Tierra Tropical (2007) 3 (1): 85-97

Tierra Tropical (2007) 3 (1): 85-97 ALMACENAMIENTO DE SEMILLAS DE DIFERENTES ESPECIES DE ORQUÍDEAS PARA SU CONSERVACIÓN EN UN BANCO DE GERMOPLASMA II. DESHIDRATACIÓN, ALMACENAMIENTO Y PRUEBAS DE VIABILIDAD DE LAS SEMILLAS C. Ossenbach 1, J. Arce 1, J. Warner 2 1 Universidad EARTH. Las Mercedes de Guácimo, Limón, Costa Rica 2 Jardín Botánico Lankester, Universidad de Costa Rica. Cartago, Costa Rica Recibido 15 de enero 2003. Aceptado 12 de diciembre 2006. RESUMEN El almacenamiento de semillas representa un potencial como conservación ex situ de especies de orquídeas neotropicales en peligro de extinción. El objetivo de este segundo estudio fue el de evaluar diferentes condiciones de almacenamiento de semillas de orquídeas a corto plazo. El lugar de estudio fue el Laboratorio de Ciencias Naturales de la Universidad EARTH, CR. Se comparó la eficiencia del LiCl con la del CaCl 2 como desecantes para aumentar la longevidad de las semillas a -20 C, 5 C, 25 C y 60 C. Se evaluaron dos tipos de empaque: sobres de papel encerado y viales de vidrio. Se evaluaron algunas de las metodologías de pruebas de viabilidad mencionadas en la literatura incluyendo un pretratamiento con Ca(OCl) 2, una incubación adicional en verde de malaquita y una prueba de semillas que flotaban y no flotaban. El uso de LiCl y CaCl 2 fueron recomendables como desecantes si se realiza un almacenamiento a temperaturas entre -20 C y 5 C para el primero y de 5 C para el segundo. El almacenamiento de semillas en viales de vidrio produjo una pérdida de viabilidad menor que el almacenamiento en sobres de papel. El pretratamiento con Ca(OCl) 2 afectó a las especies evaluadas, reduciendo su viabilidad significativamente. Las pruebas de tetrazolio con y sin el uso de verde de malaquita no muestran diferencias considerables. Ambos métodos son válidos, sin embargo, no es necesaria una tinción con verde de malaquita para lograr una buena observación de los embriones. La precisión de los resultados de las pruebas se ve influida por la capacidad del analista que los interpreta. Las semillas de las especies estudiadas que flotan y que no flotan no se diferencian mucho en cuanto a su porcentaje de viabilidad y de embriones. Palabras clave: almacenamiento, orquídeas, semillas, tetrazolio, verde de malaquita, viabilidad. ABSTRACT The storage of seeds represents a potential as an ex situ conservation for endangered neotropical orchid species. The objective of this study was to evaluate different short-term storage conditions of orchid seeds to extend their viability, at the Natural Sciences Laboratory, EARTH University. The efficiency of LiCl was compared with that of CaCl 2 as desiccants to increase the longevity of seeds at -20 C, 5 C, 25 C and 60 C. Two types of storage envelopes were evaluated: waxed paper envelopes and glass vials. Different viability tests mentioned in the literature were evaluated including a pretreatment with Ca(OCl) 2, an additional treatment with malachite green and a seed test to see if they float. 1 Contacto: Jorge Arce (j-arce@earth.ac.cr) ISSN: 1659-2751

86 Ossenbach et al. / Tierra Tropical (2007) 3 (1): 85-97 Dehydration with both desiccants, LiCl and CaCl 2, was recommended for storage at -20 C and 5 C for the first and 5 C for the second. Seeds stored in glass vials preserved their viability longest. Pretreatment with Ca(OCl) 2 affected the species tested, significantly reducing their viability. The same results were obtained in the tests with tetrazolium with or without the malachite green. Both methods are valid; however, it was not necessary to stain with malachite green in order to be able to identify the embryos. The precision of the results are influenced by the ability of the analyst to interpret the information. The ability of the seeds to float or not was not a good indicator of the percentage of viability or of embryos. Key words: Storage, orchids, seeds, tetrazolium, malachite green, viability. INTRODUCCIÓN Las orquídeas, por su variabilidad genética, tienen una gran importancia ecológica, tanto para la flora como para la fauna silvestre. Debido al alto peligro de extinción que presentan, se hace necesaria la evaluación de métodos eficientes de preservación de germoplasma. En la conservación in situ se corre un mayor riesgo de perder esta variabilidad, por lo que la conservación ex situ adopta un papel predominante en estas situaciones (Arditti, 1992). Para el almacenamiento de las semillas por periodos de meses o años, se deben conservar a una temperatura de 4 C, con excepción de aquellas que poseen embriones sin pigmento, las cuales deberán mantenerse a -20 C (Böhm, 1996). Hicks (2000) recomienda almacenar las semillas en sobres individuales de papel dentro de un contenedor cerrado que contenga en una esquina un frasco de boca grande con una solución saturada de cloruro de calcio y agua, lo cual proveerá a 4 C un 30 % de humedad relativa. Mantener los empaques individuales en un contenedor mayor cerrado también previene cambios de humedad cuando la refrigeradora se abre y cierra con mucha frecuencia (Böhm, 1996). El papel permite una mayor respiración de la semilla, por lo que se puede controlar mejor la humedad (Hicks, 2000). Entre los tipos de papel o sobres que se pueden utilizar para empacar las semillas están el papel para calcar (papel cebolla), papel encerado o papel para pesar. Por otro lado, Seaton (2000) prefiere secar las semillas con cloruro de calcio o cloruro de litio entre 3 a 4 días a temperatura ambiente y posteriormente guardarlas en viales herméticos en refrigeración o congelación. De esta manera se evita el intercambio gaseoso y la humedad se mantiene constante si el vial se conserva cerrado. Segun Böhm (1996), viales de plástico no deben ser usados, debido a sus efectos electroestáticos. El término de viabilidad se emplea para definir si una semilla está viva y si tiene capacidad para germinar. Este concepto no toma en cuenta el vigor, es decir, el potencial de la semilla para una emergencia rápida y uniforme y el desarrollo de la plántula bajo un vasto rango de condiciones. Para determinar la viabilidad de la semilla hay varias pruebas que se pueden utilizar, entre las cuales la prueba con tetrazolio (TZ) es la más común (Colbry et al., 1986). La mayoría de los esfuerzos enfocados a conservación provienen de regiones templadas y no de zonas tropicales o subtropicales. Esto refleja la necesidad de idear un sistema práctico de manejo de bancos de germoplasma que se pueda adaptar a los países Latinoamericanos. El almacenamiento de semillas de orquídeas aún no ha sido muy desarrollado, debido a la falta de información acerca de este tema. Sin embargo, existe un alto potencial si se toma en cuenta que la alta demanda de semilla de orquídeas a nivel internacional puede contribuir al financiamiento

Ossenbach et al. / Tierra Tropical (2007) 3 (1): 85-97 87 del banco de germoplasma, a la dispersión y preservación de las especies, así como a aumentar la diversidad genética del mismo banco. En este segundo estudio, los objetivos fueron la comparación de la eficiencia del LiCl con la del CaCl 2 como desecantes para aumentar la longevidad del las semillas a -20 C, 5 C, 25 C y 60 C, la evaluación de dos tipos de empaque: sobres de papel encerado y viales de vidrio y la evaluación de algunas de las metodologías de pruebas de viabilidad mencionadas en la literatura. Las especies de orquídeas estudiadas fueron Acineta densa, Blettia purpurea (Lam.) D.C., Cattleya aurantiaca (Batem.) Lindl., Cattleya skinneri Batem., Encyclia ceratistes (Lindl.) Schltr., Encyclia ochracea (Lindl.) W.E. Higging, Epidendrum baumannianum Schitr., Epidendrum pseudoepidendrum Rchb. f., Epidendrum radicans Lindl., Epidendrum ramosissimum Ames & C. Schweinf., Epidendrum stamfordianum Batem., Gongora tricolor (Lindl.) Rchb. f., Isochilus amparoanus Schltr., Maxillaria bracteata (Schitr.) Ames & Correll, Pleurothallis sp., Oerstedella centradenia Rchb. f., Scaphyglottis pulchella (Schitr.) L. O. Williams, Schomburgkia lueddemannii Prill., Sobralia sp. y Stanhopea wardii Lodd. ex Lindl. MATERIALES Y MÉTODOS El estudio se efectuó en el Laboratorio de Ciencias Naturales de la Universidad EARTH, localizada a 10 12' 45" latitud N, 83 39' 56" longitud O y 59 m.s.n.m, con una humedad relativa promedio de 90 %, una precipitación promedio de 3000 mm por año y una temperatura promedio de 25 C. Una vez cosechada las cápsulas del primer estudio (Ossenbach, 2001), en el laboratorio se procedió a cortar el extremo que sostiene los remanentes de los pétalos de la flor, ya que éstos se encuentran muy contaminados (Hicks, 2000). Posteriormente se abrió la cápsula, siguiendo las líneas longitudinales, ya sea estirándolas con los dedos, en el caso de cápsulas maduras, o con un bisturí, en el caso de frutos verdes. Las cápsulas se golpeaban con los dedos o con un objeto no cortante sobre papel encerado, preferiblemente sobre un fondo blanco para permitir un mayor contraste y así facilitar la observación de las semillas. A la semilla recuperada se le retiraron partículas de suciedad o remanentes de la misma cápsula con una pinza. No se utilizaron semillas de distintos colores, ya que, según Hicks (2000), es posible que cambios de color sean debidos a la contaminación por bacterias. Para el análisis del efecto de desecantes y temperatura en el almacenamiento y conservación de las semillas, se le redujo el contenido de humedad en las semillas antes de almacenarlas a la temperatura deseada. Como desecante se empleó el cloruro de calcio dihidratado (CaCl 2 2H 2 O) y anhídrico (CaCl 2 ) en una solución saturada con agua destilada. Se evaluaron dos soluciones de humedad constante sugeridas por Seaton (2000) para determinar si se justifica el uso del cloruro de litio (LiCl) en sustitución del CaCl 2. Las muestras se colocaron sobre un plato petri dentro de un desecador de vidrio durante 4 días. Se evaluaron cuatro temperaturas: -20 C, 5 C, 25 C y 60 C (Cuadro 1). Una temperatura de 60 C permite acelerar el proceso de envejecimiento y así pronosticar el comportamiento de la semilla en el futuro. Las especies evaluadas en este ensayo fueron Acineta densa, Blettia purpurea, Encyclia ceratistes, Gongora tricolor y Sobralia sp. Un testigo (sin desecante) se realizó en Acineta densa a temperatura ambiente (T9). Las muestras fueron almacenadas en viales de vidrio. La cantidad de semilla que se colocó en cada vial fue de aproximadamente 0.2 g. Se realizaron pruebas de viabilidad en la fecha de entrada de las muestras al laboratorio y después de transcurridas una, ocho y 16 semanas. Los tratamientos 4 y 8 se evaluaron a los 3 meses, debido a la reducida longevidad por encontrarse almacenadas a una temperatura de 60 C.

88 Ossenbach et al. / Tierra Tropical (2007) 3 (1): 85-97 Cuadro 1. Tratamientos para el análisis del efecto de desecantes y temperatura en el almacenamiento y conservación de las semillas. Tratamiento Temperatura Desecante T1-20 C CaCl 2 T2 5 C CaCl 2 T3 25 C CaCl 2 T4 60 C CaCl 2 T5-20 C LiCl T6 5 C LiCl T7 25 C LiCl T8 60 C LiCl T9 25 C Sin desecante Se evaluaron como tratamientos dos tipos de empaque para semillas de orquídeas, los viales de vidrio herméticos sugeridos por Seaton (2000) y los sobres de papel de calca o papel encerado preferidos por Hicks (2000). Las primeras muestras se constituyeron de semillas provenientes de cápsulas mixtas. Las muestras posteriores constaron únicamente del contenido de una sola cápsula, no se mezclaron semillas de dos o más cápsulas. En ambos tratamientos se utilizaron muestras similares de semillas, es decir, que una misma mezcla de semillas de una especie se utilizó tanto para el tratamiento 1 como para el tratamiento 2. La cantidad de semilla que se tomó para cada muestra fue de aproximadamente 0.2 g. Se dobló el papel encerado en la forma de un sobre para cartas. La temperatura de almacenamiento fue de 5 C. Las especies evaluadas en este ensayo fueron B. purpurea, C. aurantiaca, C. skinneri, E. ceratistes, E. ochracea, E. baumannianum, E. radicans, E. ramosissimum, E. pseudoepidendrum, E. stamfordianum, I. amparoanus, M. bracteata, O. centradenia, Pleurothallis sp., R. trichoglossa, S. pulchella, S. lueddemannii y S. wardii. Se realizaron pruebas de viabilidad en la fecha de entrada de la muestra al laboratorio y luego de una semana, de 12 semanas y de 20 o 24 semanas después de la entrada. Para las pruebas de viabilidad se siguió la metodología de Böhm (1996), la cual consiste en preparar una solución al 1 % de tetrazolio (cloruro de 2,3,5-trifenil-2-H tetrazolio, C 19 H 15 CIN 4 ) con agua destilada. Para mantener un ph de 6-7, se le adicionó una solución amortiguadora a base de fosfatos: 0.9 % Na 2 HP0 4 2H 2 0 + 1.1 % KH 2 P0 4. Además, se le agregó un par de gotas de Tween 80. Esta solución se guardó en un frasco ámbar en la refrigeradora. Con el objetivo de evaluar los efectos del pretratamiento con hipoclorito de calcio (Ca(OCl) 2 ) y del uso de verde de malaquita (C 23 H 25 CIN 2 ) como un post tratamiento, se realizaron pruebas con y sin el uso de estos reactivos. Las especies evaluadas en este ensayo fueron E. ochracea, E. radicans, E. ramosissimum, E. pseudoepidendrum y Pleurothallis sp. Cuando se realizaron las pruebas, las semillas fueron

Ossenbach et al. / Tierra Tropical (2007) 3 (1): 85-97 89 incubadas con 3-5 ml de esta solución en un tubo de ensayo durante 18 a 24 horas a 25 C - 30 C en la oscuridad. La cantidad de semillas a utilizar fue de aproximadamente la cantidad que ocupa el volumen de medio grano de arroz o entre 0.0002 y 0.0008 g. Para el pretratamiento con Ca(OCl) 2, se siguió la metodología del Royal Botanical Garden (2001). Ésta consiste en utilizar una solución de Ca(OCl) 2 al 5 % (p/v). Las semillas se mantuvieron en esta solución durante dos horas y posteriormente se dejaron en agua destilada estéril por 24 horas. Finalmente se prosiguió con la incubación en tetrazolio. El verde de malaquita se preparó en una solución al 0.01 % con agua destilada. Posterior a la incubación en tetrazolio, se enjuagó la semilla con agua destilada, retirando la solución de tetrazolio con una pipeta. Las semillas se incubaron entonces en la nueva solución de verde de malaquita durante 30 a 45 minutos. Esta solución se filtró antes de cada prueba. Para realizar los conteos de semillas viables se colocó sobre un portaobjeto una muestra de semillas tomada del tubo de ensayo con una pipeta, y se colocó un cubreobjetos cuadriculado a mano con un marcador permanente fino. El aumento utilizado fue de 40x y de 100x para semillas muy pequeñas. El condensador se acercó por completo al plato del microscopio y el diafragma se abrió lo suficiente para permitir la visibilidad del color rojo de los embriones viables. También se usó un estereoscopio con un aumento de 30x, colocando la muestra sobre un plato petri invertido a fin de elevarla y permitir una mejor observación. Se contaron 300 semillas con ayuda de un contador manual, distinguiendo las semillas con embriones teñidos de rojo (semillas viables), semillas con embriones sin teñir (o verdes, en el caso de utilizar verde de malaquita y semillas vanas). Los resultados se anotaron como % de semillas viables. Adicionalmente, se comparó de una misma muestra la viabilidad entre semillas que flotaban y semillas que se hundían. Las especies evaluadas fueron: B. purpurea con 100 %, 75 % y 50 % de madurez de la cápsula y Sobralia sp. con 100 % y 90 % de madurez de la cápsula. RESULTADOS Y DISCUSIÓN La deshidratación de la semilla tiene como finalidad la de reducir el contenido de humedad de la misma para reducir, por un lado, la posibilidad de contaminación de la semilla, y por otro lado, la de evitar daños por la entrada y salida de agua en el embrión durante el período de almacenamiento. Se determinaron los porcentajes de viabilidad resultantes en semillas de cinco especies, almacenadas con dos contenidos de humedad distintos y bajo cuatro diferentes temperaturas.

90 Ossenbach et al. / Tierra Tropical (2007) 3 (1): 85-97 100 80 Acineta densa CaCl 2 LiCl Blettia purpurea 60 40 20 0 100 Encyclia ceratistes Gongora tricolor 80 Viabilidad (%) 60 40 20 0 100 Sobralia sp. -20 C 5 C 25 C 60 C Temperatura 80 60 40 20 0-20 C 5 C 25 C 60 C Temperatura Figura 1. Viabilidad de semillas almacenadas con distintos contenidos de humedad y bajo diferentes temperaturas. En el análisis de los datos obtenidos se observó que las muestras desecadas en LiCl presentaron una pérdida de viabilidad menor que las desecadas en CaCl 2 (Figura 1). Esto pudiera predisponer una preferencia al uso de LiCI como desecante de semillas de orquídeas. Si se toman en cuenta únicamente los tratamientos desecados con CaCl 2, se logra rescatar que una temperatura a 5 C brinda los mayores beneficios. Esto es bastante consistente para todas las especies, con excepción de E. ceratistes, en la cual se obtiene un mejor resultado a -20 C (Figura 1). Considerando únicamente los tratamientos con LiCl, no se logra distinguir una preferencia clara

Ossenbach et al. / Tierra Tropical (2007) 3 (1): 85-97 91 para temperaturas entre -20 C y 5 C. A. densa presenta menores pérdidas a -20 C, mientras que E. ceratistes lo hace a 5 C. Para las demás especies no se evidencian diferencias (Figura 1). Temperaturas mayores a 25 C mostraron ser perjudiciales. Pritchard y Seaton (1993) reportan que el almacenamiento de Dactylorhiza maculata a 62 C redujo la germinación de un 69 % a un 4 % en 6 días. Este ensayo mostró que A. densa, B. purpurea y G. tricolor alcanzaron a llegar a 8 semanas con una viabilidad entre el 30 % y el 55 % a una temperatura de 60 C. Por otro lado, la especie Sobralia sp. no soportó el tratamiento a tal temperatura por más de una semana, presentando incluso una reducción de viabilidad del 45 % tanto en congelación como en refrigeración después de una semana. Esto evidencia que existen especies cuya semilla es muy perecedera por naturaleza, lo cual corresponde a características intrínsecas de la misma. En resumen, se puede indicar que el uso de LiCl y CaCl 2 son recomendables como desecantes si se realiza un almacenamiento a temperaturas entre -20 C y 5 C para el primero y de 5 C para el segundo. Las diferencias poco claras entre ambos tratamientos se deben a que el contenido de humedad de la semilla obtenida con ambos desecantes no se diferencia mucho. Una vez cosechadas las semillas y deshidratadas correctamente, se procede a almacenar. El almacenamiento debe procurar que la semilla sufra la menor cantidad de cambios posibles (Seaton, 2000). Estos cambios se pueden referir a variables en el contenido de humedad o cambios bruscos de temperatura. Por esto se evaluaron las condiciones que puedan generar una mayor estabilidad metabólica en las semillas. Se observó la pérdida de viabilidad en semillas de 17 especies almacenadas durante 20 semanas (Cuadro 2) o 24 semanas (Cuadro 3) en sobres de papel encerado y viales de vidrio. Se obtuvieron resultados en los porcentajes de pérdida de viabilidad que tienen números negativos, debido a que en algunos casos, después de una semana se obtuvo un porcentaje de viabilidad mayor al inicial. Esta situación no se le adjudica a la solución de tetrazolio, ya que ésta fue la misma para todas las muestras. Debido a que esto se presentó únicamente en las muestras de semillas que provienen de varias cápsulas (cápsulas mixtas), posiblemente la mezcla de semillas no fue muy homogénea y las semillas de cápsulas distintas pueden variar notablemente como lo indica el Meyers Conservatory (1999). Como consecuencia, las muestras tomadas para las pruebas de viabilidad pudieron haber tenido semillas distintas.

92 Ossenbach et al. / Tierra Tropical (2007) 3 (1): 85-97 Cuadro 2. Viabilidad de semillas almacenadas en sobres de papel y viales de vidrio por 20 semanas. Especie Almacenamiento - sobre Pérdida de viabilidad (%) Almacenamiento - vial Blettia purpurea a) 38.5 53.8 Blettia purpurea b) 18.8 Blettia purpurea c) 6.7 Blettia purpurea d) 38.5 Cattleya aurantiaca 29.4 11.8 Cattleya skinneri 5.6 0.0 Encyclia ochracea 66.7 Epidendrum baumannianum 20.0 0.0 Isochilus amparoanus a) 5.9 Isochilus amparoanus b) 5.3 Maxillaria bracteata 40.0 6.7 Oerstedella centradenia a) 73.3 46.7 Oerstedella centradenia b) 100.0 Oerstedella centradenia c) 92.3 Oerstedella centradenia d) 25.0 Oerstedella centradenia e) 100.0 Schomburgkia lueddemannii a) 10.5 10.5 Schomburgkia lueddemannii b) 0.0 Schomburgkia lueddemannii c) 11.1 Schomburgkia lueddemannii d) 6.3 Stanhopea wardii a) 5.3 10.5 Stanhopea wardii b) 8.3 a), b), c), d) Cápsulas distintas

Ossenbach et al. / Tierra Tropical (2007) 3 (1): 85-97 93 Cuadro 3. Viabilidad de semillas almacenadas en sobres de papel y viales de vidrio por 24 semanas. Especie Almacenamiento - sobre Pérdida de viabilidad (%) Almacenamiento - vial Encyclia ceratistes a) 0.0 0.0 Encyclia ceratistes b) 5.9 Encyclia ochracea 100.0 100.0 Epidendrum pseudoepidendrum 5.3 5.3 Epidendrum radicans a), b), c) 100.0 100.0 Epidendrum radicans d) 45.5-9.1 Epidendrum ramosissimum 0.0-27.3 Epidendrum stamfordianum 91.7 33.3 Pleurothallis sp. 47.4 68.4 Scaphyglottis pulchella 0.0-33.3 a), b), c), d) Cápsulas distintas Semilla proveniente de cápsulas mixtas Al analizar los resultados obtenidos se puede concluir, de manera general, que el almacenamiento de semillas en viales de vidrio produjo una pérdida de viabilidad menor que el almacenamiento en sobres de papel. Los viales de vidrio proveen un ambiente más favorable para mantener las características iniciales de la semilla por un tiempo más prolongado. Los casos en los que no se cumple este modelo se da en las especies B. purpurea, Pleurothallis sp., en un caso de S. lueddemannii, y en S. wardii. En las restantes 13 especies se muestra un resultado a favor de los viales de vidrio o no se muestran diferencias. Las condiciones que proporcionan los viales de vidrio y los sobres de papel se diferencian, por un lado, en que los sobres de papel permiten el intercambio de gases. Por lo tanto, la humedad relativa puede variar. Por otro lado, el papel no suministra una protección contra el manipuleo. Seaton (2000) afirmó que es importante mantener los viales de vidrio cerrados herméticamente, no abrirlos sino cuando sea necesario y volver a desecar la semilla si quedaron restos en el envase. Al igual, Böhm (1996) aseguró que el transporte de semilla no se debe realizar sin una protección adecuada. Los resultados demuestran que, a pesar de intentar brindar condiciones iguales a ambos tratamientos, en los viales de vidrio se logran mantener condiciones más favorables con mayor facilidad. Se evaluaron algunas de las metodologías de pruebas de viabilidad mencionadas en la literatura. En las pruebas de viabilidad con y sin un pretratamiento con Ca(OCl) 2, y con y sin una incubación adicional en verde de malaquita, el pretratamiento con Ca(OCl) 2 afectó a las especies evaluadas, reduciendo su viabilidad significativamente (Cuadro 4). Esto se debe a que esta metodología es recomendada para orquídeas terrestres de zonas templadas, desconociendo sus efectos en especies tropicales. Sólo la especie E. ramosissimum parece ser menos sensible a este

94 Ossenbach et al. / Tierra Tropical (2007) 3 (1): 85-97 químico, ya que presenta únicamente de un 3 % a un 18 % de pérdida de viabilidad entre las muestras con y sin pretratamiento. Cuadro 4. Pruebas de viabilidad con tetrazolio evaluando un pretratamiento con Ca(OCl) 2 y una incubación adicional en verde de malaquita (VM). Viabilidad (%) Pretratamiento con Ca(OCl) 2 Sin pretratamiento Especie SinVM ConVM SinVM ConVM Encyclia ochracea 13 7 95 85 Epidendrum radicans 5 5 10 10 Epidendrum ramosissiimum 40 47 58 50 Epidendrum pseudoepidendrum 25 25 95 95 Pleurothallis sp. 4 1 95 95 Las pruebas de tetrazolio con y sin el uso de verde de malaquita no muestran diferencias considerables. Esta tinción dio un mayor contraste de colores entre los tejidos vivos y muertos. Sin embargo, no representó una ayuda significativa a la distinción de los embriones tenidos con tetrazolio. Este procedimiento aumentó considerablemente el tiempo demorado, dilatando aproximadamente un mínimo de una hora para realizar el lavado de cada muestra y una incubación de 30 a 45 minutos. En las Figuras 2 y 3 se puede observar el contraste entre las semillas teñidas únicamente con tetrazolio y aquéllas teñidas con tetrazolio y verde de malaquita. Ambos métodos son validos, sin embargo, no es necesaria una tinción con verde de malaquita para lograr una buena observación de los embriones. La incubación adicional con verde de malaquita no representó una ayuda significativa en la observación y constituyó un aumento innecesario de mano de obra. Figura 2. Semillas de Cattleya aurantiaca con embriones viables teñidos con tetrazolio.

Ossenbach et al. / Tierra Tropical (2007) 3 (1): 85-97 95 Figura 3. Semilla de Maxillaria bracteata con embriones viables teñidos con tetrazolio y tejido muerto (testa) teñido con verde de malaquita. Según Colbry et al. (1986), la prueba de tetrazolio es meramente otro instrumento útil, pero no es infalible y no es la respuesta final a todos los problemas de análisis. La precisión de los resultados depende de la capacidad del analista que los interpreta. Esta prueba revela los porcentajes de germinación basándose únicamente en las condiciones internas de la semilla, pero no revela el comportamiento combinado de la calidad de las semillas y de unas condiciones dadas de crecimiento. Se comparó el porcentaje de viabilidad y de embriones entre semillas de dos especies, B. purpurea y Sobralia sp., con diferentes grados de maduración que flotaban y no flotaban. A pesar de que Hicks (2000) opinó que la semilla que flota en la mayoría de los casos no es viable, los resultados en este estudio mostraron que las semillas que flotan y que no flotan no se diferencian mucho en cuanto a su porcentaje de viabilidad y de embriones en estas especies (Cuadro 5). Efectivamente existe una diferencia en el porcentaje de viabilidad, el cual es de un 5 % a un 10 % mayor en las semillas que se hundieron, sin embargo, los contrastes no son drásticos. El porcentaje total de embriones resultó ser de un 0 % a un 5 % mayor para las semillas que flotaban (Cuadro 5). Cuadro 5. Porcentaje de viabilidad y embriones de semillas que flotaban y no flotaban. Blettia purpurea Sobralia sp. IC 100 % IC 75 % IC 50 % IC 100 % IC 90 % Característica %V %E %V %E %V %E %V %E %V %E Flotaban 65 100 50 95 50 100 80 100 70 100 Se hundían 75 95 55 95 55 95 90 100 75 100 Índice de cosecha (Ossenbach, 2001). Viabilidad Embriones Las semillas presentan un espacio de aire de un 75 % a un 96 %, dependiendo de la especie (Arditti, 1992). Debido a esto, semillas con espacios de aire muy grandes, tales como E. radicans o E. baumannianum, no se hunden a pesar de remojarlas por una noche en una solución saturada de azúcar, como es recomendado por Hicks (2000). Otras especies, como C. skinneri, E. ceratistes o I. amparoanus, tienen espacios de aire menores y se hunden instantáneamente.

96 Ossenbach et al. / Tierra Tropical (2007) 3 (1): 85-97 Finalmente, existen otras especies, cuyas semillas se hunden parcialmente, como ya se observó en este ensayo. Las diferencias, entre la semilla que flotaba y la que no, se pueden deber a que la semilla que flotaba no se logró impregnar lo suficiente en la solución de tetrazolio al estar en la parte superficial, en donde algunas se quedaban adheridas a las paredes del tubo. Al realizar las pruebas es más recomendable tomar las muestras del fondo del tubo de ensayo; sin embargo, cuando la mayoría de las semillas evaluadas tienden a flotar, se toma la muestra de la superficie, ya que allí estará la mayor cantidad de semillas. Esto demuestra la importancia de utilizar un detergente en la solución de tetrazolio, para asegurar que la cubierta de la semilla o testa se permeabilice. CONCLUSIONES La desecación previa con LiCl seguido de un almacenamiento a -20 C o a 5 C, presenta los mejores resultados al igual que la desecación previa con CaCl 2 seguido de un almacenamiento a 5 C, por lo cual su selección puede depender de los recursos disponibles. Los viales de vidrio presentan una mayor facilidad de manejo y aumentan la longevidad de la semilla en comparación con los sobres de papel encerado. Las pruebas de tetrazolio se pueden emplear sin necesidad de agregar un pretratamiento con Ca(OCl) 2, ni una incubación adicional en verde de malaquita. La precisión de los resultados de las pruebas de tetrazolio se ve influidas por la capacidad del analista que los interpreta. Se recomienda identificar las especies en mayor peligro de extinción para realizar estudios más detallados con respecto a su conservación y el almacenamiento de sus semillas, y recopilar resultados obtenidos en bancos de germoplasma u otras entidades sobre el almacenamiento y la longevidad de semillas de orquídeas. LITERATURA CITADA Arditti, J. 1992. Fundamentals of Orchid Biology. John Wiley & Sons, Inc. US. 691 p. Böhm, J. 1996. Terrestrial orchid seed handling: How to collect, store and send terrestrial orchid seed and pollen and how to send in vitro cultures by post (en línea). Consultado el 25 de febrero del 2001. Disponible en http://www.med-rz.unisb.de/med_fak/physiol2/disa/seed/stor.htm Colbry, V.; Swofford, T.; Moore, R. 1986. Pruebas de germinación en el laboratorio. Semillas. Compañía Editorial Continental, S.A. México. p. 771-786. Hicks, A. 2000. Asymbiotic technique of orchid seed germination. Huber, R. (Ed.) Orchid Seed Bank Project (OSP). US. 135 p. Meyers Conservatory. 1999. Capsule drying and seed preparation (en línea). Consultado el 16 de marzo del 2001. Disponible en http://www.troymeyers.com Ossenbach, C. 2001. Almacenamiento de semillas de diferentes especies de orquídeas para su conservación en un banco de germoplasma. Proyecto de Graduación, Licenciado Ingeniero Agrónomo. Universidad EARTH, Guácimo, CR. 82 p. Pritchard, H.; Seaton, P. 1993. Orchid seed storage: Historical perspective, current status, and future for long-term conservation. Selbyana 14: 89-104.

Ossenbach et al. / Tierra Tropical (2007) 3 (1): 85-97 97 Royal Botanical Gardens. 2001. Research Orchidaceae. Royal Botanic Gardens, Kew, UK. Consultado el 24 de marzo del 2001. Disponible en http://www.kew.org/scihort/orchids/index.html Seaton, P. 2000. Growing orchids from seed. Part 1: Seed storage. Orchid Review 108: 55-110.