Ref: CYT-MM-MRD Para Uso en Investigación LOS VIALES DE MM-MRD SON PRODUCTOS LIOFILIZADOS. LEA ATENTAMENTE LAS SIGUIENTES INSTRUCCIONES PARA SU RECONSTITUCIÓN: El panel Mieloma Múltiple de Enfermedad Mínima Residual (MM-MRD) liofilizado preserva la estabilidad de la combinación de anticuerpos pre-mezclados. Reconstituya cada vial liofilizado que contiene las combinaciones pre-mezcladas con agua destilada, como se indica a continuación: Tubo 1: 180 µl agua destilada. Tubo 2 de marcaje de superficie: 120 µl agua destilada. Tubo 2 de marcaje citoplasmático: 70 µl agua destilada. Mezclar bien y esperar al menos 30 minutos. El volumen del vial reconstituido que no ha sido empleado, es estable durante cuatro semanas desde la fecha de reconstitución, siempre que se conserve en oscuridad entre 2-8º C. USO PROPUESTO El panel MM-MRD es una combinación de anticuerpos de 6 colores pre-mezclados diseñado para la precisa identificación y discriminación de células plasmáticas (PCs) malignas y normales en muestras de médula ósea de pacientes con MM. Este reactivo debe ser empleado por personal cualificado para citometría de flujo. PRINCIPIOS DEL ENSAYO La citometría de flujo es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas, generalmente células, alineadas de una en una por delante de un haz de luz láser. La interacción de las células con el rayo de luz genera señales de dos tipos: la generada por la dispersión de la luz (Forward Scatter (FSC) / Side Scatter (SSC)) y la relacionada con la emisión de luz por los fluorocromos. Estas señales se transforman en impulsos eléctricos que se amplifican y se convierten en señales digitales que se procesan en el ordenador. Cuando se añade el reactivo a la muestra, los AcMo marcados con fluorocromos presentes en el reactivo se unen de forma específica a los antígenos frente a los que están dirigidos, permitiendo la detección por citometría de flujo de las poblaciones celulares que expresan el antígeno. La población de eritrocitos, que podría dificultar la detección de la población de interés, se elimina usando una solución lisante previa a la adquisición de la muestra en el citómetro. RESUMEN Y EXPLICACIÓN En general, independientemente de la patología, la MRD se define por la presencia, a baja frecuencia, de células malignas residuales tras la intervención terapéutica (1). En el caso particular de MM hay estudios que han demostrado que la presencia de un 0,01% de células plasmáticas aberrantes (considerados actualmente como casos positivos de MRD), está asociada con un mal pronóstico (1). Estudios recientes acerca de las prácticas actuales en la detección de MM-MRD por citometría de flujo, revelaron una gran heterogeneidad en la metodología: panel de anticuerpos, estrategia de identificación y número de eventos adquiridos (2). El informe de 2008 de la European Myeloma Network (3) así como en recientes publicaciones (4, 5) establecen como consenso que el análisis de CD38, CD138 y CD45 en combinación con CD19, CD56, CD27, CD81 and CD117 son el mejor método para la detección de MRD en MM. También establecen que el marcaje de las cadenas ligeras citoplasmáticas kappa(κ)/lambda(λ) puede ser útil para clarificar casos atípicos. Este consenso es traducido y mejorado en las dos combinaciones multicolores EuroFlow MM-MRD para citometría de flujo. Página 1 de 6 Última revisión: 17/03/2016
La caracterización inmunofenotípica no emplea controles isotípicos, básicamente porque hay controles internos, como otras poblaciones de leucocitos para definir límites positivos y negativos (siempre que se aplique un procedimiento operativo estándar para la calibración del instrumento. Podrá encontrar una guía completa en la página web www.euroflow.org). Empleando aproximaciones estándar para la detección de MM-MRD, tanto para la preparación de muestras como para la estrategia de identificación, se puede convertir la citometría de flujo en un método rápido, seguro, reproducible, rentable y sensible de entre los métodos que se emplean actualmente para esta aplicación. El kit MM-MRD ha sido cuidadosamente diseñado para reconocer específicamente los siguientes antígenos por citometría de flujo: CD38, CD45, CD56, CD19, CD81, CD117, IgKappa e IgLambda citoplasmáticas. Las cadenas ligeras empleadas para la valoración de la clonalidad son policlonales. El uso de anticuerpos policlonales frente a monoclonales, ha demostrado ventajas en la detección de cadenas ligeras de inmunoglobulinas intracelulares en la evaluación de la clonalidad de PCs (6). COMPOSICIÓN DEL REACTIVO Material incluido El kit MM-MRD se suministra como dos diferentes combinaciones de 6 colores con volumen suficiente para 20 determinaciones y contiene: Solución de lisis de eritrocitos de cloruro de amonio sin fijador (BulkLysis TM ). Soluciones de fijación y permeabilización (Fix&Perm, Nordic-MUBio BV, The Netherlands) para la detección intracelular para la detección de cadenas ligeras de inmunoglobilinas Kappa/Lambda suficiente para 20 determinaciones. Los siguientes reactivos para la compensación específica de tándems. Se suministran listos para su uso en formato líquido y con volumen suficiente para 5 determinaciones (5µl/test): CD45-PerCP-Cyanine 5.5 CD19-PE-Cyanine7 CD81-APC-C750 Lambda APC-C750 El tubo 1 contiene la siguiente mezcla de anticuerpos liofilizados para marcaje de superficie (4 viales liofilizados de 5 test cada uno): Anticuerpo frente a CD38-FITC humano, multi-epítopo. Anticuerpo frente a CD56-PE humano, clon: C5.9, isotipo: IgG2b. Anticuerpo frente a CD45-PerCP-Cyanine 5.5 humano, clon: EO1, isotipo: IgG2a. Anticuerpo frente a CD19-PE-Cyanine7 humano, clon: 19-1, isotipo: IgG1. Anticuerpo frente a CD117-APC humano, clon: 104D2, isotipo: IgG1. Anticuerpo frente a CD81-APC-C750 humano, clon: M38, isotipo: IgG1. El tubo 2 está compuesto por: la siguiente mezcla de anticuerpos liofilizados para marcaje de superficie (4 viales liofilizados de 5 test cada uno): Anticuerpo frente a CD38-FITC humano, multi-epítopo. Anticuerpo frente a CD56-PE humano, clon: C5.9, isotipo: IgG2b. Anticuerpo frente a CD45-PerCP-Cyanine 5.5 humano, clon: EO1, isotipo: IgG2a. Anticuerpo frente a CD19-PE-Cyanine7 humano, clon: 19-1, isotipo: IgG1. la siguiente mezcla de anticuerpos liofilizados para marcaje citoplasmático (4 viales liofilizados de 5 test cada uno): Anticuerpo de cabra frente a CyIgκ-APC humano, clon: policlonal. Anticuerpo de cabra frente a CyIgλ-APC-C750 humano, clon: policlonal. uso. *CD27 y CD138 no se incluyen en el kit. Se recomienda añadir estos reactivos al cóctel antes de su Todos los componentes contienen 0,09% (p/v) de azida sódica (NaN3). Los reactivos no son considerados estériles. Página 2 de 6 Última revisión: 17/03/2016
Material requerido pero no suministrado Los anticuerpos anti CD27 y CD138 humano deben ser añadidos como drop in (EuroFlow TM recommendation- CD27 BV510 and CD138 BV421). Tubos de ensayo adecuados para la adquisición de las muestras en el citómetro de flujo utilizado. Habitualmente se utilizan tubos con fondo redondo de 6 ml, 12x75 mm Pipeta automática y puntas Cronómetro Agitador Vortex Centrífuga Solución lisante de eritrocitos que contiene fijador Tampón fosfato (PBS) con azida sódica 0.09% (p/v) y 0,5 % (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO El reactivo es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta cuando se almacena a una temperatura de 2-8ºC. El reactivo no se debe congelar ni exponer a luz directa durante el almacenamiento o la incubación con las muestras. Mantener el vial en un lugar seco. Una vez abierto, el vial debe ser almacenado en posición vertical para evitar posibles derrames. ADVERTENCIAS Y RECOMENDACIONES 1. Para uso en investigación. 2. Este producto se presenta listo para su utilización. Si se altera mediante dilución o adición de otros componentes, el reactivo debe ser validado por el usuario. 3. El reactivo es estable durante el periodo de tiempo indicado en la fecha de caducidad cuando se almacena apropiadamente. No debe utilizarse después de la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del producto. Si se almacena en condiciones diferentes a las especificadas, tales condiciones deben ser validadas por el usuario. 4. Alteraciones en la apariencia del producto, como la presencia de precipitados o cambios de color, son indicativos de inestabilidad o deterioro. En esas condiciones el reactivo no debe ser utilizado. 5. Contiene azida sódica 0.09% (p/v) (CAS-Nr. 26628-22-8) como conservante, pero aún así se debe tener cuidado para evitar la contaminación bacteriana del reactivo puesto que en esas circunstancias podrían obtenerse resultados incorrectos. Indicaciones de peligro: H302 Nocivo en caso de ingestión Indicaciones de prudencia: P264 Lavarse concienzudamente tras la manipulación. P270 No comer, beber ni fumar durante su utilización. P301+P312 En caso de ingestión, llamar a un centro de información toxicológica o a un médico en caso de malestar. P301+P330 P501 En caso de ingestión, enjuagarse la boca. Eliminar el contenido/el recipiente de conformidad con la normativa local, regional, nacional o internacional. 6. Todas las muestras biológicas y los materiales con los que estén en contacto deben considerarse como riesgos biológicos. Se recomienda su manipulación como sustancias capaces de transmitir infecciones (7) y desecharse con las precauciones reglamentarias establecidas para este tipo de productos. Se recomienda su manipulación con ropa y guantes protectores apropiados y su uso por personal suficientemente cualificado para las técnicas descritas. Evitar el contacto de las muestras con la piel y las membranas mucosas, en caso de contacto lavar inmediatamente con abundante agua. 7. La utilización del reactivo usando tiempos de incubación o temperaturas diferentes a las recomendadas pueden provocar resultados erróneos. Cualquiera de estos cambios deben ser validados por el usuario. 8. Cualquier incidente grave relacionado con el producto debe comunicarse a Cytognos, así como a la autoridad competente del Estado miembro en el que esté establecido el usuario. PROCEDIMIENTO Preparación Las muestras deben ser recogidas en tubos disponibles comercialmente tratados con anticoagulante (se recomienda el uso de EDTA) (8, 9). 1. Determinar el recuento absoluto de leucocitos por µl de la muestra que será procesada. 2. Transferir la muestra que contenga al menos 10 x 10 6 células nucleadas por cada tubo MRD que se va a marcar a un tubo de 50 ml (hay que tener en cuenta que durante el proceso de BulkLysis se pierde un número considerable de células). No emplear más de 2 ml de muestra por 50 ml de solución de lisis. Si se requiere procesar mayor volumen de muestra (por ejemplo, en caso de partir de una concentración celular baja), usar varios tubos de 50 ml. 3. Llenar el tubo hasta alcanzar los 50 ml con BulkLysis (CYT- BL) (diluir a 1x con agua destilada y a temperatura ambiente - RT). 4. Mezclar bien e incubar durante 15 minutos en un agitador tipo roller o un sistema de agitación de muestras. 5. Centrifugar a 800 xg durante 10 minutos y elimine el sobrenadante con una pipeta Pasteur o un sistema de vacío sin alterar el pellet celular. En el tubo quedarán aproximadamente 300 µl de la suspensión celular. Página 3 de 6 Última revisión: 17/03/2016
6. Añadir 2 ml de PBS + 0,09% (p/v) de NaN3 + 0,5 % (p/v) de BSA y resuspender el pellet celular enérgicamente. 7. Completar el volumen del tubo que contiene la suspensión celular hasta un volumen final de 50 ml con PBS + 0,09% (p/v) de NaN3 + 0,5 % (p/v) de BSA. 8. Mezclar bien 9. Centrifugar a 800 xg durante 5 minutos y elimine el sobrenadante con una pipeta Pasteur o un sistema de vacío, sin alterar el pellet celular. 10. Resuspender el pellet celular con 2 ml de PBS + 0,09% (p/v) de NaN3 + 0,5 % (p/v) de BSA. Mezclar bien y transferir a un tubo de 5 ml FACS tube. 11. Lavar el Falcon de 50 ml con 2 ml más de PBS + 0,09% (p/v) de NaN3 + 0,5 % (p/v) de BSA para recuperar las células que pudieran haber quedado en el tubo original. Añadir este volumen al tubo de 5 ml que contiene el resto de la muestra transferida en el paso 10. 12. Centrifugar a 540 xg durante 5 minutos y eliminar el sobrenadante por decantación o empleando pipeta Pasteur. Si el volumen celular remanente es menor de 300 µl, añadir el volumen necesario de PBS + 0,09% (p/v) de NaN3 + 0,5 % (p/v) de BSA hasta alcanzarlo. 13. En el caso de haber empleado varios tubos de 50 ml (debido a la necesidad de lisar grandes volúmenes de muestra) la suspensión celular de la misma muestra puede ser mezclada en este momento, antes de ajustar la concentración celular. Mantener un volumen final pequeño, ya que en el caso de que la concentración celular necesite ser ajustada como se indica en el siguiente paso, puede hacerse fácilmente diluyendo con el buffer recomendado. 14. Ajustar la concentración final a 1 x 10 5 células/µl, resuspendiendo el pellet con PBS + 0,09% (p/v) de NaN3 + 0,5 % (p/v) de BSA. 15. Ajustar el volumen para obtener 100 µl que contengan 10 x106 células de la suspensión celular por cada tubo que será marcado/adquirido. Pasos para el marcaje de marcadores de superficie (MM-MRD Tubo 1): Reconstituir el vial liofilizado con 180 µl de agua destilada, mezclar bien y esperar al menos 30 minutos. Añadir 30 µl de la mezcla de anticuerpos y el volumen adecuado de CD27 y CD138 (no incluidos en la mezcla) en un tubo. A continuación añadir la suspensión celular (10 x 10 6 células por tubo). Para un marcaje óptimo, si es necesario, complete hasta alcanzar un volumen final de 200 µl con PBS. Incubar 30 minutos a temperatura ambiente y protegido de la luz. Añadir 2 ml de solución de lisis con fijador. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente y protegido de la luz. Resuspender el pellet celular con 500 µl de PBS + 0,5 % (p/v) de BSA (sin NaN3). Adquirir las células inmediatamente tras el marcaje o (si no es posible) almacenar a 4ºC (durante 1 h como máximo) hasta que se mida en el citómetro de flujo. Adquirir la muestra a velocidad de flujo media. Pasos para el marcaje combinado de marcadores de superficie y citoplasmáticos (MM-MRD Tubo 2): Reconstituir el vial liofilizado para el marcaje de superficie con 120 µl con agua destilada, mezclar bien y esperar al menos 30 minutos. Añadir 20 µl de la mezcla de anticuerpos y el volumen adecuado de CD27 y CD138 (no incluidos en la mezcla) en un tubo. A continuación añadir la suspensión celular (10 x 10 6 células por tubo). Para un marcaje óptimo, si es necesario, complete hasta alcanzar un volumen final de 200 µl con PBS. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente y protegido de la luz. Resuspender el pellet celular agitando vigorosamente. Añadir 100 µl de Reactivo A (fijador; Fix&Perm, Nordic-MUBio BV, The Netherlands) y mezclar bien. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente y protegido de la luz. Página 4 de 6 Última revisión: 17/03/2016
Resuspender el pellet celular agitando vigorosamente. Añadir 100 µl de Reactivo B (solución de permeabilización; Fix&Perm, Nordic-MUBio BV, The Netherlands). Reconstituir los viales liofilizados para el marcaje citoplasmático empleando 70 µl de agua destilada. Añadir 10 µl de la mezcla de anticuerpos al tubo que contiene 200 µl de Reactivo B + suspensión celular. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente y protegido de la luz. Resuspender el pellet celular con 500 µl de PBS + 0,5 % (p/v) de BSA (sin NaN3). Adquirir las células inmediatamente tras el marcaje o (si no es posible) almacenar a 4ºC (durante 1 h como máximo) hasta que se mida en el citómetro de flujo. Adquirir la muestra a velocidad de flujo media. Recomendaciones Importantes Para obtener resultados óptimos, es necesario seguir el Protocolo Operativo Estandar de EuroFlow para la configuración del Citómetro (10). Encontrará una guía completa (Cytometer Setup SOP) en la web www.euroflow.org, que incluye recomendaciones para el FSC, SSC y los ajustes diana de voltaje del PMT, compensación y supervisión del rendimiento del instrumento. Análisis por citometría de flujo Cytognos recomienda el uso del software de análisis Infinicyt TM (11), que proporciona una revolucionaria aproximación para la integración de datos y para el análisis multidimensional de los datos de citometría de flujo. Sus innovadoras características hacen más sencillo, rápido y preciso el análisis y la interpretación de los resultados. Infinicyt comprende herramientas exclusivas que permiten una mejor identificación y descripción de las diferentes poblaciones celulares. Infinicyt se está desarrollando como parte del proyecto EuroFlow, Flow cytometry for fast and sensitive diagnosis and follow-up of haematological malignancies, que implica a profesionales en citometría de flujo muy cualificados. Infinicyt incluye una amplia variedad de herramientas de análisis y gráficas exclusivas que permiten el análisis con una imagen de referencia, o calcula nuevos parámetros virtuales. Encontrará información completa acerca de InfinicytTM en el sitio web: www.infinicyt.com. Pasos del análisis por citometría de flujo: 1. Cargar el perfil Plasma Cell MM-MRD. 2. Cargar la estrategia de análisis. 3. Chequear la población de PCs y confirmar que su expresión para CD38 y CD138 es positiva, y de débil a negativa para CD45. Mover las regiones de análisis de acuerdo con la imagen de cada caso individual siempre que sea necesario. 4. Identificar la población de PC. 5. Cargar la imagen de referencia de las PC normales desde el perfil. 6. Clasificar la población de PC de acuerdo con la expresión de CD19 y de CD56. 7. Chequear el ratio kappa/lambda de cada una de las subpoblaciones de PC. 8. Chequear la expresión anormal de CD27 (expresión baja o negativa aberrante), CD117 (expresión positiva aberrante) y CD81 (expresión completamente negativa aberrante) en las PC malignizadas. LIMITACIONES Es recomendable adquirir en el citómetro las muestras teñidas lo antes posible para optimizar los resultados, en caso contrario podrían marcarse de forma inespecífica células no viables. La exposición prolongada a reactivos líticos puede producir la degradación de los leucocitos y la pérdida de células de la población de interés. La presencia de glóbulos rojos nucleados y concentraciones anormales de proteína o hemoglobinopatías pueden dar lugar a la lisis incompleta de eritrocitos. Estas condiciones pueden dar lugar a recuentos celulares falsamente bajos puesto que los eritrocitos no lisados pueden ser contados como linfocitos. Los resultados obtenidos por citometría de flujo pueden ser erróneos si el láser del citómetro no está perfectamente alineado o silos diagramas usados para el análisis no son los adecuados. Es importante comprender el patrón normal de expresión de este antígeno y su relación con la expresión de otros antígenos relevantes con el fin de realizar un análisis adecuado. CONTROL DE CALIDAD Para obtener resultados óptimos se recomienda verificar la precisión de las pipetas y que el citómetro está correctamente calibrado. Los fluorocromos usados en citometría emiten a distintas longitudes de onda pero tienen cierto solapamiento espectral que debe corregirse mediante compensación electrónica si se emplean combinaciones de distintos AcMo Página 5 de 6 Última revisión: 17/03/2016
conjugados con estos fluorocromos. Para evaluar la unión inespecífica del anticuerpo puede prepararse un tubo de control isotípico. La fabricación de este producto sigue las normas de producción y los sistemas de calidad en conformidad con la norma ISO 13485:2012. BIBLIOGRAFÍA 1. Andy C. Rawstron, J. Anthony Child, Ruth M. de Tute, Faith E. Davies, Walter M. Gregory, Sue E. Bell, Alexander J. Szubert, Nuria Navarro-Coy, Mark T. Drayson, Sylvia Feyler, Fiona M. Ross, Gordon Cook, Graham H. Jackson, Gareth J. Morgan, and Roger G. Owen. Minimal Residual Disease Assessed by Multiparameter Flow Cytometry in Multiple Myeloma: Impact on Outcome in the Medical Research Council Myeloma IX Study. J of Clinical Oncology. 31(20): 2540-2547 (2013). 2. Mark Roschewski, Maryalice Stetler-Stevenson, Constance Yuan, Sham Mailankody, Neha Korde, and Ola Landgren. Minimal Residual Disease: What Are the Minimum Requirements? J of Clinical Oncology. 32(5): 475-476 (2014). 3. Andy C. Rawstron et al. Report of the European Myeloma Network on multiparametric flow cytometry in multiple myeloma and related disorders. Haematologica 93(3): 431-438 (2008). 4. Stetler-Stevenson M, Paiva B, Stoolman L, Lin P, Jorgensen JL, Orfao A, Van Dongen J, Rawstron AC. Consensus guidelines for myeloma minimal residual disease sample staining and data acquisition. Cytometry B Clin Cytom. (2015 Apr 23) doi: 10.1002/cyto.b.21249. 5. Arroz M, Came N, Lin P, Chen W, Yuan C, Lagoo A, Monreal M, de Tute R, Vergilio JA, Rawstron AC, Paiva B. Consensus guidelines on plasma cell myeloma minimal residual disease analysis and reporting. Cytometry B Clin Cytom. (2015 Jan 23) doi: 10.1002/cyto.b.21228. 6. Jeroen F. van Velzen, Dorine van den Blink, and Andries C. Bloem. Inability of a Monoclonal Anti-Light Chain Antibody to Detect Clonal Plasma Cells in a Patient with Multiple Myeloma by Multicolor Flow Cytometry. Cytometry B Clin Cytom. 84(1): 30-32 (2013). 7. Protection of Laboratory Workers from occupationally acquired infections. Second edition; approved guideline (2001). Villanova PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards; Document M29-A2. 8. Procedures for the collection of diagnostic blood specimens by venipuncture- approved standard; Fifth edition (2003). Wayne PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards; Document H3-A5. 9. Clinical applications of flow cytometry: Quality assurance and immunophenotyping of lymphocytes; approved guideline (1998). Wayne PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards; Document H42-A. 10. Kalina T, Flores-Montero J, van der Velden VHJ, Martin-Ayuso M, Böttcher S, Ritgen M, et al. EuroFlow standardization of flow cytometry instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia, 2012 Sep; 26(9):1986-2010. doi:10.1038/leu.2012.122. 11. Cytognos. 2011. Infinicyt Flow Cytometry Software. Version 1.7. Cytognos S.L. Salamanca, Spain. http://www.infinicyt.com GARANTÍA Este producto está garantizado sólo en cuanto a su conformidad con la cantidad y el contenido indicados en la etiqueta. No hay otras garantías más allá de lo indicado en la etiqueta del producto. La única responsabilidad de Cytognos se limita a la sustitución del producto o el reembolso del precio de compra. EXPLICACIÓN DE SÍMBOLOS PRODUCIDO POR CYTOGNOS S.L. Polígono La Serna, Nave 9 37900 Santa Marta de Tormes Salamanca (España) Teléfono: + 34-923-125067 Fax: + 34-923-125128 Información de pedidos: admin@cytognos.com Información técnica: support@cytognos.com www.cytognos.com Página 6 de 6 Última revisión: 17/03/2016