RESOLUCIÓN OIV-OENO 461-2012 MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE NATAMICINA EN EL VINO LA ASAMBLEA GENERAL, Visto el párrafo 2 iv del artículo 2 del Acuerdo por el que se crea la Organización Internacional de la Viña y el Vino; A propuesta de la subcomisión de Métodos de análisis de mostos y vinos; Considerando que las actividades de la OIV deben contribuir a la seguridad de los alimentos; Reconoce que no se han prescrito métodos oficiales concretos de determinación de natamicina en el vino y que pueden aplicarse métodos ya disponibles. DECIDE adoptar los dos métodos de tipo IV expuestos a continuación para la determinación de la natamicina en el vino: 1. INTRODUCCIÓN Para la determinación de la natamicina se utilizan diversos métodos, basados primordialmente en HPLC en combinación con detección DAD (matriz de diodos) o MS (espectrofotometría de masas). La estimación de los límites de rendimiento límites de detección y cuantificación se basa en la responsabilidad de los laboratorios en conformidad con sistemas de acreditación (p. ej. ISO/EN 17025/2005) que utilicen la recomendación de la OIV (OENO 7/2000, E-AS1-10-LIMDET) u otras directrices normativas. Como falta una estimación fiable entre laboratorios del nivel crítico, se adopta temporalmente un límite de decisión de 5 μg/l hasta disponer de una estimación fiable intralaboratorios o de otros indicadores sólidos. 2.1 MÉTODOS Determinación de natamicina (pimaricina) en el vino por cromatografía de líquidos combinada con espectrometría de masas de alta resolución. 1
2.1.1 OBJETO Este método describe un procedimiento analítico de determinación de natamicina (pimaricina) en el vino. La concentración de natamicina se expresa en microgramos por litro (μg/l) de vino. Se ha realizado una validación interna con soluciones disolventes, vino tinto y vino blanco en un intervalo de concentraciones comprendido entre 5 y 2.600 μg/l. 2.1.2 FUNDAMENTO La concentración de natamicina en el vino se determina mediante inyección directa de la muestra en un cromatógrafo de líquidos con un sistema de detección de espectrometría de masas de alta resolución (LC-HR/MS). La cuantificación se basa en el método de adición de patrones. Primero se analiza la muestra por primera vez para obtener una concentración estimada de natamicina. A continuación se repite el análisis añadiendo los patrones de calibración normalizados más adecuados para la concentración de natamicina de la muestra. 2.1.3 REACTIVOS 2.1.3.1 Analitos 2.1.3.1.1 Natamicina (Pimaricina) >95% 2.1.3.2 Compuestos químicos: 2.1.3.2.1 Metanol, calidad HPLC de fluorescencia (núm. CAS 67-56-1). 2.1.3.2.2 Agua purificada para laboratorio, por ejemplo, de calidad EN ISO 3696 (Agua para uso en análisis de laboratorio. Especificación y métodos de ensayo [ISO 3696:1987]). 2.1.3.2.3 Ácido acético 100% (núm. CAS 64-19-7). 2.1.3.3 Soluciones 2.1.3.3.1 Solución madre de natamicina (1.000 μg/ml) Pesar con una exactitud de 0,1 mg alrededor de 10 mg de natamicina (2.1.3.1.1) en un matraz aforado de vidrio topacio de 10 ml y enrasar con una mezcla de metanol agua: ácido acético (2.1.3.3.4). Cerrar y tratar con ultrasonidos. Calcular la concentración real en microgramos de natamicina por mililitro de solución. 2.1.3.3.2 Solución de trabajo uno: natamicina (10 μg/ml) Pipetear 100 μl de solución (2.1.3.3.1) en un matraz aforado de vidrio topacio de 10 ml y enrasar con metanol: agua: ácido acético (2.1.3.3.4). 2.1.3.3.3 Solución de trabajo dos: natamicina (0,5 μg/ml) Pipetear 500 μl de solución de trabajo uno (2.1.3.3.2) en un matraz aforado de vidrio topacio de 10 ml y enrasar con metanol: agua: ácido acético (2.1.3.3.4). 2.1.3.3.4 Solución de metanol: agua: ácido acético (50:47:3, v/v) 2
Medir con una probeta 500 ml de metanol (2.1.3.2.1) y verterlos en un matraz aforado de 1 l. Añadir 470 ml de agua (2.1.3.2.2) y agitar para mezclar. Añadir 30 ml de ácido acético (2.1.3.2.3) y agitar bien. 2.1.3.3.5 Metanol, ácido acético al 3% Verter con una probeta 30 ml de ácido acético (2.1.3.2.3) en un matraz aforado de 1 l. Enrasar con metanol (2.1.3.2.1) y agitar bien. 2.1.3.3.6 Agua, ácido acético al 3% Verter con una probeta 30 ml de ácido acético (2.1.3.2.3) en un matraz aforado de 1 l. Enrasar con agua (2.1.3.2.2) y agitar bien. 2.1.4 EQUIPO NOTA: los instrumentos se indican sólo cuando son especializados o de especificaciones determinadas; se supone que se cuenta con el material de vidrio y el equipamiento habitual de laboratorio. 2.1.4.1 Cromatógrafo de líquidos (LC) Provisto de inyector automático, con bucle de inyección de 100 μl y espectrómetro de masas de alta resolución. 2.1.4.1.1 Columna de LC Capaz de conseguir picos reproducibles de natamicina y de separarlos de los picos de interferencia procedentes de la matriz de la muestra o de los disolventes utilizados. NOTA: las condiciones operativas deben optimizarse en función del equipo utilizado para el análisis. 2.1.4.1.2 Análisis HPLC Se ha observado que la columna y los parámetros siguientes son adecuados: Columna: Waters Sunfire C18, 150 x 2,1 mm, 3,5 µm Temperatura de la columna: 30 C Velocidad de flujo: Volumen de inyección: 20 µl 0,25 ml/min Fase móvil A: agua:ácido acético, 97:3 (v/v) (2.1.3.3.6) Fase móvil B: metanol:ácido acético, 97:3 (v/v) (2.1.3.3.5) Tiempo de elución: 30 min Cubeta del muestreador automático: 8 C 3
Gradiente: Tiempo (min) Fase móvil A (%) Fase móvil B (%) 0 90 10 25 10 90 27 10 90 27,1 90 10 30 90 10 2.1.4.2 Detección por espectrometría de masas (LC-HR/MS) Modo de ionización: electrospray positivo Resolución de masa: m/z/ m/z Diana AGC: intervalo dinámico elevado Tiempo máx. de inyección: 50 ms Intervalo de exploración: m/z 480-670 Gas de barrido: 60 l/min Gas auxiliar: 5 l/min Tensión del spray: 3,75 V Natamicina: m/z 666,31069 [M+H] +. m/z de confirmación del ion 503,22672 Tiempo de retención: 16,5 min 2.1.5 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Las muestras deben agitarse para garantizar la homogeneidad antes de obtener submuestras. 2.1.5.1 Análisis de cribado Pipetear 2 ml de muestra de cada vino en viales eppendorf de 2 ml para centrífuga. Añadir 0 μl y 20 μl, respectivamente, de la solución de trabajo dos de natamicina de 0,5 μg/ml (2.1.3.3.3) a los viales. Esto equivale a añadir 0 μg/l l y 5 μg/l de natamicina. Agitar los viales durante un minuto y a continuación centrifugar durante 10 min a 14.000 rpm. Filtrar una alícuota a través de un filtro PTFE de 0,2 μm en un vial topacio 4
de 2 ml. Analizar mediante LC-HR/MS (apartado 6) y calcular la concentración de natamicina de la muestra (apartado 7). Si la concentración de natamicina calculada es inferior a 5 μg/l, informar como <5 μg/l. Si es superior a 5 μg/l, pasar al apartado 5.2. 2.1.5.2 Cuantificación Determinación de la natamicina en muestras con una concentración estimada superior a 5 μg/l. Pipetear 2 ml de vino en cinco viales eppendorf de 2 ml para centrífuga y añadir 0 μl, 5 μl, 10 μl, 20 μl y 50 μl, respectivamente, de solución de trabajo de natamicina uno (2.1.3.3.2) a los viales. Esto equivale a añadir 0 μg/l, 25 μg/l, 50 μg/l, 100 μg/l y 250 μg/l de natamicina. Agitar los viales durante un minuto y a continuación centrifugar durante 10 min a 14.000 rpm. Filtrar una alícuota a través de un filtro PTFE de 0,2 μm en un vial topacio de 2 ml. Analizar mediante LC-HR/MS (apartado 6) y calcular la concentración de natamicina de la muestra (apartado 7). 2.1.6 ANÁLISIS NOTA: al iniciar las medidas hay que examinar la estabilidad de la línea base y la linealidad de la respuesta del detector, junto con la verificación del límite de detección. Mantener las mismas condiciones operativas durante las medidas de todas las muestras y los patrones de calibración. Identificar los picos de la natamicina a partir del tiempo de retención y de su canal de masa exacto y medir las áreas de los picos. Inyectar en la columna de LC cada una de las soluciones preparadas. Medir el área del pico de la natamicina en cada una de las cuantificaciones y de los canales de confirmación. En la figura 1 se presenta un ejemplo de cromatograma típico. 5
Relative Abundance Relative Abundance Figura 1. Cromatograma LC-HR/MS típico y espectro de masa de natamicina añadida en vino blanco a un equivalente de 50 μg/l en la muestra. C:\Xcalibur\...\data\10043_039 1/28/2010 4:12:34 AM white wine 100 rep 1 RT: 10.00-25.00 SM: 7B 100 80 60 RT: 16.04 MA: 497798 NL: 4.94E4 m/z= 666.30069-666.32069 MS 10043_039 40 20 0 100 80 60 12.76 15.49 17.79 RT: 16.05 AA: 261679 NL: 2.78E4 m/z= 503.21672-503.23672 MS ICIS 10043_039 40 20 0 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Time (min) 10043_039 #1976-2020 RT: 15.89-16.24 AV: 45 SB: 188 13.82-14.55, 16.88-17.64 NL: 2.22E4 T: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [480.00-670.00] 100 666.3119 90 80 70 60 50 503.2275 607.2148 648.3018 40 30 20 10 0 668.3177 495.2213 533.8832 521.9441 485.2170 504.9311 537.9169 565.9105 512.9292 573.2158 587.2675 613.9032 489.0634 540.9152 605.1528 622.9182 527.9621 651.3326 547.9008 555.2775 577.9591 629.3513 643.2388 661.4067 480 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 610 620 630 640 650 660 670 m/z Representar gráficamente el área del pico del canal de cuantificación principal frente a la concentración en microgramos por litro (μg/l) de natamicina añadida. Determinar la pendiente, la ordenada en el origen y el coeficiente de correlación de la recta de regresión. La curva de calibrado debe ser rectilínea y el coeficiente de correlación ha de ser 0,99 o mayor. 2.1.7 EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS 2.1.7.1 Cálculo de la concentración del analito La concentración de natamicina en la muestra en microgramos por litro (μg/l) se calcula según la siguiente fórmula: C = b/a siendo C = concentración de natamicina en el vino (μg/l); a = pendiente de la recta de regresión; b = y - ordenada en el origen de la recta de regresión. 2.1.8 CONFIRMACIÓN La presencia de natamicina en las muestras debe confirmarse aplicando los criterios siguientes: Presencia de un pico en los dos canales de masa exactos m/z 666,31069 y m/z 503,22672 al mismo tiempo de retención. Calcular el cociente del área del pico para el principal canal de masa de cuantificación con respecto al área del pico del canal de confirmación. El criterio es que los cocientes 6
deben estar dentro del ± 25% de los obtenidos añadiendo patrones de calibración. 2.1.9 DATOS DE RENDIMIENTO DEL MÉTODO 2.1.9.1 Linealidad El método es lineal en el intervalo de calibración de 1 a 2.640 μg/l en matrices de disolvente, vino blanco y vino tinto (figuras 2, 3 y 4). Figura 2. Gráfico de calibración de diez puntos de natamicina añadida en disolvente en el intervalo de 1 a 2.600 μg/l. Tabla 1. Residuales del patrón de calibración en el disolvente. Natamicina Conc. prevista (µg/l) (µg/l) Residuales Residuales patrón 0 6,4-6,4-0,4 1,056 6,8-5,7-0,3 5,28 10,9-5,6-0,3 10,56 16,8-6,3-0,4 52,8 58,9-6,1-0,3 105,6 108,3-2,7-0,2 211,2 200,1 11,1 0,6 1056 1029,8 26,2 1,5 2112 2084,8 27,2 1,6 2640 2671,8-31,8-1,8 7
Figura 3. Gráfico de calibración de diez puntos de natamicina añadida en vino blanco en el intervalo de 1 a 2.600 μg/l. Tabla 2. Residuales del patrón de calibración en matriz de vino blanco Natamicina Conc. prevista (µg/l) (µg/l) Residuales Residuales patrón 0 15,5-15,5-0,3 1,056 15,6-14,6-0,3 5,28 18,8-13,5-0,2 10,56 23,9-13,3-0,2 52,8 63,6-10,8-0,2 105,6 109,3-3,7-0,1 211,2 212,8-1,6 0,0 1056 989,0 67,0 1,2 2112 2003,2 108,8 2,0 2640 2742,7-102,7-1,8 8
Figura 4. Gráfico de calibración de diez puntos de natamicina añadida en vino tinto en el intervalo de 1 a 2.600 μg/l. Tabla 3. Residuales del patrón de calibración en matriz de vino tinto Natamicina Conc. prevista (µg/l) (µg/l) Residuales Residuales patrón 0 7,2-7,2-0,3 1,056 8,2-7,1-0,3 5,28 10,9-5,7-0,3 10,56 16,8-6,2-0,3 52,8 52,1 0,7 0,0 105,6 102,1 3,5 0,2 211,2 199,8 11,4 0,5 1056 1055,2 0,8 0,0 2112 2063,7 48,3 2,3 2640 2678,4-38,4-1,8 2.1.9.2 Exactitud y precisión La repetibilidad del método se evaluó en el límite de intervención de 5 μg/l y a 200 μg/l en matrices de disolvente, vino blanco y vino tinto (tablas 4, 5 y 6). La exactitud se evaluó añadiendo una cantidad conocida a dos niveles distintos en vino blanco y vino tinto. A continuación realizó el análisis un segundo analista sin conocer la concentración de natamicina con que se había añadido. Los resultados se recogen en la tabla 7. 9
Tabla 4. Repetibilidad de natamicina añadida en disolvente (metanol:agua:ácido acético 50:47:3, v/v) a dos concentraciones: 5 y 200 μg/l. Conc. Recuperaci Natamicina ón μg/l (%) Disolvente patrón a 5 ng/ml rep. 1 5,3 99,7 Disolvente patrón a 5 ng/ml rep. 2 5,4 101,8 Disolvente patrón a 5 ng/ml rep. 3 5,8 108,6 Disolvente patrón a 5 ng/ml rep. 4 5,7 108,2 Disolvente patrón a 5 ng/ml rep. 5 5,8 109,0 Disolvente patrón a 5 ng/ml rep. 6 5,9 112,2 Disolvente patrón a 5 ng/ml rep. 7 5,7 108,4 Disolvente patrón a 5 ng/ml rep. 8 6,4 120,2 Media 5,8 108,5 Desviación estándar 0,3 6,2 RSD (%) 5,7 5,7 Disolvente patrón a 200 ng/ml rep. 1 238,3 112,9 Disolvente patrón a 200 ng/ml rep. 2 237,1 112,4 Disolvente patrón a 200 ng/ml rep. 3 231,5 109,7 Disolvente patrón a 200 ng/ml rep. 4 228,0 108,1 Disolvente patrón a 200 ng/ml rep. 5 244,0 115,7 Disolvente patrón a 200 ng/ml rep. 6 220,7 104,6 Disolvente patrón a 200 ng/ml rep. 7 229,4 108,7 Disolvente patrón a 200 ng/ml rep. 8 251,7 119,3 Media 235,1 111,4 Desviación estándar 9,8 4,7 RSD (%) 4,2 4,2 Tabla 5. Repetibilidad de natamicina añadida en vino blanco a dos concentraciones: 5 y 200 μg/l. Conc. Recuperaci Natamicina ón μg/l (%) Vino blanco 5,3 ng/ml rep. 1 5,3 99,1 Vino blanco 5,3 ng/ml rep. 2 4,4 82,8 10
Vino blanco 5,3 ng/ml rep. 3 5,1 96,0 Vino blanco 5,3 ng/ml rep. 4 4,9 92,5 Vino blanco 5,3 ng/ml rep. 5 4,6 86,4 Vino blanco 5,3 ng/ml rep. 6 5,1 96,4 Vino blanco 5,3 ng/ml rep. 7 4,8 90,9 Vino blanco 5,3 ng/ml rep. 8 4,9 92,2 Media 4,9 92,0 Desviación estándar 0,3 5,4 RSD (%) 5,9 5,9 Vino blanco 211 ng/ml rep. 1 217,6 103,1 Vino blanco 211 ng/ml rep. 2 223,3 105,8 Vino blanco 211 ng/ml rep. 3 213,0 101,0 Vino blanco 211 ng/ml rep. 4 216,8 102,7 Vino blanco 211 ng/ml rep. 5 211,4 100,2 Vino blanco 211 ng/ml rep. 6 208,6 98,9 Vino blanco 211 ng/ml rep. 7 204,2 96,8 Vino blanco 211 ng/ml rep. 8 214,4 101,6 Media 213,7 101,3 Desviación estándar 5,8 2,8 RSD (%) 2,7 2,7 Tabla 6. Repetibilidad de natamicina añadida en vino tinto a dos concentraciones: 5 y 200 μg/l. Conc. Recuperaci Natamicina ón μg/l (%) Vino tinto 5,3 ng/ml rep. 1 5,3 99,7 Vino tinto 5,3 ng/ml rep. 2 5,0 93,8 Vino tinto 5,3 ng/ml rep. 3 3,8 72,5 Vino tinto 5,3 ng/ml rep. 4 5,1 96,5 Vino tinto 5,3 ng/ml rep. 5 5,0 95,0 Vino tinto 5,3 ng/ml rep. 6 5,5 103,5 Vino tinto 5,3 ng/ml rep. 7 4,3 80,9 Vino tinto 5,3 ng/ml rep. 8 4,8 90,7 Media 4,9 91,6 11
Desviación estándar 0,5 10,2 RSD (%) 11,1 11,1 Vino tinto 211 ng/ml rep. 1 183,9 87,1 Vino tinto 211 ng/ml rep. 2 178,4 84,5 Vino tinto 211 ng/ml rep. 3 181,1 85,8 Vino tinto 211 ng/ml rep. 4 197,5 93,6 Vino tinto 211 ng/ml rep. 5 178,2 84,5 Vino tinto 211 ng/ml rep. 6 184,2 87,3 Vino tinto 211 ng/ml rep. 7 181,2 85,9 Vino tinto 211 ng/ml rep. 8 171,3 81,2 Media 182,0 86,2 Desviación estándar 7,5 3,6 RSD (%) 4,1 4,1 Tabla 7. Exactitud de natamicina añadida en vinos blanco y tinto a dos concentraciones: 125 y 220 μg/l. Concentración teórica Concentración obtenida Exactitud Valor Z (µg/l) (µg/l) (%) Vino blanco A rep. 1 125 135 108 0,50 Vino blanco A rep. 2 125 142 114 0,85 Vino blanco A rep. 3 125 138 110 0,65 Vino blanco B rep. 1 220 230 105 0,28 Vino blanco B rep. 2 220 230 105 0,28 Vino blanco B rep. 3 220 239 109 0,54 Vino tinto A rep. 1 220 213 97-0,20 Vino tinto A rep. 2 220 234 106 0,40 Vino tinto A rep. 3 220 223 101 0,09 Vino tinto B rep. 1 125 129 103 0,20 Vino tinto B rep. 2 125 129 103 0,20 Vino tinto B rep. 3 125 120 96-0,25 Cálculos Cálculo del valor Z: = (concentración obtenida - concentración téorica) / desviación estándar objetivo Siendo: Desviación estándar objetivo = 0,16 x concentración añadida según Horwitz 12
2.2 Determinación de natamicina (pimaricina) en el vino mediante HPLC/DAD 2.2.1 Objeto Este método describe un procedimiento analítico de determinación de natamicina (pimaricina) en el vino mediante HPLC. La concentración de natamicina se expresa en microgramos por litro (μg/l) de vino. El método descrito se ha validado internamente en el laboratorio teniendo en cuenta la influencia de la matriz de vino (vino blanco o vino tinto, por ejemplo). 2.2.2 Fundamento Las muestras de vino no espumoso se inyectan directamente en el sistema HPLC. Las muestras de vino espumoso se desgasifican primero por filtración o en un baño de ultrasonidos. El analito se separa de la matriz en una columna C8. La fracción que contiene el analito se transfiere automáticamente a una columna C18 para mejorar la separación. La natamicina se detecta a 304 y 319 nm. Además, se utiliza el espectro de DAD para la identificación. La cuantificación se hace con ayuda de patrones de referencia externos. 2.2.3 Reactivos y materiales 2.2.3.1 Reactivos 2.2.3.1.1 Agua desionizada 2.2.3.1.2 Metanol, calidad HPLC (núm. CAS 67-56-1). 2.2.3.1.3 Ácido fórmico para análisis (núm. CAS 64-18-6). 2.2.3.1.4 Ácido acético para análisis (núm. CAS 64-19-7). 2.2.3.1.5 Ácido clorhídrico 0,1 N para análisis (núm. CAS 7647-01-0). 2.2.3.1.6 Matriz de vino sin natamicina detectable 2.2.3.1.7 Natamicina >95% (núm. CAS 7681-93-8). La pureza se verifica mediante determinación fotométrica a 291 nm, 304 nm y 319 nm en una solución de natamicina en ácido clorhídrico 0,1 N frente a un blanco de ácido clorhídrico 0,1 N: Datos de referencia tomados de la bibliografía Extinción (1 Gew. % natamicina, cubeta de 1 cm) 291 nm 304 nm 319 nm 758 1173 1070 13
Método alternativo: Después de la dilución (p. ej., factor de dilución 20), la solución madre (2.1.3.3.1) puede utilizarse también para la medida fotométrica; por ejemplo, pipetear 1,0 ml de solución madre en un matraz aforado de 20 ml y enrasar con ácido clorhídrico 0,1 N. Medir contra un blanco con la misma composición de disolventes que la solución madre diluida. 2.2.3.2 Preparación de la fase móvil 2.2.3.2.1 Soluciones para la fase móvil: 2.2.3.2.1.1 5 ml de ácido acético añadidos a 2 l de metanol 2.2.3.2.1.2 5 ml de ácido acético añadidos a 2 l de agua desionizada 2.2.3.2.2 Eluyente 1: metanol-ácido acético / agua desionizada-ácido acético (65 / 35) 2.2.3.2.3 Eluyente 2: metanol-ácido acético / agua desionizada-ácido acético (80 / 20) 2.2.3.3 Preparación de las soluciones madre y patrón Todas las soluciones tienen una estabilidad limitada y deben conservarse en la oscuridad y en refrigerador. La solución madre (2.1.3.3.1.1) tiene un periodo de validez de varias semanas, pero la concentración debe comprobarse poco antes de usarla (véase, por ejemplo, Método alternativo, 2.2.3.1.7). Las diluciones I (2.2.3.3.1.2) y II (2.2.3.3.1.3) y las soluciones patrón (2.2.3.3.2) deben prepararse a diario. 2.2.3.3.1 Preparación de la solución madre y de las diluciones 2.2.3.3.1.1 Solución madre (aproximadamente 100 mg/l) Pesar unos 5 mg de natamicina (3.1.7) y transferirlos con metanol a un matraz aforado de 50 ml. Añadir 0,5 ml de ácido fórmico, comprobar que la natamicina esté completamente disuelta, atemperar a 20 C y enrasar con metanol. 2.2.3.3.1.2 Dilución I (aproximadamente 5 mg/l) Pipetear 2,5 ml de solución madre (2.1.3.3.1) en un matraz aforado de 50 ml y enrasar con agua desionizada. 2.2.3.3.1.3 Dilución II (aproximadamente 1 mg/l) Pipetear 4 ml de dilución I (2.2.3.3.1.2) en un matraz aforado de 20 ml y enrasar con el vino que servirá de matriz (2.2.3.1.6). 14
2.2.3.3.2 Preparación de las soluciones patrón Para preparar las soluciones patrón, diluir la dilución II (2.2.3.3.1.3) a las concentraciones deseadas con la matriz de vino (2.2.3.1.6); por ejemplo, 50 μl en un matraz aforado de 10 ml equivale a 5 μg/l: Matraz aforado 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml Volumen de dilución II (μl) 50 100 200 400 500 1000 3700 Cantidad de natamicina (μg/l) 5 10 20 40 50 100 370 2.2.4. Equipos El material de laboratorio normal, y en particular: 2.2.4.1 Aparato para HPLC-DAD con una válvula HPLC de 6 tomas y dos bombas isocráticas o una bomba de gradiente para permitir el fraccionamiento 2.2.4.2 Columna RP-8 para HPLC 2.2.4.3 Columna RP-18 para HPLC 2.2.4.4 Fotómetro 2.2.5 Muestreo Las muestras de vino no espumoso se inyectan directamente en el sistema HPLC. Las muestras de vino espumoso se desgasifican primero por filtración o en un baño de ultrasonidos. Si las muestras deben guardarse, las condiciones de conservación correctas son frío y oscuridad. 2.2.6. Procedimiento 2.2.6.1 Condiciones operativas de HPLC Se ha observado que las columnas y los parámetros siguientes son adecuados: Columna 1: columna C8 (p. ej. Select B 125 x 4 mm/5 μm de fase desactivada [endcapped], Merck) Fase móvil: eluyente 1 (2.2.3.2.2) a temperatura ambiente Velocidad de flujo: 1 ml/min Columna 2: columna C18 (p. ej. Lichrospher 125 x 4 mm/5 μm, Merck) Fase móvil: eluyente 2 (2.2.3.2.3) a 30 C Velocidad de flujo: 1 ml/min 15
Volumen de inyección: 500 µl Detección UV: 304 y 319 nm Ventana de fraccionamiento: la posición de la ventana de fraccionamiento debe comprobarse antes del siguiente análisis (figura 1). El intervalo de la ventana debe ajustarse a 0,5 min antes y después de que eluya el pico deseado de la columna C8. Fig. 1 Columna 1 Fig. 2 Columna 2 Ventana de fraccionamiento Vino blanco marcado con natamicina (50 μg/l) 2.2.6.2 Identificación y confirmación Los picos se identifican por comparación de los tiempos de retención de patrones y muestras para las dos longitudes de onda medidas (304 y 319 nm). Con el sistema cromatográfico y los parámetros de 2.2.6.1, el tiempo de retención de la natamicina es de aproximadamente 12,9 min (fig. 2). El espectro DAD se utiliza para confirmar los resultados positivos (figuras 3 y 4). 16
Fig. 3 Espectros 3D-DAD de la natamicina Fig. 4 Espectros DAD de la natamicina 2.2.7 Cálculo y expresión de los resultados Se prepara una curva de calibrado con las soluciones patrón (2.2.3.3.2) utilizando los cromatogramas medidos a 304 nm. La natamicina se cuantifica por el método del patrón externo. Se genera una curva de calibrado lineal comparando las áreas de los picos y las concentraciones correspondientes. El coeficiente de correlación debe ser de 0,99 como mínimo. Los resultados se expresan en μg/l. 2.2.8 Datos de rendimiento del método Límites de detección y de cuantificación Los límites de detección y de cuantificación se determinaron según DIN 32645 (determinación directa: medida múltiple de una muestra de matriz de blanco, n = 10, y una curva de calibración que cubra todo el intervalo de trabajo). Límite de detección: Límite de cuantificación: 2,5 µg/l 8,5 µg/l Linealidad La linealidad en la matriz de vino se ha confirmado en el intervalo de calibración de 5 μg/l a 100 μg/l (fig. 5). 17
Fig. 5 Gráfico de calibración de seis puntos de natamicina añadida en una matriz de vino blanco en el intervalo de 5 a 100 μg/l, R 2 = 0,9999. 2.2.9 Exactitud y precisión La exactitud y la repetibilidad se han evaluado añadiendo una cantidad conocida de natamicina en vinos blanco, rosado y tinto y midiendo cada muestra cinco veces. Los resultados se recogen en la tabla 1. Matriz Contenido de natamicina en la matriz (μg/l) Contenido de natamicina añadida (μg/l) Vino blanco n. d. 5,02 Vino rosado n. d. 5,02 Contenido de natamicina medida (μg/l) Tasa de recuperación (%) Valor Z 5,04 100,4 0,0 4,70 93,6-0,2 5,12 102,0 0,1 5,29 105,4 0,2 4,97 99,0 0,0 Media 5,02 100,1 Desviación estándar 0,22 RSD (%) 4,3 Repetibilidad r 0,85 4,79 95,4-0,1 4,83 96,2-0,1 4,76 94,8-0,1 4,79 95,4-0,1 4,73 94,2-0,2 Media 4,78 95,2 18
Vino tinto n. d. 5,02 Vino tinto n. d. 21,2 Vino tinto n.d. 53,2 Desviación estándar 0,04 RSD (%) 0,78 Repetibilidad r 0,15 4,61 91,8-0,2 4,65 92,6-0,2 4,89 97,4-0,1 4,67 93,0-0,2 4,34 86,5-0,4 Media 4,63 92,3 Desviación estándar 0,20 RSD (%) 4,2 Repetibilidad r 0,77 19,73 93,1-0,2 20,66 97,5-0,1 21,16 99,8 0,0 19,73 93,1-0,2 19,58 92,4-0,3 Media 20,17 95,2 Desviación estándar 0,70 RSD (%) 3,5 Repetibilidad r 2,7 51,84 97,4-0,1 51,91 97,6-0,1 51,42 96,7-0,1 50,12 94,2-0,2 50,62 95,2-0,2 Media 51,18 96,2 Desviación estándar 0,78 RSD (%) 1,5 Repetibilidad r 3,1 Tabla 1. Exactitud de natamicina añadida en vinos blanco, rosado y tinto; n. d. = no detectado; límite de detección de 2,5 μg/l Cálculos (Tabla 1): Repetibilidad r = desviación estándar * t 4;0,95 * 2 1/2 Valor Z = (cantidad medida - cantidad añadida) / desviación estándar objetivo * * según Horwitz (1-0,5 log de la cantidad añadida) desviación estándar objetivo = 1/100 * cantidad añadida * 2 19
Bibliografía DIN 32645:2008-11 UV- und IR-Spektren wichtiger pharmazeutischer Wirkstoffe, Editio Cantor Aulendorf, 1978, Herausgeber/ Editior Hans-Werner Dibbern in Zusammenarbeit mit E. Wirbitzki Macarthur R, Feinberg M, Bertheau Y, 2010, Construction of measurement uncertainty profiles for quantitative analysis of genetically modified organisms based on interlaboratory validation data, Journal of the Association of Official Analytical Chemists, 93(3), 1046 1056. FV 1351. Dominic Roberts and Adrian Charlton. Determination of natamycin in wine by liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry: standard operating procedure and method performance data. OIV SCMA marzo 2010. FV 1355. Tomasz Brzezina. Natamycin in Wein. OIV SCMA marzo 2010. 20