía ELISA PCR MK Resultado positivo Separación inmunomagnética Resultado negativo Medios selectivos y diferenciales 37 ºC 20 h PCR múltiple Identificación y caracterización de una colonia aislada

Detección de E. coli O157:H7/NM según USDA/FSIS TAMIZAJE Inclusividad: 98% Exclusividad: 90% Detección de falsos negativos: 2% Detección de falsos positivos: 10%

TAMIZAJE PCR MK para la detección n de los genes stx1 1 y stx2 Servicio Fisiopatogenia, Departamento de Bacteriología INEI - ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán Laboratorio de Microbiología de Alimentos D.L.I.M. - D.G.H.y S.A., G.C.B.A.

PCR MK para la detección n de los genes stx1 1 y stx2 Secuencia nucleotídica de los primers utilizados Primer MK 1 MK 2 Secuencia del primer (5-3 ) TTTACGATAGACTTCTCGAC CACATATAAATTATTTCGCTC Tamaño del fragmento amplificado (pb) 224-227 Karch y Meyer, 1989.

PCR MK para la detección n de los genes stx1 1 y stx2 Cepa E. coli EDL 933 O157:H7 stx1/stx2 Tº annealing: 48ºC Tº annealing: 53ºC 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 10 4 10 3 10 2 10 1 10 0 + - s/t

PCR MK para la detección n de los genes stx1 1 y stx2 Cepa E. coli EDL 933 O157:H7 stx1/stx2 ECm 8 h de incubación ECm 18 h de incubación Carne sin aditivo Carne con aditivo Carne sin aditivo Carne con aditivo 1 10 10 2 10 3 1 10 10 2 10 3 1 10 10 2 10 3 1 10 10 2 10 3 C/S + - s/t

Muestra negativa: mal funcionamiento del termociclador errores en la mezcla de reacción baja actividad de la polimerasa inhibidores en la matriz del alimento Cómo nos aseguramos que la muestra es realmente negativa? El Comité de Estandarización Europeo (CEN) y la Organización Internacional de Estandarización (ISO) propusieron la utilización de un control interno de amplificación en cada mezcla de reacción de PCR

Control Interno de Amplificación (IAC) Secuencia de ADN presente en el mismo tubo de reacción, que es coamplificada simultáneamente con el extracto de ADN obtenido de la muestra problema IAC no competitivo IAC competitivo

IAC NO COMPETITIVO Origen del IAC: genoma del organismo blanco (16S o 23S) ADN de otro microorganismo No hay competencia por los primers Diferente set de primers (dos reacciones diferentes simultáneamente) Mismas condiciones de PCR Inseguridad en la amplificación de la secuencia blanco La reacción de PCR subeficiente para ambas reacciones Puede utilizarse en diferentes PCR Muestra +, IAC - : problemas en la reacción IAC Muestra -, IAC - : problemas en la reacción IAC, muestra?? Muestra -, IAC +: muestra??

IAC COMPETITIVO Origen del IAC: microorganismos recombinantes amplicones Siempre hay competencia por los primers Mismo set de primers Mismas condiciones de PCR Baja el límite de detección de la PCR, falsos negativos si hay exceso de IAC Tamaño, debe ser inferior a la secuencia blanco e inferior a 500 pb Muestra +, IAC - : OK Muestra -, IAC - : problemas Muestra -, IAC +: la muestra es negativa

R MK para la detección n de los genes stx1 1 y stx2 Desarrollo del IAC tención de la secuencia blanco por deleción lonado del fragmento IAC obtenido por PCR Transformación de células competentes Conservación de las células transformadas

R MK para la detección n de los genes stx1 1 y stx2 C competitivo 224-227 pb 170 pb

R MK para la detección n de los genes stx1 1 y stx2 ATCC 25922 E. coli ONT stx1 E. coli O26 stx1 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 + - s/t. coli O157 stx1/stx2 E. coli O145 stx2 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 + - s/t

R MK para la detección n de los genes stx1 1 y stx2 clusividad (n:50) xclusividad (n:30)

R MK para la detección n de los genes stx1 1 y stx2 ROBUSTEZ Día 1 Día 2 Día 3 Operador I, Termociclador I 4 5 6 7 8 9 10 + - M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 + - M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 + - M 4 5 6 7 8 9 10 + - M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 + - M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 + - M Operador II, Termociclador II

PCR MK + IAC. Análisis de los resultados PCR MK + IAC itotoxicidad específica en células Vero positivo negativo positivo A Verdadero positivo B Falso negativo A + B negativo C Falso positivo D Verdadero negativo C + D A + C B + D

PCR MK + IAC. Análisis de los resultados Inclusividad (%) = A : (A+B) x 100 Exclusividad (%) = D : (C+D) x 100 Valor predictivo positivo (%) = A : (A+C) x 100 Valor predictivo negativo (%) = D : (B+D) x 100 Precisión analítica (%) = (A+D) : (A+B+C+D) x 100

PCR MK + IAC. Análisis de los resultados Comparación de los resultados obtenidos con el ADN correspondiente a 10 5 UFC/50 µl de mezcla de reacción UFC/50 µl Inclusividad Exclusividad Valor predictivo positivo Valor predictivo negativo Precisión analítica 1 x 10 5 100% 100% 100% 100% 100%

PCR MK para la detección n de los genes stx1 1 y stx2 E. coli O157:NM stx1/stx2 E. coli O145:NM stx2 Carne con aditivo Carne sin aditivo Carne con aditivo Carne sin aditivo 1 10 10 2 10 3 1 10 10 2 10 3 1 10 10 2 10 3 1 10 10 2 10 3 + - s/t M E. coli ONT:H19 stx1 E. coli O26:H11 stx1 Carne con aditivo Carne sin aditivo Carne con aditivo Carne sin aditivo 0,01 0,1 1 10 0,01 0,1 1 10 0,1 1 10 10 2 0,1 1 10 10 2 + - s/t M

Detección de E. coli O157:H7/NM según USDA/FSIS Muestra 65 g TAMIZAJE Caldo de enriquecimiento ECm + novobiocina 585 ml, 37ºC, 18 h (Figura 1) AISLAMIENTO Inmunocromatografía ELISA PCR MK Resultado positivo Separación inmunomagnética Resultado negativo Medios selectivos y diferenciales 37 ºC 20 h PCR múltiple Identificación y caracterización de una colonia aislada

CONFIRMACION Validación de una técnica de PCR múltiple para la detección de Escherichia coli productor de toxina Shiga G.A. LEOTTA, I. CHINEN, S. EPSZTEYN, E. MILIWEBSKY, I.C. MELAMED, M. MOTTER, M. FERRER, E. MAREY, M. RIVAS Servicio Fisiopatogenia, INEI - ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán Laboratorio de Microbiología de Alimentos DLIM-DGHySA, G.C.B.A. Revista Argentina de Microbiología 37 (1): 1-10

Productos de amplificación por PCR para la detección de los genes stx1, stx2 y rfbo157

Comparación de dos técnicas de extracción de ADN utilizando la cepa E. coli EDL 933 O157:H7 stx1/stx2. UFC/50 µl de mezcla de reacción de PCR Tritón X-100 al 1% en buffer TE 1X stx2 rfbo157 stx1 Kit Wizard (Promega) stx2 rfbo157 stx1 2 x 10 6 + + + + + + 2 x 10 5 + + + +D +D +D 2 x 10 4 + + + - - - 2 x 10 3 +D +D +D - - - 2 x 10 2 - - - - - -

Comparación de dos técnicas de extracción de ADN utilizando la cepa E. coli EDL 933 O157:H7 stx1/stx2. Con buffer Tritón X-100 al 1% en buffer TE 1X se obtuvieron buenos resultados. No hubo interferencias, es menos laboriosa, más rápida y económica

PCR múltiple - Análisis de los resultados Comparación de los resultados obtenidos con el ADN correspondiente a 10 5 UFC/50 µl de mezcla de reacción UFC/50 µl Inclusividad Exclusividad Valor predictivo positivo Valor predictivo negativo Precisión analítica 1 x 10 5 100% 100% 100% 100% 100%

GRACIAS POR SU ATENCIÓN Servicio Fisiopatogenia, Departamento de Bacteriología INEI - ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán