Categorías de Escherichia coli diarreigénico Clasificación Esta se basa en: La interacción que establecen con la mucosa intestinal. Los distintos factores de virulencia codificados en cromosomas, plásmidos, fagos, trasposones. El síndrome clínico que producen Los diferentes serotipos O:H dentro de cada categoría.
Escherichia coli diarreagénico ETEC E. coli enterotoxigénico EPEC E. coli enteropatogénico EAEC E. coli enteroagregativo EIEC E. coli enteroinvasivo EHEC E. coli enterohemorrágico DAEC E. coli de adherencia difusa
Mecanismo de la infección por Escherichia coli diarreigénico Colonización de la mucosa intestinal Evasión de las defensas del huésped Multiplicación Daño celular del huésped
Escherichia coli enterotoxigénico (ETEC) Factores de colonización (CFs) Especificidad antigénica CFA (Antígeno factor de colonización) CS (Antígeno de superficie de coli) PCF (Probable factor de colonización) Longus Morfología Fimbrias Fibrillas Helicoides Manojo (bundle-forming ) Adhesinas no fimbriadas
Factores de colonización de ETEC
Enterotoxinas LT y ST de ETEC LT ST
Mecanismo de patogenia de ETEC LT ST
Áreas de riesgo de diarrea del viajero asociada a ETEC Alto riesgo Intermedio Bajo riesgo
Mecanismo de patogenia Escherichia coli enteropatógeno EPEC
EPEC - Lesión A/E
EPEC Adherencia localizada
Mecanismo de patogenia Escherichia coli enteroagregativo EAggEC ADHESINAS FIMBRIAS AAFI AAFII EASTI AAFIII
Adherencia de EAggEC
Mecanismo de patogenia Escherichia coli enteroinvasivo EIEC
Mecanismo de patogenia Escherichia coli de adherencia difusa DAEC Factores de adherencia Familia adehesinas afa Adhesina AIDA-1
Adherencia difusa
Transmisión Persona a persona por la vía fecal-oral Ingesta de alimentos contaminados Dosis infectiva Varía de 10 8-10 9 UFC (ETEC, EPEC) a 10-10 2 UFC (EHEC, EIEC)
Características clínicas de la diarrea por Escherichia coli diarreigénico Diarrea acuosa o mucosa, vómitos y poca fiebre: ETEC, EPEC, EAEC, DAEC, EIEC, y EHEC en una primera etapa. Diarrea hemorrágica: EIEC, EAEC, y EPEC EHEC, en una segunda etapa.
Escherichia coli diarreigénico Estrategias de detección Flora normal Categorías de E. coli diarreigénico Factores de virulencia específicos
Serotipificación Detección de Categorías de DEC Ensayos con animales Asa ligada de conejo (ETEC) Sereney (EIEC) Ensayos fenotípicos que correlacionan con factores de virulencia Adherencia cultivo celular (EPEC, EAEC, STEC, DAEC) ELISA (ETEC, STEC, EIEC) Detección molecular Hibridación sondas genéticas (EPEC, EAEC, STEC, DAEC) PCR (EPEC, EAEC, STEC, ETEC, EIEC, DAEC)
Toma de muestra para el diagnóstico de la infección por DEC Muestra para realizar coprocultivo Evacuación espontanea Recolectar 2 g de materia fecal con una espátula y colocarla en un recipiente estéril. Conservar refrigerada a 4ºC hasta su procesamiento. Si la muestra no es procesada dentro de las 2 horas de recolectada, utilizar medio de transporte (Cary-Blair, Stuart,) conservar a 4ºC. Hisopado rectal Tomar la muestra con hisopo, conservarlo en un medio de transporte y mantenerlo a 4 C hasta su procesamiento. Si el niño usa pañal, tomar la muestra que queda en el mismo con hisopo o con espátula. Recomendaciones a)recolectar la materia fecal lo antes posible después del establecimiento de la diarrea. b)el paciente no debe estar con tratamiento antibiótico. Recolectar la muestra después de suspender la antibioticoterapia por no menos de 48 horas.
Sistema de triple envase para el envío de material infeccioso Las muestras deben ser enviadas según las Normas de Bioseguridad que corresponden al transporte de muestras clínicas.
Algoritmo para el diagnóstico y caracterización de ETEC, EPEC, EAEC, EIEC, y STEC Materia fecal (suspensión) Tamizaje PCR múltiple Nº1 eae / lt / st zona de confluencia colonias lactosa (-) y lactosa (+) eae (+) Aislamiento EPEC PCR Nº1 Positiva lt / st (+) Aislamiento ETEC Agar MacConkey (MAC) 37ºC x 18 h aggr (+) Aislamiento EAEC Tamizaje PCR múltiple Nº2 aggr / IpaH / stx 1 / stx 2 zona de confluencia colonias lactosa (-) y lactosa (+) PCR Nº2 Positiva IpaH (+) Aislamiento EIEC Agar MacConkey Sorbitol (SMAC) stx 1 / stx 2 (+) Aislamiento STEC 37ºC x 18 h CTS 37ºC x 6 h SMAC 37ºC x 18 h CT-CTS 37ºC x 6 h SMAC 37ºC x 18 h Continuar con los procedimientos de diagnóstico y caracterización de STEC O157 y no-o157 a partir de especimenes clínicos PCR Confirmación Identificación Bioquímica Seroagrupamiento
Estrategia de detección Cultivo y PCR múltiple Siembra directa Hisopado rectal...... PCR Agar MAC Incubación a 37º por 18 hs
Toma de muestra para realizar PCR múltiple Nº1 (eae / lt / st) y Nº2 (aggr / IpaH / stx 1 / stx 2 ) Placa de MAC Muestra de zona de cultivo confluente MAC Grillado Pool de colonias no fermentadoras de lactosa........ Pool de colonias fermentadoras de lactosa PCR Tamizaje
EPEC / ETEC PCR múltiple eae / lt / st Primer Secuencia del primer (5-3 ) Tamaño del fragmento de amplificación (pb) Paso Nº 1 2 Etapa Desnaturalización Desnaturalización Temperatura ºC 94 94 Tiempo 5 min 30 seg Va al paso Nº Nº veces SK1 CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC 864 SK2 CCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG LT-L TCTCTATGTGCATACGGAGC 322 LT-R CCATACTGATTGCCGCAAT AL-65 TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG 147 AL-125 CCTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC 3 Pegado de primers ó 56 annealing 4 Extensión 72 5 Extensión 72 6 Pausa 4 1 min 1 min 2 min 2 29 Referencias eae lt Toma C. 2003. (EPEC, ETEC, EAEC) st
STEC / EIEC / EAEC PCR múltiple aggr / ipah / stx 1 / stx 2 Primer Secuencia del primer (5-3 ) Tamaño del fragmento de amplificación (pb) IpaH8B GTTCCTTGACCGCCTTTCCGA 619 IpaH15B GCCGGTCAGCCACCCTCTGAG aggrks1 GTATACACAAAAGAAGGAAGC 254 aggrkas2 ACAGAATCGTCAGCATCAGC stx1a GAAGAGTCCGTGGGATTACG 130 stx1b AGCGATGCAGCTATTAATAA stx2a TTAACCACACCCCACCGGGCAGT 346 stx2b GCTCTGGATGCATCTCTGGT Paso Nº Etapa Temperatura ºC Tiempo 1 Desnaturalización 94 5 min 2 Desnaturalización 94 30 seg Va al paso Nº Nº veces 3 Pegado de primers ó annealing 58 30 seg 4 Extensión 72 30 seg 2 29 5 Extensión 72 2 min 6 Pausa 4 Referencias Toma C. 2003. (EAEC) Sethabutr O. 1994. (EIEC) stx 1 stx 2 ipah aggr Leotta G. 2005. (STEC)
Resultados posibles de la PCR múltiple Nº1 (eae / lt / st) y Nº2 (aggr / IpaH / stx 1 / stx 2 ) Confluencia y pool de colonias positivas PCR de colonias individuales 1º grilla Confluencia positiva y pool de colonias negativas PCR seleccionando nuevas colonias 2º grilla Confluencia y pool de colonias negativas Muestra negativa
Algoritmo para el diagnóstico y caracterización de ETEC, EPEC, EAEC, EIEC, y STEC Materia fecal (suspensión) Agar MacConkey (MAC) 37ºC x 18 h Tamizaje PCR múltiple Nº1 eae / lt / st zona de confluencia colonias lactosa (-) y lactosa (+) Tamizaje PCR múltiple Nº2 aggr / IpaH / stx 1 / stx 2 zona de confluencia colonias lactosa (-) y lactosa (+) PCR Nº1 Positiva PCR Nº2 Positiva eae (+) Aislamiento EPEC lt / st (+) Aislamiento ETEC aggr (+) Aislamiento EAEC IpaH (+) Aislamiento EIEC stx 1 / stx 2 (+) Aislamiento STEC PCR Confirmación Identificación Bioquímica Seroagrupamiento
Identificación bioquímica Pruebas Bioquímicas Categoría EPEC /ETEC/ EAEC Medio de cultivo Fermentación de glucosa + Agar triple azúcar y hierro (TSI) Fermentación de + TSI lactosa Fermentación de + TSI sacarosa - TSI Formación de H 2 S Producción de gas + TSI Utilización del citrato - Citrato de Simmons Producción de indol + Sulfuro, indol, movilidad (SIM) Movilidad Móvil / no móvil SIM Actividad + Disco con glucurónido β-glucuronidasa Actividad lisina + (90) * Lisina Hierro Agar (LIA) decarboxilasa Actividad ornitina decarboxilasa + (95) Movilidad, indol, ornitina. (MIO) Según Manual of Clinical Microbiology (7 ed). 1999
Pruebas Bioquímicas Microorganismo Medio de cultivo EIEC Shigella spp Shigella sonnei Fermentación de glucosa +(100) +(100) +(100) Agar triple azúcar y hierro (TSI) Fermentación de +(25) - +(2) TSI lactosa Fermentación de +(15) - +(1) TSI sacarosa Formación de H 2 S - - - TSI Producción de gas +(5) (2) - TSI Utilización del citrato - - - Citrato de Simmons Producción de indol +(80) +(50) - Sulfuro, indol, movilidad (SIM) Movilidad +(5) - - SIM Actividad +(45) +(2) +(90) Disco con o-nitrofenil-β-dβ-galactosidasa galactósido (ONPG) Actividad lisina + (40) - - Lisina Hierro Agar (LIA) decarboxilasa Actividad ornitina + (20) +(1) +(98) Movilidad, indol, ornitina. decarboxilasa (MIO) Según Farmer JJ. et al. J. Clin. Microbiol. 1985. 21: 46-76. Utilización del acetato +(40) +(2) - Prueba del acetato Fermentación D- +(75) +(30) +(2) Fermentación azúcares Sorbitol Fermentación de D- +(70) +(2) +(2) Fermentación azúcares Xilosa Fermentación de +(40) +(2) - Fermentación azúcares Dulcitol Fermentación de +(30) - +(10) Fermentación azúcares Mucato Fermentación de salicina +(10) - - Fermentación azúcares
Seroagrupamiento Incubar colonias caracterizadas en un medio de cultivo como agar TSA. Realizar suspensión bacteriana con SF y hervir 1 hora. Realizar seroagrupamiento con antisueros polivalentes y monovalentes según disponibilidad y categoría.
Recomendaciones para la detección de ETEC, EPEC, EAggEC, DAEC y EIEC Tener en cuenta las características clínicas de la diarrea Vía de transmisión o fuente de infección Realizar la identificación bioquímica de E. coli Identificar características bioquímicas de la cepa Ejemplo: Lactosa (-), Movilidad (-), LIA (-), E. coli / Shigella? Técnicas de Biología molecular para detectar factores de virulencia Enviar aislamiento, datos del paciente, y las características mencionadas, al Laboratorio de Referencia para la identificación final
DIAGNOSTICO DIFERENCIAL DE CEPAS DE Escherichia coli ENTEROINVASIVA POR PRUEBAS BIOQUIMICAS Y MOLECULARES Autores: Servicios Fisiopatogenia y Enterobacterias del INEI y Servicio de Sueros y antígenos del INPB Carlos G. Malbrán Objetivo: Identificar y caracterizar cepas EIEC aisladas en el período 1994 2003 mediante la aplicación de pruebas bioquímicas diferenciales, seroagrupamiento y métodos moleculares. Materiales y métodos: 102 cepas EIEC, PCR para la detección del gen ipah, pruebas bioquímicas y seroagrupamiento con antisueros O. Resultados: El resultado de PCR ipah fue positivo en las 102 cepas E. coli analizadas. O136 5% Otros 8% O112 4% O143 12% Serogrupos EIEC ONT 10% O124 23% Otros: O18, O44, O144 O28 38% O28 O124 O143 O136 O112 Otros ONT Porcentaje de positividad (%) PRUEBA BIOQUIMICA EIEC E. coli * Shigella spp.* Triptofano 100 98,0 50,0 SH2 (SIM) 0 0 0 Producción de indol 80,0 98,0 50,0 ONPG 100 95,0 2,0 Movilidad 0 95,0 0 Rojo de Metilo 100 100 100 Voges-Proskauer 0 0 0 Citrato de Simmons 0 0 0 Citrato de Christensen 26,4 76,4 2,0 Acetato (utilización) 68,6 90,0 2,0 Mucato (fermentación) 10,8 10,8 0 Esculina (hidrólisis) 5,9 35,0 0 Arginina dihidrolasa 33,3 17,0 5,0 Lisina descarboxilasa 39,2 90,0 0 Ornitina descarboxilasa 59,8 65,0 1,0 Arabinosa (fermentación) 96,1 99,0 60,0 Dulcita (fermentación) 14,7 60,0 2,0 Glucosa (ácido) 100 100 100 Glucosa (gas) 100 95,0 2,0 Lactosa (fermentación) 78,4 95,0 30,0 Maltosa (fermentación) 97,0 95,0 50,0 Rafinosa (fermentación) 29,4 50,0 50,0 Ramnosa (fermentación) 72,5 80,0 5,0 Sacarosa (fermentación) 16,7 50,0 0 Salicina (fermentación) 15,7 40,0 0 * Datos obtenidos de Manual of Clinical Microbiology. Murray et al. 2003
Caracterización molecular de aislamientos de Escherichia coli diarreigénico en la Ciudad de Corrientes Autores: Patricia Esquivel et al (Cátedra de Microbiología UNNE) Lugar: Ciudad de Corrientes Objetivo: Caracterizar por PCR los aislamientos de E.coli diarreigénicos de casos ocurridos en la Ciudad de Corrientes Metodología: PCR múltiple para ETEC, EPEC, EIEC, EaggEC y STEC (Toma y col J Clin Microbiol 2003) Resultados: 40/ 104 muestras (61 niños y 43 adultos) positivas ETEC 10,5% ; EaggEC 8,8 %; STEC 7,0%; EPEC 5,3% y EIEC 3,5%. EaggEC más frecuente en niños (11,3%) y ETEC en adultos (11,6%)
Caracterización molecular de aislamientos de Escherichia coli diarreigénico recuperadas de fuentes de agua de la provincia del Chaco Autores: Losch et al (Cátedra de Microbiología UNNE) Lugar: Provincia del Chaco Objetivo: Determinar la distribución de los aislamientos de E.coli diarreigénicos en ambientes acuáticos (superficiales, subterraneas y de red) de la provincia del Chaco Metodología: PCR múltiple para ETEC, EPEC, EIEC, EaggEC y STEC (Toma y col J Clin Microbiol 2003) Resultados: 54 muestras de agua 7/ 54 EaggEC 13% (5 de aguas superficiales y 2 de fuentes subterráneas) 1 / 54 EPEC 1,8% (fuentes subterráneas)
2010 - Total país de Muestras tivas Número Posit 140 120 100 80 60 40 20 0 Diarreas por E. coli: Agentes identificados por SE E. coli enteropatógeno (EPEC) E. coli enteroinvasivo (EIEC) E. coli No-O157 productor de toxina Shiga (STEC) E. coli O157 % Positivos bacterianas 100% 80% 60% 40% 20% 0% % Pos sitivos 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 Semana Epidemiológica