DOCTORADO EN CIENCIAS MENCIÓN INGENIERÍA A GENÉTICA VEGETAL AISLAMIENTO DE UN cdna DE PAPAYA CHILENA QUE MUESTRA UNA ALTA HOMOLOGÍA CON EXPANSINAS Carlos Gaete-Eastman, Cristian Balbontín, Raúl Herrera & M. Alejandra Moya-León
Calidad de los frutos Buen color Buena textura Sin daños Sin infecciones Buen aroma Buen sabor
Durante la maduración n de los frutos se produce un descenso de la firmeza Intenso y/o rápidor ablandamiento corta vida de almacenaje productos elaborados de calidad deficiente
El l factor mas importante que contribuye al ablandamiento lo constituyen las modificaciones en la estructura de la pared celular (Gray et al, 1992) Cómo es la pared celular de un fruto?
La pared celular está compuesta por dos redes co-extensivas de polisacáridos (Buchanan et al, 2000)
El l factor mas importante que contribuye al ablandamiento lo constituyen las modificaciones en la estructura de la pared celular (Gray et al, 1992) Cuáles cambios? Solubilización y depolimerización de pectinas Depolimerización de hemicelulosas Pérdida de azúcares neutras Cuáles enzimas? poligalacturonasa pectina metilesterasa pectato liasa endo (1-4) β-d-glucanasa xiloglucano endo-transglicosidasa expansina (Giovannoni, 2001)
Expansinas Son proteínas de entre 25-28 28 kd Induce relajación n de la pared celular no hidrolítica ticamente, permitiendo su extensibilidad y una expansión n celular. (Cosgrove, 2000)
Existen 2 familias de expansinas (α( y β), con una limitada homología de secuencia. Se han identificado un grupo de expansinas asociadas a la maduración de diferentes frutos.
La papaya cultivada en Chile (Vasconcellea( pubescens) con centro de origen en Colombia y Ecuador 2n =18 Antitusivo y cicatrizante Agradable sabor y aroma Alto contenido de vitaminas (A, B y C) Antioxidantes Gran cantidad de proteasas
Determinación del descenso de firmeza de la papaya 6,5 6,0 5,5 Penetrómetro Firmeza (Kg) 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 0 2 4 6 8 10 12 14 Tiempo (Días)
Determinación del descenso de firmeza de la papaya 6,5 6,0 5,5 Penetrómetro Firmeza (Kg) 5,0 4,5 Metodología destructiva 4,0 Alta dispersión de los datos Colaboración Dr Per Bro 3,5 3,0 0 2 4 6 8 10 12 14 Tiempo (Días)
Preguntas Existen expansinas en Vasconcellea pubescens asociadas al proceso de maduración? Si es así, son homólogas a las expansinas aisladas en otras especies?
Métodos Se colectaron las muestras de papaya durante Marzo del 2004, en huertos comerciales en la localidad de Lipimávida (VII Región). Las muestras fueron almacenadas en una cámara a 20 C.
A partir de frutas maduras, se extrajo RNA total según Chang et al., 1993 Luego se sintetizó cdna de doble cadena utilizando el kit SMART (BD Bioscience) Se aisló la expansina de papaya mediante PCR, utilizando los siguientes partidores: EXPP F F 5 -ATG ATG-GGI-GGI-GCN-TGY-GGN-TAY-G-3 EXPP-R R 5 -YTG YTG-CCA-RTT-YTG-NCC-CCA-RTT-3 El fragmento amplificado fue aislado y purificado utilizando el sistema Gel Extraction Kit (Omega Bio-Tek Tek), clonado mediante el sistema TOPO TA Cloning (Invitrogen) y finalmente secuenciado en un secuenciador ALFexpress II (Amersham( Amersham). RNA Isolation cdna Synthesis RT-PCR Sequenciation Papaya sample Total RNA PCR product amplified using primers EXPP-F F y R
Resultados Como resultado de la secuenciación, obtuvimos un fragmento de 496 pb ATGGGGGGGGCCTGTGGTTACGGAAATCTGTACAGCCAAG GTTATGGGACAAACACTGCTGCACTAAGCACTGCTCTATTC AATAATGGGCTTGCTTGTGGAGCCTGTTTTGAAATTAAATG TGTGAATGATGGTAGGTGGTGTCTACCAGGATCTATCATGG TCACAGCAACAAATTTCTGCCCTCCAAACAATGCTCTTGCAA GCAATGCAGGAGGATGGTGTAACCCTCCTCTGCGTCATCTC GATCTCTCTCAGCCTGTTTTCCAGCACATAGCTCACTACAAA GCAGGAATCGTACCTGTCCAATACAGAAGGGTTAGTTGCAG GAAGAGTGCTGGGATTAGGTTCACCATAAACGGACACTCAT ACTTCAATCTKGTGCBAATAAGCAATGTTGGAGGAGCTGGC GATGTTGTGTCYGTATCCATCAAAGGTTYTAGGACTGGCTG GCAAGCCATGTYYCATAACTGGGGGTCAGAACTGGCAG
Análisis BLASTn % E Ident.. Value gi 29421117 dbj AB104442.1 Vitis labrusca x Vitis vinifera exp 1 84 9e-24 gi 14718274 gb AF226701.1 Fragaria x ananassa exp 4 83 7e-17 gi 16923360 gb AF319473.1 Cucumis sativus exp 7 83 3e-16 gi 16305104 gb AF367459.1 Prunus persica exp 1 83 2e-14 Análisis BLASTx gi 29421118 dbj BAC66694.1 Vitis labrusca x Vitis vinifera exp 1 83 1e-80 gi 14718275 gb AAK72875.1 Fragaria x ananassa exp 4 83 1e-79 gi 17484121 gb AAL40354.1 Prunus cerasus exp 5 83 1e-79 gi 10180019 gb AAG13983.1 Prunus avium exp 2 83 1e-79
El resultado de la traducción de la secuencia obtenida arroja un ORF de 174 aas. ORF 1 A L Met G G A C G Y G N L Y S Q G Y G T N T A A L S T A L F N N G L A C G A C F E I K C V N D G R W C L P G S I Met V T A T N F C P P N N A L A S N A G G W C N P P L R H L D L S Q P V F Q H I A H Y K A G I V P V Q Y R R V S C R K S A G I R F T I N G H S Y F N X V X I S N V G G A G D V V X V S I K G X R T G W Q A Met X H N W G S E L A E G X X P A H W G Resultado del análisis de motivos estructurales por MotifScan: prf: : EXPANSIN_EG45 pos. 4-116 E-value = 2,1e-23 23 pfam: : POLLEN_ALLERG_1 pos. 117-174 E-value= 2,8e-12
Se observa un alto grado de homología entre la secuencia de papaya y las presentes en otras especies. Se pueden identificar algunos de los residuos críticos para la función biológica propuesta. Se observan los dos dominios estructurales descritos para las expansinas.
Se observa un alto grado de homología entre la secuencia de papaya y las presentes en otras especies. Se pueden identificar algunos de los residuos críticos para la función biológica propuesta. Se observan los dos dominios estructurales descritos para las expansinas.
Análisis filogenético de genes de expansinas 79 C 55 100 A partir del alineamiento de las secuencias aminoacídicas deducidas de 39 secuencias de expansinas. 72 93 100 70 85 93 77 B 51 70 Mediante Clustal V y PAUP v4.0, utilizando MP y análisis bootstrap (1000 rep.) 96 74 67 65 100 80 D A 100
Conclusiones Se aisló un fragmento de un cdna con alta homología a con expansinas. El fragmento posee los dos dominios propuestos para las expansinas, con sus residuos aminoacídicos característicos. El análisis filogenético sitúa a a la expansina de papaya como miembro del subgrupo C, junto a otras α-expansinas asociadas a maduración.
Perspectivas Aislar y secuenciar el extremo 3 de la expansina de papaya. Analizar el patrón de expresión de la expansina de papaya. Correlacionar dicho patrón con cambios en la composición de hemicelulosas durante el ablandamiento de la papaya. Construir el modelo de la estructura tridimensional de la expansina de papaya (Colaboración Dr Danilo González)
Dominio1 Dominio 2
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Agradecimientos Financiamiento: Proyecto Fundación Andes C-13855/12. C Proyecto Mecesup TAL-105. Centro Regional en Biotecnología Colaboradores: Dr. Claudio Ramírez Lic. Mario Moya Lic. Carlos Figueroa Lic. Rubén Almada
Análisis fisiológico del proceso de maduración de la papaya Control Medición etileno 1-MCP Medición firmeza