Análisis Avanzado de Alimentos Métodos enzimáticos Análisis mediante enzimas Características de las enzimas: Son catalizadores complejos que actúan eficientemente a bajas temperaturas. Eficiencia 10 6 veces mayor que la de catalizadores químicos. Realizan las conversiones en condiciones suaves (ph, T, etc.) Sustrato Amida (hidrólisis) Urea (hidrólisis) Peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ) Catalizador T/K K M -1.s -1 H + 325 2,4 x 10-6 OH - 326 8,5 x 10-6 α- 298 14,9 quimotripsina H + 335 7,4 x 10-7 Ureasa 294 5,0 x 10 6 Fe +2 295 56 Catalasa 295 3,5 x 10 7 Determinación de un sustrato Determinación de la actividad enzimática propia del alimento Métodos enzimáticos directos 1
Métodos enzimáticos indirectos Se emplea la actividad catalítica de las enzimas para producir una respuesta medible. La especificidad la provee otra molécula, como un anticuerpo. ELISA 1. Ensayos directos para la determinación de un compuesto Las enzimas se usan como reactivos para catálisis específicas de reacciones químicas. a) Determinación de componentes normalmente presentes en alimentos: - glucosa, fructosa, sacarosa, lactosa, almidón - ácidos orgánicos: cítrico, glutámico, pirúvico, glucónico y glucono-delta-lactona, láctico y málico - colesterol, sorbitol b) determinación de sustancias extrañas en los alimentos: antisépticos, antibióticos, pesticidas u otros tóxicos. c) evaluación de productos del metabolismo de microorganismos: piruvato, lactato y amonio en leche, o succinato en huevo. Requerimientos: Disponibilidad de la enzima. Detección sencilla, usualmente por formación de un producto coloreado o con absorbancia al UV. Transformación cuantitativa del sustrato. Para ello es necesario estandarizar condiciones o parámetros de control tales como temperatura, tiempo de reacción, ph, concentración de enzima, etc. 2
Ventajas de este tipo de método Limitaciones del método: Rapidez (en general requiere pocos pasos de preparación de la muestra). Alta especificidad Sensibilidad Precisión. Instrumental sencillo. Pocas interferencias Condiciones suaves de reacción. No todas las sustancias a analizar son posibles sustratos enzimáticos. Disponibilidad de la enzima. Disponibilidad de los cofactores 2. Determinación de la actividad enzimática en alimentos a) Indicador del estado higiénico y de conservación se detecta la actividad de alguna enzima producida por microorganismos: la prueba de la reductasa y catalasa en leche y jugos. b) Control de tratamientos tecnológicos a altas o bajas temperaturas: fosfatasa, peroxidasa y aldehído-reductasa para control de pasteurización y esterilización de leche ureasa residual en soja, para demostrar la destrucción de sus componentes antibiológicos; peroxidasa para el control de blanqueado o escaldado. c) Medidas continuas de actividades enzimáticas durante el tratamiento, el almacenamiento y en los procesos enzimáticos de maduración pueden suministrar importantes informaciones sobre fenómenos biodinámicos que ocurren en los alimentos Ej. fermentaciones, madurez de quesos. d) Evaluar aptitud para un fin dado. Ej: actividad diastásica en harinas. 3
Teoría cinética de Michaelis-Menten Teoría cinética de Michaelis-Menten Enzima (E) Sustrato (S) Producto (P) k 1 k 3 E + S ES P + E k 2 k 1, k 2, k 3 : constantes de velocidad de cada una de las etapas de la reacción global. Velocidad inicial de reacción Velocidad máxima, V M Orden mezclado Orden cercano a 1 Orden cercano a 0 [ P] k [ ES] = v d dt = 3 donde v es la velocidad de formación del producto. Concentración de sustrato 4
La velocidad de formación de producto está dada por: v = k 3 K [ Eo ][. S] + [ S] M Velocidad inicial de reacción V M ½V M K M es [S] a ½ V M Concentración de sustrato La constante de Michaelis-Menten (K M ) constituye una medida de la afinidad de la enzima por el sustrato < K m > afinidad. Si [S] >> K M [ E ] Vmáx v k = = 3 0 Cuando [S] = K M, v = V máx / 2. Esta constante expresa, por tanto, la concentración de sustrato necesaria para semisaturar a la enzima. La mayoría de las reacciones enzimáticas que utilizan sustratos no muy complejos muestran valores de K M entre 10-5 y 10-2 M. Si [S] es muy baja ( [S] < 0.2 K M ) la velocidad depende linealmente de [S] v k3 = K [ E o ]. [ S] M 5
Los dos parámetros más importantes en la teoría de Michaelis-Menten son K M y V máx. Suelen determinarse por la representación de Lineweaver-Burk. Si tomamos la inversa de la ecuación (6), obtenemos: 1 K = ( v V M MÁX [ S] VMÁX al representar 1/v en función de 1/[S], el punto de intersección en el eje vertical vale 1/V máx y la intersección con el eje horizontal es -1/K M. ). 1 + 1 Factores que influyen en la velocidad de la reacción enzimática Determinación de sustratos (analitos) Seguimiento de las reacciones. Temperatura ph y composición de las soluciones buffer Activadores e inhibidores (act. ATPasas requieren Mg ++, amilasas requieren Cl - ; inhib. detergentes, metales pesados). Coenzimas: NADH, NADPH representan parte del centro activo de la enzima, de manera que participan directamente en la catálisis pero no se regeneran sino que se transforman estequiométricamente. Mediciones con oxidasas: se transfiere H desde el sustrato al 0 y se forma H 2 0 2 como intermediario. Luego éste reacciona con una leucobase en presencia de peroxidasa y se forma un colorante que se mide en el visible. 6
Ejemplos de mediciones con oxidasas: Determinación de glucosa Determinación de sacarosa Medición de Sacarosa Det. de almidón Medición de analitos con deshidrogenasa o reductasas vía la formación o consumo de NAD(P)H. Es ventajosa, ya que los coeficientes de extinción son perfectamente conocidos y las reacciones están libres de interferencias. Las formas reducidas de las coenzimas NAD y NADP absorben a 334, 340 y 365 nm, por lo tanto se puede medir su formación o consumo. 7
NAD y NADH NAD y NADH Ejemplos de mediciones con deshidrogenasas: Determinación de fructosa Determinación de glucosa 8
Determinación de sacarosa Ensayo para la determinación de Ácido Cítrico. (1) Citrato CL Oxaloacetato + acetato En presencia de L-malato deshidrogenasa (L-MDH) y lactato deshidrogenasa (L-LDH), el oxaloacetato y su producto descarboxilado (piruvato), se reducen a L- malato y L-lactato respectivamente por la nicotinamida adenina dinucleótido (NADH). (2) Oxaloacetato + NADH + H + L-MDH L-malato + NAD + (3) Piruvato + NADH + H + L-LDH L-lactato + NAD + Acoplamiento NADH-diaforasa: NADH/diaforasas: aumento de la sensibilidad Las reacciones de formación se acoplan a la reacción catalizada por diaforasa que transfiere H al iodonitrotetrazolio (INT). Se forma un colorante formazán que se mide en el visible. Sales de iodonitrotetrazolio: amarillentas reducción Formazán: rojizos Diformazanes: azules 9
soja arvejas Determinación de sustrato AOAC (a partir de 1995) L málico en jugo de manzana. glucosa / fructosa en vino. ácido cítrico en vino. CO 2 en vino. Almidón en cereales. 1-4 βd glucanos en cebada y avena, cereales listos para comer. Fibra Lactosa en leche Etanol en vinos Kits enzimáticos Determinación de la actividad enzimática Las determinaciones de actividad enzimática se realizan con una concentración de sustrato saturante, de esta manera la reacción es de orden cero, y la velocidad inicial de reacción es proporcional a la concentración enzimática. Cuando se consigue estar en esta zona de orden cero, la velocidad de aparición del producto es lineal con el tiempo. 10
Determinación de la actividad enzimática Determinación de la actividad enzimática Descenso de la concentración de sustrato. Aumento de uno de los productos Cambio de concentración de coenzimas. Es conveniente registrar la aparición de producto y no la disminución de sustrato, ya que éste se encuentra en altas concentraciones iniciales para asegurar saturación, y será menos sensible determinar la variación de su concentración que la del producto. Se trabaja a ph, T, y [buffer] óptimos. 11
Las curvas que relacionan la velocidad de formación del producto con la concentración de enzima son especialmente útiles en su tramo lineal. En éste la pendiente es: dv de = constante o = o [ P] t 1 donde v o es la velocidad inicial de formación de producto. La ecuación indica que v 0 es proporcional a [E 0 ] dv = constante de o = o [ P] t 1 12