Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, Septiembre 2016 3 er. Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Memorias Utilización de técnicas de proteómica para análisis de expresión de proteínas en líneas celulares con cáncer de mama y cáncer cervicouterino. Guadalupe Joliett Patrón Andrew (Becaria) america_andrew@hotmail.com Unidad Académica Preparatoria No.38, Universidad Autónoma de Guerrero. Berenice Illades Aguiar (Asesora) b.illadesaguiar@gmail.com Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero. Laboratorio de Biomedicina Molecular Introducción Este proyecto de investigación se hizo con la finalidad de conocer más a fondo el cáncer; ya que como se sabe el cáncer constituye un problema de salud pública enorme y costosa en todo el mundo; tanto en términos económicos como en relación al sufrimiento humano que origina. Las células cancerosas se caracterizan por dos propiedades; 1) se reproducen a pesar de las restricciones normales. 2) invaden y colonizan territorios normalmente reservados a otras células. La combinación de estas dos características es lo que hace que los canceres se han tan peligrosos. Entre los canceres que se reconocen como muy malignos y que han causado una extrema mortalidad mundial es el cáncer de mama; el cáncer de mama o cáncer de seno es un proceso oncológico en el que células sanas de la glándula mamaria degeneran y se transforman en tumorales, proliferando y multiplicándose posteriormente hasta constituir el tumor que a menudo se puede observar en una radiografía o se puede palpar como una protuberancia. Otro de los canceres que ha causado una extrema morbilidad y mortalidad es el cáncer Cervicouterino; el cáncer cervical es una enfermedad en la cual las células del cuello uterino se vuelven anormales y 378
Memorias del 3 er Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT comienzan a crecer sin control. Aproximadamente el 90% son carcinomas de células escamosas, y el restante 10% son adenocarcinomas. Este tipo de cáncer se origina en las células que revisten el cuello uterino, la parte inferior del útero (matriz). Para el estudio del cáncer la ciencia desarrollo nuevas tecnologías como ejemplo la proteómica donde con el uso de la proteómica y sus dos diferentes técnicas de electroforesis Unidimensional (1D) y Bidimensional (2D) se puede ver con la ayuda de geles de poliacrilamida la similitud que hay entre estos dos tipos de cáncer usando líneas celulares de estos dos tipos de cáncer en caso de cáncer de mama la línea celular MDA y para cáncer cervicouterino C33A, SiHa y HeLa. Objetivos Objetivo general Conocer técnicas para el análisis proteómico de líneas celulares con cáncer de mama y cáncer cervicouterino. Objetivo particular Analizar el perfil de proteínas empleando técnicas de electroforesis en 1D y 2D. cáncer. Determinar y comparar la expresión de proteínas de muestras de ambos tipos de Metodología Cultivos celulares: Se emplearon 4 líneas celulares, Si Ha HeLa y C33A de tejido Cervical y MDA de tejido de glándula mamaria para la comparación de expresión de proteínas. Cuantificación de proteínas. La cuantificación de proteínas en las muestras se realizó mediante el método de Bradford, utilizando el Nanodrop. Se hicieron alícuotas de 2 µl de cada muestra, 18µl del agua y 180 del reactivo de Bradford, se cargaron por duplicado, las concentraciones de proteína se estimaron por absorbancia a una longitud de onda de 595 nm comparando con una curva estándar obtenida a partir de una serie de diluciones de albumina sérica bovina (BSA) Electroforesis unidimensional. Las muestras se sometieron a SDS-PAGE al 7.5 y 15% de acuerdo al protocolo descrito por Laemmli (Laemmli, 1970). El corrimiento inicio 379
Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, 2016 aplicando 80 V durante 20 min aumentando el voltaje a 180 V durante 1 h aproximadamente. El corrimiento electroforético se tiño con el colorante Azul de Comassie. Electroforesis Bidimensional. Para realizar la electroforesis en dos dimensiones (2D), las muestras se disolvieron en amortiguador para isoelectroenfoque (135 µl), de acuerdo al protocolo descrito por O Farrel (Farrel, 2010) y Klose (Klose y kobalz, 1995). Los extractos solubles de proteínas (400 µg) se dejaron hidratar en tiras prefabricadas de acrilamida de 7 cm, con un rango de ph de 4 a 7 (lineal) (BIORAD, No. De Cat. 163-2004). Las tiras se rehidrataron durante 12 horas a temperatura ambiente, sumergidas en aceite mineral (BIORAD) en el equipo PROTEAN 12 IEF System (BORAD). Después de la rehidratación, se llevó a cabo el isoelectroenfoque sobre un sistema IEF (BIORAD) a 22 C, usando el siguiente protocolo: 20 min a 250 V, 2.5 h a 4000 V, hasta alcanzar 10 000 V/hora. Posterior a la electroforesis en poliacrilamida, las tiras IPG se sometieron a reducción y alquilación, incubándolas durante 10 min en una solución con 8 M de urea, 30% de glicerol, 2% de SDS y 125 mm de DTT, y 10 min en la misma solución tampón en la que se reemplazará el DTT por 125 mm de iodoacetamida, al finalizar se les colocó 2 ml se buffer de corrida por 5 minutos. Después de esto se realizara la separación de proteínas de acuerdo a su peso molecular colocando las tiras equilibradas sobre geles de poliacrilamida al 10 % en presencia de SDS y cubiertas con overlay agarosa (BIORAD, No. De Cat. 163-2111). La electroforesis se llevara a cabo usando el sistema Miniprotean (BIORAD, Hércules, CA, USA), a un voltaje de 80 V por 5 min. Después de esto se aplicara un voltaje de 120 a 20 C. Los geles serán teñidos con azul de comassie. Resultados Se cuantificaron 4 líneas celulares por duplicado empleando el método de Bradford para realizar geles en una dimensión (MDA, SiHa, HeLa y C33A) Estos fueron los resultados de la cuantificación: Concentración de proteína Blanco 0.017 MDA #1 1.513 MDA #2 1.413 SiHa #1 1.351 SiHa #2 1.414 HeLa #1 1.262 HeLa #2 1.167 C33A #1 0.862 C33A #2 0.807 380
Memorias del 3 er Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT a) b) Figura 1. Gel concentrador de BSA en SDS-PAGE al 10%. a) En la figura se muestra un patrón de peso molecular como control y la albumina que tiene un peso molecular de 65 KD. b) análisis densitométrico de la muestra con BSA. a) b) Figura 2.- Patrones de proteínas en SDS-PAGE 1D a dos concentraciones 10 y 40 µg de proteína. a) Gel SDS- PAGE al 15% y b) al 7.5%, cargado con 4 líneas celulares, tres provenientes de cérvix (HeLa, SiHa y C33A) y una de Glándula mamaria (MDA), teñidas con Azul de Coomassie. 381
Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, 2016 a) b) Figura 3. SDS-PAGE 2D al 10% con un ph de 4--7 con las líneas celulares SiHa y MDA. a) Se muestra un gel SDS-PAGE cargado con la línea celular SiHa (proveniente de cérvix) el cual muestra un rango en el que se observan los spots dentro de un ph de 5.5 6.5, en una zona de peso molecular intermedio y b) gel SDS-PAGE cargado con la línea celular MDA (línea celular de glándula mamaria), teñidas con azul de Plata. Conclusión Gracias al uso de nuevas tecnologías que se emplean en la proteómica se ha podido conocer el perfil de expresión de proteínas en geles de una y dos dimensiones, en los cuales se observó que existen diferencias en la expresión de bandas como de puntos entre las 4 líneas celulares provenientes de diferentes tipos de cáncer. Es así como el uso de técnicas para el análisis proteómico muestra específicamente cambios en la expresión de proteínas dado por diferentes condiciones, el cual es una herramienta para poder predecir el comportamiento de las enfermedades o del cómo se pueden utilizar como un biomarcador. En conclusión en este trabajo se mostró que tanto la electroforesis en una y en dos dimensiones con geles SDS-PAGE pueden ser utensilios que proporciones una gran información para el desarrollo de terapias para los diferentes tipos de cáncer que se presentan en la actualidad en nuestro estado que se ha visto afectado principalmente por dos tipos principales de cáncer, el cervicouterino y el de mama. 382
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