Tesis para optar al título de Doctor en Biología Molecular y Biotecnología. UNSAM. Universidad Nacional de San Martín

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1 Tesis para optar al título de Doctor en Biología Molecular y Biotecnología UNSAM. Universidad Nacional de San Martín IIB-INTECH. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas- Instituto Tecnológico de Chascomús Título: Caracterización de la actividad β-xilosidasa en frutos climatéricos y no-climatéricos. Análisis de su expresión y regulación hormonal Nombre: Claudia A. Bustamante Directores: Gustavo A. Martínez y Pedro M. Civello Año: 2009

2 ÍNDICE Contenido Página Índice 1 Abreviaturas 4 Neologismos y palabras tomadas del inglés 6 1. Resumen 8 2. Introducción general Maduración de frutos carnosos Regulación de la maduración Actividad respiratoria Cambios de color Cambios de sabor Aroma Factores determinantes de la firmeza del fruto 2.2. Pared celular Componentes estructurales de la pared celular Enzimas y proteínas que modifican la pared celular β-xilosidasas Objetivos Objetivo general Objetivos particulares Frutilla Tomate Materiales y métodos Material vegetal Disección de frutos Búsqueda en una biblioteca de ADNc Clonado del ADNc completo Extracción de ADN genómico Clonado de la región promotora Secuenciación de ADN y análisis bioinformático Extracción de ARN total de frutilla y northern blot 4.9. Extracción de ARN total de tomate y RT-PCR semicuantitativa

3 4.10. Preparación de las sondas Medida de actividades enzimáticas Expresión heteróloga Tratamiento térmico Producción del anticuerpo anti-faxyl Purificación del anticuerpo anti-faxyl Extracción de proteínas totales y western blot Cromatografía de exclusión molecular en frutilla Cromatografía de exclusión molecular en tomate Medida de proteínas totales Tratamientos con hormonas en frutilla Tratamientos con hormonas en tomate Contenido de antocianinas Medidas de clorofilas Análisis estadístico APÉNDICE Capítulo I: Caracterización de la actividad β-xilosidasa en frutilla 42 (Fragaria x ananassa). Análisis de su expresión y regulación hormonal 5.1. Introducción El fruto de frutilla Degradación de la pared celular en frutillas Regulación hormonal en frutilla Resultados Clonado del ADNc completo de FaXyl Purificación de cuerpos de inclusión y obtención del anticuerpo anti-faxyl Actividad β-xilosidasa y expresión de FaXyl1 durante la 52 maduración Análisis por cromatografía de exclusión molecular Localización de la actividad enzimática y de FaXyl Actividad y estabilidad de la enzima recombinante Clonado de la región promotora de FaXyl Efecto de hormonas sobre la expresión de FaXyl1 y la actividad β- 63 xilosidasa Auxinas y giberelinas Acido abscísico 66 2

4 Etileno Oxido nítrico Acido salicílico Discusión Conclusiones Capítulo II: Caracterización de la actividad β-xilosidasa en tomate 83 (Solanum Lycopersicum). Análisis de su expresión y regulación hormonal 6.1. Introducción El fruto de tomate Degradación de la pared celular en tomate Actividad β-xilosidasa en tomate Regulación hormonal en tomate Mutantes de tomate y línea ACC-sintasa antisentido Resultados Actividad β-xilosidasa durante la maduración Expresión de LeXyl1 y LeXyl2 durante la maduración Análisis por cromatografía de exclusión molecular Efecto de hormonas sobre la actividad β-xilosidasa y la expresión 97 de LeXyl1 y LeXyl Etileno Auxinas y giberelinas Acido abscísico Discusión Conclusiones Conclusión general Referencias 109 3

5 ABREVIATURAS 1-MCP: 1-metilciclopropeno 32P-dATP: desoxiadenosina trifosfato marcada con 32 P α-af: α-arabinofuranosidasa β-gal: β-galactosidasa β-xil: β-xilosidasa ABA: ácido abscísico ACC: ácido 1-aminociclopropanocarboxílico ACO: ACC-oxidasa ACS: ACC-sintasa ACSas: ACC-sintasa antisentido ADN: ácido desoxirribonucleico ADNc: ácido desoxirribonucleico complementario ARN: ácido ribonucleico ARNasa: ribonucleasa ARNm: ácido ribonucleico mensajero BSA: albúmina sérica bovina CTAB: bromuro de hexadeciltrimetilamonio DEPC: dietil pirocarbonato DO: densidad óptica DPA: días post-antesis EDTA: ácido etilendiamintetracético EGasa: endoglucanasa GA 3: ácido giberélico IAA: ácido 3-indol acético IPTG: isopropil-tio-β-d-galactósido NAA: ácido naftalén acético PAL: fenilalanina amonio-liasa PCR: reacción en cadena de la polimerasa (polimerase chain reaction) PG: poligalacturonasa PL: pectato liasa PME: pectin metilesterasa PVP: polivinilpirrolidona PVPP: polivinilpolipirrolidona 4

6 RT-PCR: transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (reverse transcription and polimerase chain reaction) SA: ácido salicílico SAM: S-adenosil-L-metionina SAR: resistencia sistémica adquirida SDS: dodecil sulfato de sodio SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) SNP: nitroprusiato de sodio TCA: ácido tricloroacético UV: ultravioleta Xln: xilanasa XTH: xiloglucano endotransglucosidasa/hidrolasa 5

7 NEOLOGISMOS Y PALABRAS TOMADAS DEL INGLÉS Buffer: solución amortiguadora de ph, constituida por un par ácido-base conjugados. Kit: conjunto de piezas o instrumentos que sirven para realizar alguna función o desarrollar alguna actividad. Northern blot: técnica para detectar ARNm específicos en una mezcla. Western blot: técnica para detectar proteínas específicas en una mezcla. 6

8 1. RESUMEN 7

9 1. RESUMEN Las β-xilosidasas son exo-enzimas responsables de la hidrólisis de los xilanos presentes en la pared celular, liberando residuos de β-d-xilosa. A pesar del número creciente de trabajos relacionados con la degradación de la pared celular en frutos, es muy escasa la información referente al metabolismo de xilosa durante la maduración, tanto de frutos climatéricos como no-climatéricos. En este trabajo de tesis, intentamos profundizar en el estudio del metabolismo de los componentes de la pared celular que contienen xilosa utilizando frutilla como modelo de fruto no-climatérico y tomate como modelo de fruto climatérico. En frutilla, aislamos un clon de ADNc que codifica para una β-xilosidasa específica de fruto (FaXyl1) perteneciente a la familia 3 de las glicosil-hidrolasas. FaXyl1 actuaría en la matriz extracelular y sería procesada posttraduccionalmente como otras β-xilosidasas de plantas superiores. La proteína codificada por FaXyl1 posee elevada estabilidad térmica y actividad β-xilosidasa frente a sustratos artificiales. La comparación de variedades de firmeza contrastante indica que habría una clara correlación entre la expresión, los niveles de proteína y la actividad β-xilosidasa, y la velocidad de ablandamiento del fruto. La expresión del gen estaría bajo la influencia de hormonas implicadas en el proceso de ablandamiento del fruto. Los niveles de transcripto y proteína de FaXyl1 serían regulados positivamente por ABA y negativamente por NAA, GA 3 y etileno. Si bien nuestros resultados sugieren un posible rol de FaXyl1 en el ablandamiento del fruto, se requiere de trabajo adicional para poder establecer la acción in vivo de la enzima. En tomate, la actividad β-xilosidasa parece estar involucrada en los cambios que se producen en la pared celular durante el crecimiento del fruto, más que durante la maduración del mismo. Hasta el momento, se han clonado dos genes que codifican para β-xilosidasa en tomate, LeXyl1 y LeXyl2. Ambas isoenzimas podrían sufrir modificaciones post-traduccionales (procesamiento C- terminal) como ocurre con otras β-xilosidasas de plantas superiores, incluyendo frutilla. Los transcriptos de LeXyl1 y LeXyl2 serían regulados de manera diferencial durante el proceso de maduración del fruto. La expresión de ambas isoenzimas estaría regulada positivamente por etileno, y negativamente por auxinas y giberelinas, mientras que ABA regularía positivamente a LeXyl1 y no tendría efecto sobre la expresión de LeXyl2. 8

10 2. INTRODUCCIÓN GENERAL 9

11 2. INTRODUCCIÓN GENERAL 2.1. Maduración de frutos carnosos En las plantas superiores, una vez ocurrida la polinización y fecundación se produce el desarrollo de los frutos. Estos presentan una elevada diversidad en cuanto a formas y tamaños dado que cada especie vegetal los desarrolla a partir de distintas partes de la flor. De esta manera se pueden generar desde cápsulas secas, que permiten la dispersión de semillas, hasta frutos carnosos que han desarrollado colores brillantes y aromas complejos para atraer animales y pájaros que facilitan la dispersión de sus semillas (Barry y Giovannoni, 2007). Algunos de ellos, tales como tomate y uva, provienen del ovario, mientras que otros, tales como frutilla, ananá y manzana, derivan del receptáculo o de la expansión de los sépalos. El proceso de maduración está generalmente asociado con cambios de color, alteraciones en el metabolismo de azúcares, ablandamiento del fruto y cambios en la textura, síntesis de compuestos relacionados con el aroma, y aumento en la susceptibilidad al ataque por patógenos. Los numerosos cambios organolépticos que sufren los frutos carnosos durante la maduración los convierte en aceptables para su consumo, siendo la modificación de la textura y el ablandamiento progresivo uno de los cambios más notorios (Adams-Phillips y col., 2004a; Adams-Phillips y col., 2004b; Giovannoni, 2004) Regulación de la maduración Históricamente se ha clasificado a los frutos en climatéricos y noclimatéricos de acuerdo a la presencia o ausencia, respectivamente, de un incremento en la producción de etileno y en la actividad respiratoria durante la maduración. El aumento en la síntesis de etileno en los frutos climatéricos está asociado con el incremento en la expresión de los genes que codifican para enzimas involucradas en su síntesis (ACC-sintasa y ACC-oxidasa). Asimismo, el etileno dispara la transcripción de numerosos genes asociados con el proceso de maduración (Theologis y col., 1993). Sin embargo, a pesar de que el etileno es la hormona central y principal en la regulación de la maduración de estos frutos, existe un grupo de genes con regulación independiente de etileno (Alexander y Grierson, 2002; Lelievre y col., 1997). La presencia de estos genes no 10

12 dependientes de etileno y el descubrimiento de factores de transcripción de tipo MADS-box de características similares en frutos climatéricos y no-climatéricos sugiere la existencia de mecanismos reguladores comunes de la maduración en ambos tipos de frutos (Vrebalov y col., 2002). Además, el análisis de especies mutantes con la maduración alterada, y de la expresión de genes asociados al proceso de maduración sugiere la existencia de una compleja cascada de regulación que aún no ha sido dilucidada completamente (Giovannoni, 2004). La regulación de la maduración en frutos no-climatéricos es aún motivo de controversias. La frutilla ha sido considerada como el modelo a utilizar en el estudio de los frutos no-climatéricos. Durante mucho tiempo se ha considerado que el etileno no tiene un rol central en la maduración de frutilla, a la vez que se comprobó que las auxinas producidas en los aquenios reprimen la maduración del receptáculo y que la disminución de su concentración activa dicho programa (Given y col., 1988). Otros autores han sugerido que la disminución en la concentración de auxinas y el aumento simultáneo de ácido abscísico (ABA) son los factores determinantes de la maduración (Archbold y Dennis, 1984; Jiang y Joyce, 2003). Sin embargo, el reciente clonado de genes que codifican para receptores de etileno (Trainotti y col., 2005), el hallazgo de una pequeña producción de etileno al inicio de la maduración (Iannetta y col., 2006) y el retraso de algunos procesos de la maduración por acción del 1-metilciclopropeno (1-MCP) (Tian y col., 2000) han llevado a cuestionar la afirmación de que el etileno no tiene ningún rol en la maduración de frutilla Actividad respiratoria Durante la maduración, los frutos climatéricos muestran un pico en la actividad respiratoria (climaterio respiratorio), el cual está ausente en los frutos no-climatéricos. Los principales sustratos respiratorios encontrados en el fruto son los azúcares y los ácidos orgánicos. Ambos sustratos se localizan en la vacuola y contribuyen al sabor final del fruto. Los azúcares más comunes son fructosa, glucosa y sacarosa, y los ácidos orgánicos más relevantes, málico y cítrico (Tucker, 1993) Cambios de color La maduración de los frutos involucra, en la mayoría de los casos, la 11

13 modificación del color externo e interno de los mismos, provocada por la variación del contenido de pigmentos. Los principales pigmentos hallados en diversos frutos son clorofilas, antocianinas y carotenoides. En algunos frutos, al producirse la degradación de clorofilas se desenmascaran pigmentos preexistentes responsables del color del fruto maduro. Sin embargo, en la mayoría de los casos la desaparición de clorofilas es acompañada de la biosíntesis de otros pigmentos, usualmente carotenoides o antocianinas (Tucker, 1993). Las antocianinas son compuestos flavonoides sintetizados mediante la vía de los fenilpropanoides. Las mismas son hidrosolubles y se encuentran localizadas en la vacuola de la célula vegetal (Timberlake, 1981), y pueden adoptar diversos colores (desde el rojo al azul) según el ph del medio donde se encuentran. La antocianina más abundante en frutilla es pelargonidin-3- glucósido, aunque también han sido detectados pelargonidin-3-galactósido y cianidin-3-glucósido (Van Buren, 1970). Los carotenoides son compuestos terpenoides que se localizan en los cromoplastos y que son responsables de los colores rojo, anaranjado y amarillo de muchos frutos. Entre los carotenoides más frecuentes encontramos a β- caroteno y licopeno. En tomate, el carotenoide más abundante es el licopeno, el cual forma cristales dentro de los cromoplastos (Tucker, 1993) Cambios de sabor Los azúcares y los ácidos orgánicos contribuyen principalmente al sabor del fruto. En general, los niveles de ácidos orgánicos disminuyen durante la maduración debido a que los mismos son utilizados como sustrato de la respiración (Ulrich, 1970). Por el contrario, los niveles de azúcares dentro del fruto aumentan debido a un incremento en la importación de azúcares desde la planta o a la degradación de almidón dentro del fruto, dependiendo del tipo de fruto y de si el mismo maduró ligado a la planta o separado de ella Aroma Los compuestos volátiles son responsables del aroma característico de los frutos. La naturaleza de estas sustancias es diversa e incluye alcoholes, aldehídos, ésteres y muchos otros grupos de compuestos químicos (Nursten, 12

14 1970). El perfil de compuestos volátiles de un fruto es complejo. En frutilla se han identificado más de 360 compuestos volátiles, siendo los ésteres los que más contribuyen al aroma final del fruto (Menager y col., 2004) Factores determinantes de la firmeza del fruto El adecuado nivel de firmeza del fruto es un aspecto de calidad evaluado por el consumidor, a la vez que representa uno de los principales factores que determinan la vida post-cosecha del producto. La firmeza de los frutos está condicionada por varios factores, siendo uno de los principales la rigidez mecánica determinada por las paredes celulares (Harpster y col., 1997). La pared celular vegetal está formada por una red de microfibrillas de celulosa inmersas en una compleja matriz de pectinas y hemicelulosas (Brummell y Harpster, 2001). Durante la maduración, la acción combinada de diferentes proteínas y enzimas hidrolíticas sobre los componentes de la pared celular produce una disminución del contenido, solubilización y depolimerización de los mismos. La disminución y relajación de esta barrera mecánica no solo disminuye la firmeza del fruto sino que permite el ataque de los patógenos, particularmente en estadios de madurez avanzados Pared celular Las células vegetales se encuentran encapsuladas dentro de una compleja y fibrosa pared cuyas propiedades son fundamentales para determinar la forma y función de las células y tejidos vegetales. La pared celular actúa como un exoesqueleto que controla la forma celular y permite que se desarrolle una alta presión de turgencia. Además, participa en la adhesión, señalización celular, defensa y numerosos procesos de crecimiento y diferenciación (Cosgrove, 1997). Las paredes celulares se clasifican en primarias y secundarias. Las paredes celulares primarias se forman en las células en crecimiento y se las considera relativamente no especializadas y similares en arquitectura molecular en todos los tipos celulares. Por el contrario, las paredes celulares secundarias se forman luego de que el crecimiento celular ha cesado y pueden ser altamente especializadas en estructura y composición (Taiz y Zeiger, 1998). En la pared celular primaria, las microfibrillas de celulosa se encuentran embebidas en una matriz amorfa altamente hidratada (Figura 1). La matriz está 13

15 formada por dos grupos de polisacáridos denominados hemicelulosas y pectinas, más una pequeña cantidad de proteínas estructurales. Figura 1. Diagrama esquemático de los principales componentes estructurales de la pared celular primaria. RGI: ramnogalacturonano I. Adaptado de Taiz y Zeiger, Componentes estructurales de la pared celular La pared celular primaria está compuesta aproximadamente por un 25% de celulosa, 25% de hemicelulosas, 35% de pectinas y entre 1 y 8% de proteínas estructurales, sobre la base de peso seco. Sin embargo, estos valores pueden sufrir grandes variaciones de acuerdo a la especie y tejido analizado. En frutos carnosos, en general el contenido de pectinas puede ser mayor, llegando hasta un 50% (Fischer, 1991). La celulosa está formada por cadenas lineales de (1 4)-β-Dglucopiranosa asociadas entre sí a través de uniones no-covalentes, dando lugar a la formación de microfibrillas. Las microfibrillas poseen un grosor de 4 a 10 nm y están organizadas en dominios altamente cristalinos unidos a regiones amorfas menos organizadas (Figura 2). La celulosa posee una alta resistencia a los 14

16 esfuerzos de tensión, es insoluble, químicamente estable y relativamente resistente al ataque enzimático (Cosgrove, 1997). Figura 2. Modelo estructural de una microfibrilla de celulosa. La microfibrilla posee regiones altamente cristalinas unidas a regiones menos organizadas. Algunas hemicelulosas pueden quedar atrapadas dentro de la microfibrilla o estar unidas a su superficie. Adaptado de Taiz y Zeiger, Las hemicelulosas comprenden un grupo heterogéneo de polisacáridos flexibles que se unen a la superficie de la celulosa a través de puentes de hidrógeno (Figura 3). En la pared celular primaria de las dicotiledóneas, la hemicelulosa más abundante es el xiloglucano, constituido por un polímero lineal de (1 4)-β-D-glucopiranosa con cadenas laterales cortas conteniendo xilosa, galactosa y, frecuentemente, una fucosa terminal (Figura 3 A) (Mc Neil y 15

17 col., 1984; Fry, 1989). Dado que los xiloglucanos son más largos que el espacio entre las microfibrillas de celulosa, los mismos tienen el potencial de unirse a dos o más microfibrillas, contribuyendo a su entrelazamiento. Dependiendo de la etapa de desarrollo y de la especie, la fracción de hemicelulosas de la pared también contiene otros polisacáridos importantes tales como los xilanos y glucomananos. (A) Xiloglucano α- Fuc 1 2 α- Xil α- Xil α- Xil (1 4)-β- Glc -(1 4)-β- Glc -(1 4)-β- Glc -(1 4)-β- Glc -(1 4)-β- Glc -(1 4)-β- Glc -(1 4)-β- 2 β- Gal 1 (B) Xilanos -(1 4)-β- Xil -(1 4)-β- Xil -(1 4)-β- Xil -(1 4)-β- Xil -(1 4)-β- Xil -(1 4)-β- Xil -(1 4)-β- Xil O-Me-β- GlcA α- Ara (C) Glucomananos -β- Glc -(1 4)-β- Man -(1 4)-β- Man -(1 4)-β- Glc -(1 4)-β- Man-(1 4)-β- Man-(1 4)- Figura 3. Estructura de las hemicelulosas. (A) El xiloglucano está formado por una cadena lineal de (1 4)-β-D-glucopiranosa con cadenas laterales conteniendo xilosa (Xil), galactosa (Gal) y fucosa (Fuc). (B) Los xilanos están constituidos por una cadena lineal de (1 4)-β-D-xilosa. Pueden tener también cadenas laterales de arabinosa (Ara), ácido 4-Ometilglucurónico (4-O-Me-β-GlcA), u otros azúcares. (C) Los glucomananos poseen una cadena lineal que alterna un residuo de β-d-glucosa (Glc) con dos residuos de β-dmanosa (Man). 16

18 Los xilanos están formados por una cadena lineal de (1 4)-β-D-xilosa asociada a cadenas laterales de ácido 4-O-metilglucurónico y arabinosa, las cuales están presentes en cantidades variables en glucuronoxilanos y arabinoxilanos, respectivamente (Figura 3 B). Los glucomananos se encuentran frecuentemente en las paredes celulares secundarias, especialmente de coníferas. Poseen una cadena lineal que alterna un residuo de β-d-glucosa con dos residuos de β-d-manosa (Figura 3 C) (Taiz y Zeiger, 1998). Las pectinas forman un gel en el cual la red celulosa-hemicelulosa está embebida. Al igual que las hemicelulosas, las pectinas también constituyen un grupo heterogéneo de polisacáridos que contienen característicamente azúcares ácidos tales como los ácidos galacturónico y glucurónico (Figura 4). Algunas pectinas contienen una estructura primaria relativamente simple tal como el homogalacturonano (Figura 4 A), formado por un polímero lineal de ácido (1 4)- α-galacturónico. El ramnogalacturonano I (RG I) (Figura 4 B) está formado por un disacárido de ramnosa y ácido galacturónico que se repite, y cadenas laterales largas de arabinanos, galactanos, arabinogalactanos y homogalacturonano (Figura 4 C). Otras pectinas menos abundantes y altamente complejas son los ramnogalacturonanos II (RG II), los cuales contienen al menos diez azúcares diferentes y un patrón complicado de uniones (Darvill, 1978). Las proteínas estructurales son clasificadas de acuerdo a su composición predominante de aminoácidos en glicoproteínas ricas en hidroxiprolina, proteínas ricas en glicina, proteínas ricas en prolina, etc. (Tabla 1). La mayoría de estas proteínas están glicosiladas. Las mismas poseen estructuras primarias altamente repetitivas y se convierten en insolubles durante la maduración celular o en respuesta a heridas. Tabla 1. Proteínas estructurales de la pared celular Clase % de carbohidratos Localización HRGP (glicoproteína rica en prolina) ~ 55 Floema, cámbium PRP (proteína rica en prolina) ~ 0-20 Xilema, fibras, córtex GRP (proteína rica en glicina) 0 Xilema 17

19 (A) Homogalacturonano (B) Ramnogalacturonano I (RG I) -α- GalA -(1 2)-α- Rha -(1 4)-α- GalA -(1 2)-α- Rha -(1 4)-α- GalA-(1 2)-α- Rha -(1 4)- X X Cadenas laterales de arabinano y galactano (C) Cadenas laterales en RGI 1- Arabinanos -α- Ara -(1 5)-α- Ara -(1 5)-α- Ara -(1 5)-α- Ara -(1 5)-α- Ara -(1 5)-α- Ara -(1 5)-α- Ara α- Ara α- Ara α- Ara 2- Arabinogalactano I -β- Gal -(1 4)-β- Gal -(1 4)-β- Gal -(1 4)-β- Gal -(1 4)-β- Gal -(1 4)-β- Gal -(1 4)-β- Gal α- GalA -(1 4)-α- GalA -(1 4)-α- GalA -(1 4)-α- GalA -(1 4)-α- GalA -(1 4)-α- GalA -(1 4)- 1 1 α- Ara -(1 5)-α- Ara -(1 5)-α- Ara α- Ara Figura 4. Estructura de las pectinas más comunes. (A) El homogalacturonano consiste de una cadena lineal de ácido (1 4)-α-galacturónico (GalA). Los residuos carboxilo se encuentran con frecuencia metil-esterificados. (B) El ramnogalacturonano I (RG I) es una pectina muy grande y heterogénea, compuesta de una cadena lineal de ácido (1 4)-αgalacturónico (GalA) y (1 2)-α-ramnosa (Rha). Las cadenas laterales, de longitud muy variable, están unidas a los residuos de ramnosa y están compuestas principalmente de arabinanos y galactanos. Los residuos de ácido galacturónico se encuentran frecuentemente metil-esterificados. (C) Ejemplos de cadenas laterales en RG1. 1: Arabinanos: son moléculas altamente ramificadas compuestas principalmente de arabinosa (Ara). 2: Arabinogalactano I: tiene una cadena lineal de residuos de galactosa (Gal) y cadenas laterales conteniendo arabinosa (Ara). 18

20 Las proteínas estructurales varían en cuanto a su abundancia dependiendo del tipo celular, el estadio de desarrollo y la estimulación previa de la planta (heridas, ataque de patógenos, etc.). La pared celular contiene además otro tipo de proteínas estructurales denominadas proteínas con arabinogalactano (AGP), las cuales son solubles en agua, están altamente glicosiladas y podrían participar en diversos procesos del desarrollo (Pennell y Roberts, 1990) Enzimas y proteínas que modifican la pared celular. En los últimos años, se han estudiado en profundidad numerosas enzimas y proteínas que pueden actuar sobre polímeros de la pared celular de los frutos, en búsqueda de aquellas que pudieren considerarse claves en el proceso de ablandamiento (Brummell y Harpster, 2001; Giovannoni, 2001; Buchanan y col., 2000; Lashbrook, 2005). Entre las enzimas que depolimerizan pectinas y favorecen su solubilización se incluyen: - Poligalacturonasas (PG): son enzimas que catalizan la hidrólisis de uniones galacturónido y pueden ser del tipo endo (EC ) o exo (EC ). Aunque ambos tipos de enzima se encuentran en fruto, sólo las enzimas de tipo endo son específicas de la maduración (Hadfield y Bennett, 1998). Los homogalacturonanos son los principales sustratos de PG. Los mismos son secretados a la pared celular con un alto porcentaje de metil-esterificación en el C-6, por lo que deben ser de-esterificados antes de convertirse en sustrato para las poligalacturonasas (Jarvis, 1984; Carpita y Gilbeaut, 1993). - Pectin metilesterasas (PME): los poligalacturonanos son incorporados a la pared celular con un elevado porcentaje de metil-esterificación. Las PME (EC ) de-esterifican los poliurónidos removiendo los grupos metilo de la posición C-6 de los residuos de ácido galacturónico presentes en pectinas de alto peso molecular. La de-metilación cambia el ph y la carga en la pared celular, permite el agregado de poliurónidos a través de puentes de calcio y torna susceptibles a los poliurónidos frente a la acción de las poligalacturonasas (Carpita y Gilbeaut, 1993; Pressey y Avants, 1982). 19

21 - Pectato liasas (PL): las PLs (EC ) catalizan la ruptura de pectinas de-esterificadas a través de un mecanismo de β-eliminación. Las mismas requieren la presencia de iones calcio para ejercer su acción y producen oligosacáridos con residuos de ácido galacturónico no-saturado en el extremo noreductor de los mismos (Carpita y Gilbeaut, 1993). - β-galactosidasas (β-gal): uno de los mayores cambios que se producen en la pared celular durante la maduración de los frutos es la pérdida de residuos de galactosa (Gross, 1984). Este proceso sería catalizado por exo-β-dgalactosidasas (EC ), las cuales remueven residuos de β-d-galactosa a partir del extremo no-reductor de β-d-galactósidos. Los posibles sustratos in vivo de estas enzimas son los (1 4)-β-galactanos, presentes en las fracciones pécticas, y residuos β-d-galactosilo presentes en las cadenas laterales del xiloglucano (Balasubramaniam y col., 2005). - α-arabinofuranosidasas (α-af): las α-l-arabinofuranosidasas (EC ) actúan sobre diferentes fracciones pécticas y hemicelulósicas liberando residuos de arabinosa a partir del extremo no-reductor (Tateishi y col., 1996). La previa acción de esta enzima sería necesaria para la hidrólisis completa de algunos polímeros de la pared, tales como los arabinoxilanos, por xilanasas y β- xilosidasas. En pera japonesa, se demostró que la expresión de un gen codificante para una α-l-arabinofuranosidasa es específica de fruto y que se incrementa durante la maduración (Tateishi y col., 2005). A pesar de que PG y PME están claramente asociadas al catabolismo de pectinas, trabajos realizados en líneas transgénicas antisentido de tomate con actividad reducida o nula de PG y PME han mostrado que la expresión de ambas enzimas no es necesaria ni suficiente para inducir el ablandamiento (Brummell y Harpster, 2001). Sin embargo, dado que en general los frutos de distintas especies presentan características distintivas, el efecto de un tipo de enzima puede ser altamente dependiente de la especie en estudio, por lo que las generalizaciones a otras especies pueden no ser válidas (Buchanan y col., 2000). Otras pectinasas, como PL de frutilla (Jiménez-Bermúdez y col., 2002) y β-dgalactosidasa II de tomate (Smith y col., 2002) juegan papeles críticos en la pérdida de firmeza de esos frutos, aunque probablemente no constituyen la única causa del ablandamiento de los mismos. 20

22 Entre las enzimas responsables del metabolismo de las hemicelulosas se pueden mencionar: - Endo-β-1,4-glucanasas (EGasa): estas enzimas catalizan la hidrólisis de enlaces internos de cadenas de glucanos unidos por enlaces β-1,4 adyacentes a residuos no-sustituidos. En la pared celular, se piensa que el sustrato natural de EGasa (EC ) es el xiloglucano (Palomer y col., 2006). - Xiloglucano endotransglicosidasas (XET): estas enzimas hidrolizan las uniones internas de las cadenas de (1 4)-β-D-glucano del xiloglucano y transfieren el nuevo extremo reductor formado a la posición C-4 de la unidad de glucosa en el extremo no-reductor de otro polímero u oligosacárido de xiloglucano, con retención de la configuración anomérica del enlace glucosídico. Las XETs (EC ) son altamente específicas del xiloglucano tanto como sustrato dador como aceptor, aunque el grado de sustitución de la subunidad aceptora afecta fuertemente la eficiencia de la reacción (Fry y col., 1992). - Xilanasas (Xln): son enzimas que hidrolizan los enlaces β-1,4- glicosídicos entre residuos de D-xilosa adyacentes en la cadena principal de los xilanos para producir xilooligosacáridos. La mayoría de las Xln (EC ) hidrolizan la cadena principal en regiones donde el sustrato no está sustituido (Ronen y col., 1991). - β-xilosidasas (β-xil): las β-xil (EC ) liberan residuos de xilosa a partir del extremo no-reductor de los xilooligosacáridos producidos por Xln, conservando la configuración β (Ronen y col., 1991). - Endo-β-mananasas: son enzimas que hidrolizan los enlaces β-1,4 entre residuos de manosa presentes en la cadena principal de mananos y heteromananos no-sustituidos (Mo y Bewley, 2003). En tomate, la actividad mananasa ha sido implicada en la degradación de la pared celular del endosperma, rica en mananos, durante la germinación de las semillas (Mo y Bewley, 2002). - β-galactosidasas (β-gal): como se describió previamente, las β- galactosidasas liberan residuos de galactosa a partir de polímeros pécticos, así 21

23 como también hemicelulósicos. - α-arabinofuranosidasas (α-af): como fue mencionado anteriormente, las α-l-arabinofuranosidasas actúan sobre diferentes polímeros, tanto pécticos como hemicelulósicos, liberando residuos de arabinosa. En tomate, la expresión de al menos dos EGasas, LeCel1 y LeCel2, se incrementa con la maduración. Sin embargo, la supresión de cada uno de estos genes no produce diferencias detectables en la firmeza del fruto (Brummell y col., 1999; Lashbrook y col., 1998). Si bien la actividad XET ha sido detectada en tomate, su rol en el ablandamiento del fruto no ha sido claramente establecido. De hecho, la supresión antisentido del gen LeXETB1, relacionado con la maduración en tomate, no produjo cambios en el ablandamiento del fruto con respecto a plantas control (Brummell y Harpster, 2001). La completa hidrólisis de los xilanos requiere la acción de endo-β-1,4-xilanasas y β-xilosidasas. Estas enzimas que degradan polisacáridos ricos en xilosa pueden estar involucradas en el proceso de maduración, permitiendo no sólo la solubilización o movilización de polímeros hemicelulósicos de la pared celular, sino su reorganización en otros polímeros de menor peso molecular que podrían participar como sustratos en otros caminos metabólicos (Buchanan y col., 2000). Las xilanasas y las β- xilosidasas no han sido estudiadas en detalle en frutos, aunque ambas actividades han sido registradas en paltas maduras (Ronen y col., 1991). La presencia de β-xilosidasa ha sido además verificada en tomate (Itai y col., 2003), pera japonesa (Itai y col., 1999), durazno (Bounaris y Niavis, 1992), aceituna (Bolaños y col., 1995) y frutilla (Martínez y col., 2004). Las expansinas son proteínas de la pared celular sin actividad hidrolítica conocida, que poseen la capacidad de provocar la extensión de paredes celulares aisladas (McQueen-Mason y Cosgrove, 1995). Se postula que las mismas actúan en la interfase celulosa-hemicelulosa debilitando las uniones no-covalentes (principalmente puentes de hidrógeno) establecidas entre ambos polímeros (McQueen-Mason y Cosgrove, 1995). En frutos, se ha propuesto la participación de las mismas en el proceso de ablandamiento (Brummell y col., 1999) y se ha descrito el incremento de la expresión de expansinas específicas durante la maduración de numerosos frutos, incluidos tomate (Rose y col., 1997) y frutilla (Civello y col., 1999). 22

24 2.3. β-xilosidasas La estructura química de los arabinoxilanos y los xilanos de la pared celular está sujeta a modificaciones durante el crecimiento y el desarrollo de las plantas. Particularmente, se ha descrito la modificación de estos componentes durante la germinación de las semillas, la abscisión de órganos y el desarrollo y maduración de los frutos (Beldman y col., 1996; Cleemput y col., 1995). Los xilanos consisten de una cadena lineal de (1 4)-β-D-xilopiranosa asociada a cadenas laterales de ácido 4-O-metilglucurónico y arabinosa que están presentes en cantidades variables en glucuronoxilanos y arabinoxilanos, respectivamente (Carpita y McCann, 2000). La degradación de los xilanos, cuya cantidad es variable entre distintas especies, ocurre a través de la acción coordinada de una variedad de enzimas, incluyendo las endo-β-1,4-xilanasas (EC ), las cuales hidrolizan los enlaces β-1,4-glicosídicos entre residuos de D-xilosa adyacentes en la cadena principal para producir xilooligosacáridos, y las β- xilosidasas (EC ), que hidrolizan xilooligosacáridos para liberar xilosa (Cleemput y col., 1997). Si bien los genes que codifican para β-xilosidasas han sido extensivamente estudiados en hongos y bacterias (Margolles-Clark y col., 1996; Pérez-González y col., 1998; van Peij y col., 1997), es muy escasa la información disponible de estas enzimas en plantas. Recientemente, se clonaron genes de pera y frutilla, específicos de fruto, que codificarían para una de ellas (Itai y col., 1999; Martínez y col., 2004). Asimismo, en Arabidopsis thaliana se ha demostrado que un gen putativo de β-xilosidasa (AtBXL1) está fuertemente involucrado en el metabolismo de hemicelulosas de la pared celular secundaria y en el desarrollo de la planta (Goujon y col., 2003). 23

25 3. OBJETIVOS 24

26 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo general El objetivo general del trabajo es caracterizar el patrón de expresión de la enzima β-xilosidasa durante la maduración de un fruto no-climatérico (frutilla) y de otro climatérico (tomate). Esta enzima está involucrada en el catabolismo de componentes de la pared celular que contienen xilosa, y ha sido poco estudiada, particularmente en frutos Objetivos particulares Frutilla Obtener el ADNc completo de FaXyl1 y realizar la búsqueda de nuevos genes de β-xilosidasa. Expresar FaXyl1 en E. coli y obtener anticuerpos. Caracterizar la expresión de FaXyl1 durante la maduración de variedades de frutilla con firmeza contrastante. Estudiar el efecto de distintos reguladores de crecimiento sobre la expresión de FaXyl Tomate Analizar la actividad β-xilosidasa y los niveles de ARNm de LeXyl1 y LeXyl2 durante la maduración de variedades de tomate silvestres, mutantes y antisentido para la enzima ACC-sintasa. Estudiar el efecto del etileno y de otras hormonas sobre la actividad β- xilosidasa y los niveles de ARNm de LeXyl1 y LeXyl2. 25

27 4. MATERIALES Y MÉTODOS 26

28 4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1. Material vegetal Se utilizaron frutillas (Fragaria x ananassa Duch.) de las variedades Camarosa y Toyonoka cuyos frutos poseen tasas de ablandamiento contrastantes. Los estadios de madurez se clasificaron de acuerdo al tamaño y coloración externa del fruto en: verde pequeño (VP), verde grande (VG), blanco (B), 25% rojo (25% R), 50% rojo (50% R), 75% rojo (75% R) y 100% rojo (100% R). Se trabajó con tomates (Solanum lycopersicum) de la variedad Rutgers, silvestre y las líneas mutantes rin, nor y Nr las cuales tienen un patrón de maduración alterado; asimismo, se utilizó la variedad VF36, silvestre y una línea antisentido para la ACC-sintasa de modo de poseer frutos con producción reducida de etileno. Los estadios de madurez analizados fueron verde maduro (VM) y rojo maduro (M), correspondientes a 48 y 56 días post-antesis, respectivamente. Los frutos se cosecharon y usaron inmediatamente o se congelaron en N 2 (l) y se guardaron a -20 ºC hasta su empleo Disección de frutos de frutilla Se obtuvieron discos de la zona ecuatorial de frutos de Toyonoka en estadio VG, B, 50% R y 100% R, y los mismos se dividieron en dos zonas diferentes (externa e interna). La zona externa se obtuvo separando el tercio externo del receptáculo, mientras que la zona interna se definió como los dos tercios centrales remanentes (Vicente y col., 2005). Las muestras se congelaron en N 2 (l) y se guardaron a -20 ºC hasta su empleo Búsqueda en una biblioteca de ADNc de frutilla Utilizando como sonda un fragmento de FaXyl1 marcado con α- 32 P-dATP (ver punto 4.10) se inició la búsqueda del ADNc completo de FaXyl1, así como también de nuevos genes de β-xilosidasa, en una biblioteca de ADNc de frutos maduros (Fragaria x ananassa Duch., cv Chandler). Para ello, se obtuvieron 5 x 10 5 placas de lisis las cuales se transfirieron a membranas de nailon Hybond-N+ (Amersham-Pharmacia). Las membranas se incubaron durante 4 h a 42 ºC con 27

29 una solución conteniendo formamida 50% v/v, SSPE 5X, Denhardt s 1X, SDS 0,2% p/v y ADN de esperma de salmón 150 μg ml -1 y luego se hibridaron durante toda la noche a 42 ºC con el agregado de la sonda marcada. Las membranas se lavaron con 25 ml de SSC 1X y SDS 0,1% p/v una vez a 42 ºC y dos veces a 50 ºC durante 30 min, y se expusieron a una placa radiográfica (X- OMAT AR, Kodak) con una pantalla intensificadora a -80 ºC. Las placas positivas se purificaron por medio de dos rondas adicionales de plaqueo. Finalmente, se provocó la liberación in vivo de los fagémidos de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Stratagene) y los clones se secuenciaron mediante el servicio de secuenciación del Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (UNSAM, Argentina) Clonado del ADNc completo de FaXyl1 La obtención del extremo 5 de FaXyl1 se llevó a cabo utilizando el sistema BD Smart TM RACE cdna Amplification Kit (Clontech) a partir de ARN de frutos de Toyonoka 75% R. La amplificación de dicho extremo se llevó a cabo utilizando los oligonucleótidos GSP1 y NGSP1, específicos de FaXyl1, el oligonucleótido universal UPM provisto en el kit (Tabla 2, pág. 40) y BD Advantage 2 Polymerase Mix (Clontech), de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. El producto de PCR se purificó a partir de un gel de agarosa 0,8% p/v por medio de columnas GFX (Amersham Biosciences), se clonó en el plásmido pgem-t easy vector (Promega) y se secuenció Extracción de ADN genómico de frutilla Un gramo de hojas jóvenes de la variedad Toyonoka se trituraron en N 2 (l). Se agregaron 10 ml del siguiente medio de extracción precalentado a 65 ºC: CTAB 3% p/v, PVP 2% p/v, Tris-HCl 1 M (ph 8,0), EDTA 20 mm, NaCl 1,4 M y β- mercaptoetanol 2% v/v. Se incubó a 65 ºC durante 30 min mezclando por inversión cada 5 min. A 750 µl de esta mezcla se le agregó igual volumen de cloroformo:alcohol isoamílico en relación 24:1 y se mezcló por inversión. Se centrifugó a x g durante 10 min a temperatura ambiente y se colectó el sobrenadante. Se agregó igual volumen de isopropanol y se incubó a -20 ºC durante 2 h. Luego de ese periodo, se centrifugó a x g por 10 min y se secó el precipitado. El mismo se disolvió en 100 µl de H 2O d estéril a 65 ºC y se 28

30 agregó 1 µl de ARNasa A (usb) 10 mg ml -1. Se incubó a 37 ºC y luego de 15 min, la reacción se detuvo con el agregado de 100 µl de cloroformo:alcohol isoamílico en relación 24:1. Se centrifugó a x g durante 10 min y el ADN se precipitó durante 2 h a -20 ºC con el agregado de 2,5 volúmenes de etanol. Se centrifugó a x g por 20 min, se secó el precipitado y se disolvió en 35 µl de H 2O d a 65 ºC. La integridad de las muestras de ADN genómico se verificó en un gel de agarosa 0,7% p/v Clonado de la región promotora de FaXyl1 A partir de ADN genómico de frutilla, se aisló un fragmento perteneciente a la región promotora de FaXyl1 utilizando el sistema BD Genome Walker Universal Kit (Clontech). La amplificación del fragmento se realizó utilizando oligonucleótidos específicos de FaXyl1 (X1 y X2), oligonucleótidos específicos de secuencias que actúan como adaptadores (AP1 y AP2) y la enzima Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen), de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Tabla 2, pág. 40). El producto de PCR se purificó a partir de un gel de agarosa 1,5% p/v por medio de columnas GFX (Amersham Biosciences), se clonó en el plásmido TOPO TA Cloning Vector (Invitrogen) y se secuenció Secuenciación de ADN y análisis bioinformático La secuenciación se realizó con un secuenciador Applied Biosystems ABI 377 (Servicio de secuenciación del Instituto de Investigaciones Biotecnológicas, UNSAM, Argentina). Los análisis de secuencia se llevaron a cabo usando los programas Edit- Seq y Megalign (DNASTAR 4.05). Los dominios glicosil-hidrolasa se identificaron en la base de datos GenBank. La predicción de la localización subcelular y el péptido señal de la proteína FaXyl1 se realizó mediante la utilización de los programas PSORT ( y SIGNALP ( Los sitios potenciales de N- glicosilación se localizaron mediante el programa NetNGlyc ( La región promotora de FaXyl1 se analizó mediante la utilización de los programas PLANTCARE ( y PLACE ( 29

31 4.8. Extracción de ARN total de frutilla y análisis mediante northern blot Se extrajo ARN total de frutilla utilizando el método del borato en caliente (Wan y Wilkins, 1994). Cada muestra de ARN (10 μg) se analizó por electroforesis en geles desnaturalizantes de agarosa 1,1% p/v y formaldehído 1% v/v. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio para evaluar la cantidad de ARN a través del nivel de fluorescencia de cada calle frente a la exposición a luz UV. La intensidad de las bandas correspondientes a los ARN ribosomales se utilizó como control de carga. Luego de la corrida electroforética, el ARN se transfirió por capilaridad a membranas de nailon Hybond-N+ (Amersham-Pharmacia) durante toda la noche usando una solución SSC 20X. Al día siguiente, el ARN se fijó a la membrana por incubación durante 2 h a 80 ºC, seguida por la exposición a radiación UV (UV- Stratalinker Modelo 1800; Stratagene). Las membranas se incubaron con 25 ml de una solución conteniendo formamida 50% v/v, SSPE 5X, Denhardt s 1X, SDS 0,2% p/v y ADN de esperma de salmón 150 μg ml -1, y posteriormente se hibridaron toda la noche a 42 ºC con el agregado de la sonda marcada radioactivamente (ver punto 4.10). Las membranas se lavaron con 25 ml de SSC 1X y SDS 0,1% p/v una vez a 42 ºC y dos veces a 50 ºC durante 30 min y se expusieron a una placa radiográfica (X-OMAT AR, Kodak) con una pantalla intensificadora a -80 ºC. En algunos casos, las membranas se hibridaron con una sonda para detectar ARNr 18S de modo de establecer un control de carga Extracción de ARN total de tomate y RT-PCR semicuantitativa Se extrajo ARN total de tomate utilizando el protocolo adaptado por Chang y col. (1993). La integridad de las muestras de ARN se verificó por electroforesis en geles desnaturalizantes de agarosa 1% p/v y formaldehído 1% v/v. La síntesis de la primera hebra de ADNc se llevó a cabo usando la siguiente mezcla de reacción: 2 μg de ARN, 330 pmoles de oligonuclétidos al azar (Biodynamics) y H 2O d tratada con DEPC en cantidad necesaria para un volumen final de 18,3 μl. La mezcla se desnaturalizó a 70 ºC durante 10 min y se enfrió rápidamente en hielo. Posteriormente, se agregaron los demás componentes: 200 U de transcriptasa reversa M-MLV (Promega), buffer de reacción de la enzima 1X y dntps 30 μm en un volumen final de 25 μl. La reacción se realizó a 37 ºC durante 90 min y luego se incubó a 90 ºC durante 10 min para inactivar la 30

32 enzima. El ADNc obtenido se guardó a -20 ºC hasta su utilización. Los productos de ADNc se amplificaron por PCR usando 1 μl del producto de transcripción reversa como molde, 2,5 μl de buffer de reacción de la enzima, MgCl 2 1,5 mm, dntps 50 μm, 10 pmoles de oligonucleótidos y 0,625 U de Taq polimerasa (Fermentas) en un volumen final de 25 μl. Para LeXyl1 se usaron los oligonucleótidos TF1 y TR1 (Tabla 2, pág. 40) y el siguiente programa de PCR: un ciclo de 5 min a 94 ºC; 16, 22, 28 y 34 ciclos de 45 s a 94 ºC, 45 s a 62 ºC y 1 min a 72 ºC; un ciclo a 72 ºC durante 7 min. En el caso de LeXyl2, se utilizaron los oligonucleótidos TF2 y TR2 (Tabla 2, pág. 40) y el programa de PCR consistió en: un ciclo de 5 min a 94 ºC; 16, 22, 28 y 34 ciclos de 45 s a 94 ºC, 45 s a 56 ºC y 1 min a 72 ºC; un ciclo a 72 ºC durante 7 min. Para corregir diferencias de carga se utilizó ARNr 17S, el cual se amplificó con los oligonucleótidos Rib5 y Rib3 (Tabla 2, pág. 40) y el siguiente programa de PCR: un ciclo de 5 min a 94 ºC; 15, 20, 25, 30 y 35 ciclos de 45 s a 94 ºC, 45 s a 60 ºC y 1 min a 72 ºC; un ciclo a 72 ºC por 7 min. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en geles de agarosa 1% p/v, se desnaturalizaron con una solución NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M durante 30 min, se neutralizaron durante 30 min en una solución conteniendo NaCl 1,5 M, Tris-HCl 0,5 M (ph 7,5), y se transfirieron por capilaridad a una membrana de nailon Hybond-N+ (Amersham-Pharmacia) durante toda la noche utilizando una solución SSC 20X. El ADN se fijó por irradiación UV usando un UV-Stratalinker Modelo 1800 (Stratagene). Las membranas se incubaron con 25 ml de una solución conteniendo formamida 50% v/v, SSPE 5X, Denhardt s 1X, SDS 0,2% p/v y ADN de esperma de salmón 150 μg ml -1 y posteriormente se hibridaron toda la noche a 42 ºC con el agregado de la sonda marcada radioactivamente (ver punto 4.10). Las membranas se lavaron con 25 ml de SSC 1X y SDS 0,1% p/v una vez a 42 ºC y dos veces a 50 ºC durante 30 min y se expusieron a una placa radiográfica (X-OMAT AR, Kodak) con una pantalla intensificadora a -80 ºC. La intensidad de las bandas se analizó con el programa Gel-Pro Analyzer (Media Cybernetics, Maryland, EEUU) para determinar la zona de linealidad de los productos de amplificación. Se eligieron los ciclos 28 para LeXyl1 y LeXyl2 y 25 para ARNr 17S, respectivamente Preparación de las sondas La sonda para detectar FaXyl1 se preparó a partir del clon de ADNc 31

33 (Número de acceso: AY486104). Para ello, se procedió a la digestión del mismo con la enzima EcoRI (Promega), dando lugar a un fragmento de 736 pb que se purificó a partir de un gel de agarosa 1,2% p/v por medio de columnas GFX (Amersham Biosciences); el fragmento purificado se utilizó como molde para sintetizar la sonda radiactiva mediante la técnica de cebado al azar ( random priming ). A tal fin, se usaron 100 ng de ADN molde (previamente calentado a 100 ºC durante 5 min y enfriado en hielo por 5 min), 5 μl de buffer de reacción de la enzima 10X, dctp 20 μm, dgtp 20 μm, dttp 20 μm, 558 pmoles de oligonucleótidos al azar (Biodynamics), 2 μl de BSA acetilada 10 mg ml -1, 5 U de fragmento Klenow (Promega) y 4 μl de α- 32 P-dATP 10 mci ml -1 en un volumen final de 50 μl. La reacción se llevó a cabo a 37 ºC durante 1 h. Luego de este periodo, la sonda radioactiva se separó del α- 32 P-dATP no incorporado usando una columna de Sephadex G-50 equilibrada con buffer TE. Finalmente, la sonda marcada radioactivamente se desnaturalizó a 100 ºC durante 5 min y se enfrió rápidamente en hielo por 5 min antes de ser agregada al tubo de hibridación correspondiente. En el caso de FaCel1, la sonda se preparó de modo similar a partir de un fragmento de 318 pb obtenido por PCR de acuerdo a Harpster y col. (1998). Las sondas para detectar LeXyl1 y LeXyl2 se prepararon a partir de los clones de ADNc cedidos gentilmente por Itai (Itai y col., 2003). La sonda LeXyl1 se preparó por amplificación de un fragmento de 423 pb utilizando los oligonucleótidos TF1 y TR1, y la sonda LeXyl2 se obtuvo por amplificación de un fragmento de 296 pb usando los oligonucleótidos TF2 y TR2 (Tabla 2, pág. 40). Dichos fragmentos se purificaron y utilizaron como molde en la producción de una sonda marcada con 32 P. La sonda para detectar ARNr 18S se preparó por amplificación de un fragmento de 193 pb a partir del clon de frutilla (Número de acceso: X15590) y los oligonucleótidos Rib5 y Rib3 (Tabla 2, pág. 40). La sonda para detectar ARNr 17S se preparó por amplificación de un fragmento de 191 pb a partir del ADNc obtenido en el punto 4.9 y los oligonucleótidos Rib5 y Rib3 (Tabla 2, pág. 40) Medida de actividades enzimáticas Diez gramos de tejido (frutos de frutilla o tejido de pericarpio de tomate) se homogeneizaron con 30 ml de buffer NaAc/HAc 0,05 M, NaCl 1 M, PVPP 1% p/v, 32