Expresión de CDH2 en la biopsia de cáncer cervicouterino positiva la variante AA-c de E6 del VPH16.

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1 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, Septiembre er. Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero de Septiembre 2016 Memorias Expresión de CDH2 en la biopsia de cáncer cervicouterino positiva la variante AA-c de E6 del VPH16. Josué Zurita Pablo (Becario) zuritapablo99@hotmail.com Unidad Académica Preparatoria No. 41, Universidad Autónoma de Guerrero. Dra. Olga Lilia Garibay Cerdenares (Asesor) olgaribay@hotmail.com Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero. Introducción El cáncer se caracteriza por la proliferación descontrolada de células anormales, que tienen la capacidad de secretar sustancias biológicamente dañinas, y tienen el potencial de invasión y destrucción de los tejidos adyacentes o a distancia. (Generalidades ) El cáncer Cervicouterino (CaCU) es uno de los principales problemas de salud pública en las mujeres a nivel mundial. El CaCU es la alteración celular que se origina en el epitelio del cuello del útero y al inicio, se manifiesta a través de pequeñas lesiones precursoras, habitualmente en una lenta y progresiva evolución en el tiempo. En grado variable, las lesiones, evolucionan a displasia severa cuando compromete solo al epitelio superficial y luego a cáncer invasor cuando el compromiso traspasa la membrana basal. (Ministerio de Salud, 2015) La Organización Mundial de la Salud (OMS) reconoce varios tipos histológicos de CaCU, siendo los dos principales: 1. Carcinoma de células escamosas (constituye cerca del 80-85% de todos los casos). 2. Adenocarcinoma (constituye cerca del 10-12% de todos los casos). (Ministerio de Salud, 2015) 485

2 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, 2016 A nivel mundial el CaCU ocupa cuarto lugar en los tipos de cáncer de origen ginecológico, y el séptimo de todos los tipos de cáncer, con un estimado de 528,000 casos nuevos para el De acuerdo a datos del GLOBOCAN, durante este mismo año se reportaron cerca de 266,000 muertes por cáncer cervical en todo el mundo, representando el 7.5% de todas las muertes por cáncer en mujeres. En México, el CaCU es la primera causa de muerte por neoplasias malignas entre las mujeres de 25 a 64 años. En el 2006 Guerrero se ubicó en el cuarto lugar a nivel nacional en la tasa de mortalidad con 12.5% muertes, superando la tasa de mortalidad nacional que fue de 9.1% por cada 100,000 mexicanas (Secretaria de Salud, 2006) y para el 2013 presentó la quinta tasa de defunción más alta a nivel nacional por CaCU en mujeres de 25 años, con 14.1% por cada 100,00 mujeres (Secretaria de Salud, 2015). Aun cuando se ha demostrado que la infección por los VPH- AR, dentro de los cuales se encuentra el VPH16, promueve la alteración en la expresión de genes celulares relacionados con procesos carcinogénicos, se requiere la validación funcional de estos resultados a partir de la comparación de los perfiles de expresión proteica mediante tecnologías de reciente avance como la Proteómica. En el 2015 en un estudio realizado en el laboratorio de Biomedicina Molecular de la Facultad de Ciencias Químico Biológicas de la UAGro, por Ortiz Ortiz y colaboradores en la población guerrerense se encontró la presencia de 27 variantes de E6 del VPH16. Dentro de las cuales la más común fue la E-G350 (40%) seguida por la E- prototipo (13.03%), E-C188/G350 (11.82%), AA-a (10.61%), AA-c (6.07%) y E-A176/G350 (5.15%), siendo la variante AA-a, E-A176/G350 y AA-c las que mostraron mayor riesgo de conducir al desarrollo de CaCU. (Ortiz-Ortiz, 2015) Por último los resultados recientemente publicados por Zacapala-Gomez y colaboradores en el 2015 en este mismo laboratorio, demostraron que las variantes AA-a, AA-c y las EUR (E-G350, E-A176/G350, E-C 188/G350) previamente reportadas, alteran la expresión de un total de 436 genes en células C-33A transfectantes estables con las variantes de E6, de los cuales fueron validados un grupo de genes involucrados en adhesión celular (AMOTL1, CDH2, CDH6, CDH9, COL11A1, NID1, NRCAM y CALCR). La expresión alterada de dichos genes sugiere que los cambios presentes en la secuencia del gen E6 del VPH16 son suficientes para alterar el perfil global de la expresión génica en una línea celular tumoral. (Zacapala-Gómez, 2015) 486

3 Memorias del 3 er Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero de Septiembre 2016 Debido a que el laboratorio de Biomedicina Molecular cuenta con un Biobanco de biopsias de tejido cervical provenientes del Instituto Estatal de Cancerología (IECan) Dr. Arturo Beltrán Ortega ubicado en Acapulco Guerrero, se analizará la expresión de CDH2 en una biopsia obtenida de una mujer guerrerense con CaCU positiva a la infección con VPH16 y con la variante AA- c de E6 del VPH16. Marco Teórico Qué es el cáncer? De acuerdo a la Organización Mundial de la Salud (OMS) el cáncer es un proceso de crecimiento y diseminación incontrolado de las células. La transformación de las células normales en células cancerosas surge como consecuencia de daño al ADN, dando lugar a células inmortales en continua división que pueden formar un tumor visible (Tumor primario) que invade el tejido circundante y puede provocar metástasis en puntos distantes del cuerpo. (Generalidades, s.f.) Los distintos tipos de cáncer tienen comportamientos diferentes tales como la tasa de crecimiento, diseminación y respuesta al tratamiento, y se clasifican en etapas o estadios en función del tumor primario (tamaño e invasión local) y de su extensión a otros órganos (afectación ganglionar o metastásica). La estatificación se basa en las fases del desarrollo del cáncer añadiendo otras variables como la localización anatómica, tipo de tumor, grado histológico, extensión, etc; e información como la historia clínica, exploración física y exploraciones complementarias. (Generalidades, s.f.) De acuerdo al origen de las células canceras existen cinco tipos de cáncer: carcinomas, sarcomas, linfomas, leucemias y mielomas. La extensión tanto local como a distancia de estos tipos de cáncer permiten analizar las opciones terapéuticas y el pronóstico del paciente. (Generalidades, s.f.) El CaCU y su epidemiologia. El Cáncer Cervicouterino (CaCU) es un problema de salud pública en mujeres a nivel mundial. (Torre et al., 2015). El 80-90% de los casos de CaCU tienen su origen en las células escamosas del epitelio del cuello del útero, en donde la lesión precursora es la neoplasia intraepitelial del cuello uterino (NIC), la cual puede evolucionar a carcinoma in situ (CIS) y después a cáncer 487

4 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, 2016 invasivo. Dicha progresión es lenta y en grado variable comprometiendo solo al epitelio superficial y luego traspasa la membrana basal. (Ministerio de Salud, 2015) A nivel mundial el CaCU ocupa cuarto lugar en los tipos de cáncer de origen ginecológico, y el séptimo de todos los tipos de cáncer, con un estimado de 528,000 casos nuevos para el De acuerdo a datos del GLOBOCAN, durante este mismo año se reportaron cerca de 266,000 muertes por cáncer cervical en todo el mundo, representando el 7.5% de todas las muertes por cáncer en mujeres. (GLOBOCAN, 2012) En México, el CaCU es la primera causa de muerte por neoplasias malignas entre las mujeres de 25 a 64 años. En el 2005 la tasa media nacional de mortalidad fue del por cada 100,000 mujeres de 25 años o más, lo cual corresponde a 4,247 defunciones. En el 2006 Guerrero se ubicó en el cuarto lugar a nivel nacional en la tasa de mortalidad con 12.5% muertes, superando la tasa de mortalidad nacional que fue de 9.1% por cada 100,000 mexicanas (Secretaria de Salud, 2006) y para el 2013 presentó la quinta tasa de defunción más alta a nivel nacional por CaCU en mujeres de 25 años, con 14.1% por cada 100,00 mujeres (Secretaria de Salud, 2015). La OMS reconoce dos tipos histológicos principales del CaCU: 1. Carcinoma de células escamosas (constituye cerca del 80-85% de todos los casos). 2. Adenocarcinoma (constituye cerca del 10-12% de todos los casos). Otros tipos de carcinoma (carcinoma adenoescamosos, adenoidequisticos, neuroendocrinos, metastásico) constituyen del 3-5% de casos restantes. (Ministerio de Salud, 2015) El CaCU inicia como una lesión precursora conocida como Neoplasia Intraepitelial Cervical (NIC) la cual consiste en un crecimiento descontrolado de las células escamosas del cuello uterino. En la mayoría de los casos estas células permanecen estables o son eliminadas por el sistema inmune del individuo sin intervención médica. Sin embargo un pequeño porcentaje de los casos progresan a cáncer cervical, provocado por una célula invasora en un carcinoma de células escamosas. La causa principal de las NIC es una previa infección de transmisión sexual, por el virus del papiloma humano (VPH) principalmente los tipos oncogénicos 16 y

5 Memorias del 3 er Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero de Septiembre 2016 El sistema de clasificación de las NIC incluye a las lesiones escamosas precancerosas y las clasifica en grados: NIC1, NIC2 y NIC3, tal como se indica en el siguiente cuadro y se muestra en las figuras. Cuadro 1. Clasificación de las NIC. Grado NIC Sistema Bethesda Prueba histológica Prueba de cito e histológica I II III IV NIC1 NIC2 NIC3 NIC3 Límites normales Inicio de cabios celulares ASC- US/ASC-H LEIBG LEIAG V Carcinoma invasivo Carcinoma invasivo * Tabla modificada tomada de Jenkins, D Histopathology and cytopathology of cervical cancer. Dis Markers, 23(4): Figura 1. Neoplasia Intraepitelial Cervical Estadificación 1 (NIC1) del CaCU. Figura 2. Neoplasia Intraepitelial Cervical 2. (NIC2) Figura 3. Neoplasia Intraepitelial Cervical 3. (NIC3) 489

6 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, 2016 De acuerdo a la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia (FIGO), el CaCU puede agruparse en cuatro estadios, cuyas características se encuentran en el cuadro 2. (Benedet et al., 2000; Álvarez et al., 2012) Debido al incremento en el número de casos de cáncer se optó por desarrollar un sistema para medir los estadios del cáncer. El sistema TMN es un método de estadificación de neoplasias desarrollado por la AJCC (American Joint Committe on Cancer) en colaboración con UICC (Union Internacional contra el Cáncer). Su objetivo general es determinar correctamente el estadio de los diferentes tumores. La extensión anatómica del tumor constituye la base de la estadificación, los índices expresan la progresión de la enfermedad y se basa en componentes que son el reflejo de la extensión del tumor: T: Extensión del tumor primario, atendiendo al tamaño e invasión de las estructuras vecinas. El estadio T0 representa un tumor que aún no ha iniciado su capacidad invasiva en los tejidos locales, denominándose también in situ. (Gonzáles, 2004) M: Extensión tumoral a los ganglios linfáticos regionales. Solo se incluyen en esta clasificación los ganglios linfáticos del área del drenaje del tumor primario. La afectación de los ganglios linfáticos a distancia se considera una enfermedad metastásica. La consideración de los cuales son los ganglios regionales depende del tipo de cáncer. En general, la afectación extensa significa la combinación de un mayor número de ganglios afectados, mayor extensión (tamaño de ganglios afectados) y afectación ganglionar a mayor distancia (pero manteniéndose todavía en categoría de ganglios regionales). (Gonzáles, 2004) N: Analiza la presencia o no de metástasis a distancia. (Gonzáles, 2004) Cuadro 2. Estadios del CaCU. Categoría Estadío Descripción TNM FIGO Tx El tumor primario no puede evaluarse. T0 No hay evidencia de tumor primario. Tis* Carcinoma In situ. T1 I Carcinoma cervical confinado al útero. T1a** IA Carcinoma invasor diagnosticado solo con microscopía. T1a1 IA1 Invasión estromal < 3mm en profundidad y horizontal < 7mm T1a2 IA2 Invasión estromal 3-5mm de profundidad y horizontal < 7mm T1b IB Lesión clínicamente visible confinada a cuello o lesión 490

7 Memorias del 3 er Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero de Septiembre 2016 microscópica mayor que IA1. T1b1 IB1 Lesión clínicamente visible < 4cm en su mayor diámetro. T1b2 IB2 Lesión clínicamente visible > 4cm en su mayor diámetro. T2 II Carcinoma que invade más allá del útero, pero no compromete la pared pelviana o el tercio inferior de la vagina. T2a IIA Tu sin invasión de parametrios. T2a1 IIA1 Lesión clínicamente visible < 4cm en su mayor diámetro. T2a2 IIA2 Lesión clínicamente visible > 4cm en su mayor diámetro. T2b IIB Tumor con invasión de parametrios, sin llegar a la pared pelviana. T3 III Tumor que se extiende a la pared pelviana y/o compromete el tercio inferior de la vagina y/o hidronefrosis o alteración de la función renal. T3a IIIA El tumor compromete el tercio inferior de la vagina, sin extensión a la pared pelviana. T3b IIIB El tumor se extiende a la pared pelviana y/o causa hidronefrosis o alteración función renal. T4 IVA El tumor invade la mucosa de la vejiga o del recto y/o se extiende más allá de la pelvis. N1*** IIIB El tumor se extiende a la pared pelviana y/o causa hidronefrosis o alteración de la función renal, con presencia de ganglios linfáticos regionales metastásicos. M1 IVB Metástasis a distancia. (Ministerio de Salud, 2015) Los VPH- AR y su relación con el CaCU. El virus del papiloma humano (VPH) pertenece a la familia de los Papillomaviridae, y tiene un genoma de ADN de doble cadena de aproximadamente 8,000 pares de bases. De acuerdo a su oncogenicidad, los VPHs se clasifican en VPHs de alto riesgo (VPH- AR) y VPHs de bajo riesgo (VPH- BR). De los más de 100 tipos de VPH descritos, de los VPH-AR como el 16,18,31,35,39,45,51,52,56,58 y 59 existe evidencia suficiente de su carcinogenicidad (de Villiers, et al., 2004, Muñoz, et al., 2006). La infección por el VPH16 y 18 es responsable del 25% de las neoplasias intraepiteliales cervicales tipo 1(NIC1) y del 70% de las NIC2 y NIC3. Los subtipos 16, 18, 31, 33 y 45 son encontrados en 63-97% de los CaCU invasores. El VPH16 es el genotipo más frecuente en el CaCU, detectándose en más del 50% de los casos de CaCU a nivel mundial (Guan, 2012) 491

8 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, 2016 La integración del ADN del VPH16 provoca el rompimiento del gen E2, lo cual resulta en una alteración en los mecanismos regulatorios de la replicación viral. Figura 4. Genoma del VPH16. El genoma del VPH16 está dividido en tres regiones: Una región que contiene los genes tempranos (E1, E2, E4, E5, E6 y E7), una región que contiene los genes tardíos (L1 y L2) los cuales codifican para con las proteínas de la cápside mayor y una región larga de control (LCR, por sus siglas en ingles) que controla la replicación viral. El estado integrado del VPH16 en el genoma de la célula está asociado a la persistencia de la infección y progresión de las lesiones cervicales, las cuales representan un riesgo en la progresión del CaCU. Después de la infección, el VPH16 está presente en su forma episomal pero cuando el ADN viral se integra, la sobreexpresión de sus oncogenes virales E6 y E7 se activa, y con ello la propiedad que tienen sus proteínas de formar complejos e inactivar a otras proteínas celulares. (Ganguly and Parihar, 2009). Las oncoproteínas E6 y E7 de los VPH- AR pueden provocar alteraciones en el ciclo celular, inactivando las proteínas supresoras de tumores, lo que provoca inestabilidad cromosómica y 492

9 Memorias del 3 er Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero de Septiembre 2016 transformaciones celulares malignas, inmortalización y carcinogénesis. (Narisawa-Saito and Kiyono, 2007; Yim and Park, 2005). E6 es la oncoproteína viral más estudiada del VPH16. Está constituida por 151 aminoácidos, y tiene como característica estructural la presencia de dos dedos de zinc, que tienen funciones como la activación transcripcional, la transformación e inmortalización celular. (Boulet et al., 2007; Ghittoni et al., 2010). E6 induce la degradación de la proteína supresora de tumor p53 vía proteasoma y descontrola la progresión del ciclo celular provocando un crecimiento acelerado de las células. (Yim and Park, 2006; Ganguly and Parihar, 2009) La Proteómica en el diagnóstico del CaCU. Debido a que con las técnicas de diagnóstico convencionales no es suficiente detectar el CaCU en estadios tempranos y estudiar la progresión de la enfermedad, uno de los principales enfoques de la tecnología es la búsqueda de biomarcadores de enfermedad mediante el uso de técnicas de reciente avance como la Proteómica. La Proteómica es uno de los campos que puede ayudar a establecer conexiones entre las secuencias genómicas (genes) y su función biológica (proteínas). Es el estudio a gran escala de todas las proteínas que se expresan en una célula a partir de su genoma mediante métodos bioquímicos. El análisis proteómico requiere de otras ciencias como bilogía molecular, bioquímica, microbiología y bioinformática, siendo esta última de gran importancia para el desarrollo de ordenadores de máxima capacidad para organizar gran cantidad de información que se genera en las diversas investigaciones científicas. (Pando- Robles, 2009) Existen tres ramas en la Proteómica que tratan de caracterizar a las proteínas estudiando de estas distintos aspectos: - Proteómica de expresión: Se encarga del estudio de la abundancia de proteínas y sus modificaciones pos- traduccionales. - Proteómica Estructural: Se encarga de caracterizar la estructura tridimensional de las proteínas. - Proteómica Funcional: Se encarga de la localización y distribución subcelular de proteínas y de sus interacciones, así también de otras moléculas para determinar su función. 493

10 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, 2016 Las técnicas más usadas en la Proteómica se basan en la electroforesis unidimensional y electroforesis bidimensional, en la cual las proteínas se separan de acuerdo a su peso molecular y peso molecular/ punto isoeléctrico, respectivamente; y en la espectrometría de masas, en la que las proteínas son detectadas en base a su huella peptídica. (Morales-Sánchez y Gallo-Ramírez, 2006). Con la tecnología Proteómica se puede identificar, caracterizar y clasificar proteínas, basándose en la función que desempeñen y sus interacciones. El análisis del proteoma ha sido de gran ayuda en la identificación de proteínas como marcadores de diagnóstico y pronostico en el desarrollo y progresión del CaCU. Proteínas: Biomarcadores de diagnóstico y pronóstico en el CaCU. Los recientes avances en la Proteómica han impulsado el descubrimiento de nuevos biomarcadores tumorales que son útiles en la detección y pronostico del CaCU. Por estas razones actualmente se considera a la Proteómica una herramienta importante para el descubrimiento de nuevos biomarcadores que favorecerán a salud pública. Durante los últimos años la genómica, Proteómica y bioinformática han experimentado un sorprendente desarrollo en los avances de la medicina. Cada vez es más frecuente el uso de biomoléculas para obtener información relativa al desarrollo de procesos biológicos aplicables a la producción industrial como diagnóstico y pronóstico de enfermedades, la monitorización de tratamientos, incluso el diseño de nuevos medicamentos. Los biomarcadores son moléculas que sirven como indicadores del estado fisiológico y también de los cambios que se producen durante el proceso y que desembocan en el desarrollo y establecimiento de un padecimiento, y cuyos requisitos fundamentales son una elevada especificidad y sensibilidad. Se realiza una búsqueda intensa de biomarcadores de diferentes afecciones mediante Proteómica. (Pando- Robles, 2009) La identificación de proteínas que intervienen en diversas etapas de una enfermedad ayudará a comprender las bases moleculares y naturaleza de dicha anomalía, de la misma manera, estas proteínas identificadas pueden utilizarse como biomarcadores de diagnóstico o pronóstico de dicha enfermedad. 494

11 Memorias del 3 er Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero de Septiembre 2016 Las proteínas como marcadores tumorales se asocian al diagnóstico y pronostico del CaCU, pueden ser utilizadas para la el monitoreo en curso del tratamiento, remisión y recurrencia mientras la paciente recibe cirugía, radiación y quimioterapia. Estudios realizados demostraron que los oncogenes E6 y E7 se interponen a los procesos celulares normales y han propuesto a la expresión de su ARNm como posible biomarcador en la detección del CaCU. Otro de los biomarcadores más comunes en el diagnóstico del CaCU incluyen a p16 INK4A, SSC- Ag (antígeno de carcinoma de células escamosas), Ki-67, MCM y TOP2A. (Breuer and Murph, 2011). Existen estudios en los cuales la expresión de algunos ARNs pequeños como los micrornas (por sus siglas en inglés) se han propuesto como biomarcadores para el diagnóstico y pronostico del CaCU. Para el análisis proteómico se utilizan también modelos in vivos (ratones transgénicos) de cáncer para analizar el papel de las oncoproteínas E6 y E7 en la adhesión celular, proliferación e invasión. (Martinez, Medicina y Ciencias de la Salud, 2011). La infección por VPH genera una respuesta inmune humoral contra las proteínas de la capside L1 y L2, la cual puede ser neutralizada. También se genera una repuesta de anticuerpos contra las proteínas tempranas del virus, que no es protectora y que hasta ahora se utiliza para el estudio de la biología del virus y la eficacia de las vacunas contra el HPV. Diversos estudios sugieren que la respuesta humoral contra proteínas tempranas de HPV puede ser utilizada como biomarcador del estado de la infección y/o del estadio de la lesión cervical. Resultados no publicados obtenidos en el Laboratorio de Biomedicina Molecular de la Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas (UACQB) de la Universidad Autónoma de Guerrero (UAGro) para la búsqueda de proteínas de expresión diferencial de en biopsias de tejido cervical con CaCU (no tipificadas) se mostraron mediante análisis proteómico 15 proteínas con expresión diferencial involucradas en el metabolismo celular, ciclo celular y trafico vesicular, dentro de las cuales las proteínas S100A9, S100A8 y FABP4 se encontraron sobre expresadas. Las proteínas identificadas fueron analizadas por MALDI- TOF MS y posteriormente analizadas in silico para evaluar su papel probable en el proceso tumoral. 495

12 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, 2016 Cadherinas y su relación con el CaCU. Las Cadherinas son proteínas de adhesión celular dependientes de calcio, preferentemente interactúan con ellas mismos de una manera homofílica en la conexión de las células, esta familia de adhesión está formada de más de 100 miembros que se dividen en seis subgrupos, las de tipo 1 y 2, desmocolinas, desmogléinas y cadherinas flamingo. En las primeras se han realizado estudios que arrojan que este grupo está formado por la Cadherinas-E (epitelial), la P (placenta) y la N (neural) que se nombraron dependiendo del tejido donde se localizaron. (Córdova, 2008) Una característica principal de las Cadherinas es su capacidad de unirse con otras Cadherinas de su misma familia para formar cadenas que unirán las células. La adhesión entre las células y la matriz extracelular son fundamentales para mantener la organización estructural y funcional de los tejidos (Córdova, 2008). Las Cadherinas son un grupo de proteínas que participan en la adhesión celular. Su estudio en células y tejidos ha desencadenado su relación directa con el proceso metastático de los tumores, la metástasis inicia con la degradación de la interacción local célula-célula, alterando la membrana basal, invadiendo e infiltrando tejido circunvecino, alcanzando y penetrando al interior de los vasos sanguíneos o linfáticos (intravasación), provocando la transportación de células neoplásicas por el torrente sanguíneo. Las células se adhieren entre si y a la matriz extracelular a través de proteínas llamadas moléculas de adhesión celular (CAM). Las CAM pueden ser moléculas de adhesión célula-célula o moléculas de adhesión matriz extracelular-célula. Un tipo de molécula que participa en la unión entre células son las Cadherinas siendo las principales moléculas que forman parte de las CAM responsables de la adhesión célula-célula. Las Cadherinas tienen un dominio extracelular largo, que las une de manera homofílica a otras Cadherinas, las cadenas formadas por las Cadherinas están mediadas por Ca2+ en tejidos de vertebrados. Estas moléculas de adhesión intervienen en el reconocimiento celular, la morfogénesis del tejido y la supresión de tumores Los cambios en la expresión de las cadherinas juegan un papel crítico durante la progresión del tumor. La pérdida de expresión o función de la Cadherina E en carcinomas epiteliales ha sido considerada como la razón principal para la ruptura del contacto estrecho célula-célula del tejido epitelial, conduciendo a la progresión de 496

13 Memorias del 3 er Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero de Septiembre 2016 tumores a un estado invasivo metastático. Estas moléculas juegan un papel importante en la tumorigénesis epitelial. (Sánchez- Sánchez, 2005) En el 2015 en un estudio realizado en el laboratorio de Biomedicina Molecular de la Facultad de Ciencias Químico Biológicas de la UAGro, por Ortiz Ortiz y colaboradores en la población guerrerense, se encontró la presencia de 27 variantes de E6 del VPH16. Dentro de las cuales la más común fue la E-G350 (40%) seguida por la E- prototipo (13.03%), E-C188/G350 (11.82%), AA-a (10.61%), AA-c (6.07%) y E-A176/G350 (5.15%), siendo la variante AA-a, E-A176/G350 y AA-c las que mostraron mayor riesgo de conducir al desarrollo de CaCU. (Ortiz-Ortiz, 2015) Por último los resultados recientemente publicados por Zacapala-Gomez y colaboradores en el 2015 en este mismo laboratorio, demostraron que las variantes AA-a, AA-c y las EUR (E-G350, E-A176/G350, E-C 188/G350) previamente reportadas, alteran la expresión de un total de 436 genes en células C-33A transfectantes estables con las variantes de E6, de los cuales fueron validados un grupo de genes involucrados en adhesión celular (AMOTL1, CDH2, CDH6, CDH9, COL11A1, NID1, NRCAM y CALCR). La expresión alterada de dichos genes sugiere que los cambios presentes en la secuencia del gen E6 del VPH16 son suficientes para alterar el perfil global de la expresión génica en una línea celular tumoral. (Zacapala-Gómez, 2015) Como parte del 3er Verano de Investigación Científica Asómate a la ciencia este verano, se realizó una estancia de investigación en el Laboratorio de Biomedicina Molecular de la UACQB de la UAGro., en la cual se analizó la expresión de CDH2 una biopsia de CaCU positiva a la variante AA-c de E6 del VPH16. Dicha estancia de investigación se llevó a cabo en el período comprendido del 27 de Junio al 05 de Agosto del 2016, bajo la tutoría de la Dra. Olga Lilia Garibay Cerdenares. Planteamiento del problema Existirá expresión de CDH2 en la biopsia de CaCU positiva a la variante AA- c de E6 del VPH16? Hipótesis Se encontrará expresión de CDH2 en la biopsia de CaCU positiva a la variante AA-c de E6 del VPH

14 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, 2016 Objetivos Objetivo General: Detectar la expresión de CDH2 en la biopsia de CaCU positiva a la variante AA-c de E6 del VPH16, proveniente del Biobanco del Laboratorio de Biomedicina Molecular de la Facultad de Ciencias Químico Biológicas. Objetivo Específico: Detectar por Western Blot la expresión de CDH2 en la biopsia de CaCU positiva a la variante AA-c de E6 del VPH16 proveniente del Biobanco del Laboratorio de Biomedicina Molecular. Metodología Procesamiento de las Muestras Extracción de Proteínas. La biopsia de tejido cervical criopreservada en All protect se lavó 3 veces con PBS 1X estéril. Se eliminó el PBS y se agregó 1 ml de amortiguador de lisis (Tris-HCl 5 mm, EDTA 2 mm y Nonidet P-40 al 1%) con inhibidores (10 µg/ml de TLCK, 1A, NEM, Na3VO4 y 5 µg/ml de E64) µg/ml de RIPA. La biopsia se maceró sobre un mortero y el lisado obtenido se centrifugó a 13,200 rpm durante 10 min a 4 C y se agitó en vórtex durante 3 min 3X. Se colectó el sobrenadante y se etiquetó como extracto total (ET). Para la precipitación de proteínas se usó el Kit de Calbiochem (Proteo Extract Protein Precipitation Kit No. de Cat ) y luego la muestra se calentó durante 5 min en agua hirviendo. Cuantificación de proteínas Las muestra se cuantificó utilizando el Kit Dc Protein assay (BIORAD, No. de Cat ) para la cuantificación de proteínas mediante DC Bradford (BIORAD, No. de Cat ). Se hicieron alícuotas de 2 µl de la muestra, 18 µl de agua destilada y 180 µl del reactivo de Bradford (por duplicado). Las concentraciones de proteína se estimaron por absorbancia a 595 nm (Bradford) comparando con una curva estándar obtenida a partir de una serie de diluciones de Albúmina Sérica Bovina (BSA). Terminada la estandarización de la curva de BSA se continuó con la cuantificación de proteína de las biopsias (ambos se leyeron en el Nanodrop 2000c Spectrophotometer, Thermo Scientific). Las curvas estándar de concentración obtenidas se 498

15 Memorias del 3 er Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero de Septiembre 2016 compararon con la curva de la proteína de referencia BSA (BIORAD, No. de Cat ), leída a un espectro visible de longitud de onda de 595 nm con el NanoDrop 2000c Spectrophotometer (Thermo Scientific), con un valor de R: Electroforesis unidimensional Las muestras se sometieron a SDS-PAGE 1D a concentraciones de 10% para proteínas de peso molecular que van desde 150 a 25 kda. El corrimiento inició aplicando 80 V durante 20 min aumentando el voltaje a 120 V durante 1 h aproximadamente. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie, el cual incrementa la sensibilidad para la detección de proteínas y la resolución en el patrón de bandas mayores a 75 kda y menores de 25 kda. Western Blot Se realizó un Western Blot a partir de extractos de proteína total (1 mg), que se transfirieron a una membrana de nitrocelusa, bloqueada con leche descremada en TBS-T 5% durante 1 h a TA y se lavaron 10X con TBS-T 1X. La membrana se incubó con 1:2000 de anticuerpo primario anti- CDH2 durante toda la noche la noche a 4 C. La membrana se lavó 10X con TBS-T (10 min c/u), en seguida se incubó con el anticuerpo secundario anti-ratón IgG1 conjugado a HRP, (PIERCE, Cat. No ) y diluido en TBS-T leche al 2.5 % por 2 h. Luego, se aplicaron 5 lavados con TBS-T (10 min c/u) y después la señal fue revelada por quimioluminiscencia en el C-DiGit. Resultados Características generales de las muestras. Se tiene el registro de la biopsia de CaCU positiva a la variante AA-c, obtenida de una paciente guerrerense clínicamente diagnosticada con CaCU, proveniente del IECan de Acapulco, Gro., y que se encuentra en el Biobanco del Laboratorio de Biomedicina Molecular la FCQB-UAGro y que cuenta con datos de los expedientes y características clínicas, almacenadas en el programa STATA 11.1 para su posterior análisis estadístico. En el siguiente cuadro se muestran las características generales de la biopsia con folio CC

16 Cuadro 3. Características generales de la biopsia CC231. Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, 2016 Muestra No. Folio Genotipo viral Variante de E6 del VPH16 Estadio clínico de acuerdo a FIGO 1 CC AA-c IB Cuantificación de proteínas. Para determinar la concentración de proteína presente en la biopsia de CaCU positiva a la variante AA-c se realizó una curva estándar obtenida a partir de una dilución de albúmina sérica bovina (BSA), para lo cual se pesaron 0.01 g de BSA y se disolvieron en 10 ml de agua destilada, después se realizó lo siguiente Cuadro 4. Cuantificación de proteínas. H2O destilada BSA 0.01g Reactivo de Bradford Blanco Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 20 µl 18 µl 16 µl 14 µl 12 µl 10 µl 0 2 µl 4 µl 6 µl 8 µl 10 µl 180 µl 180 µl 180 µl 180 µl 180 µl 180 µl Los tubos se leyeron en el espectro visible a una longitud de onda de 595 nm en el NanoDrop 2000c Spectrophotometer (Thermo Scientific) y se obtuvo la siguiente curva con un valor de R=

17 Memorias del 3 er Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero de Septiembre 2016 Gráfica 1. Curva estándar de concentración de BSA por el método de Bradford. µl/ml R= µl/ml Avg. Abs. Lineal (µl/ml) 2 0 Standard1 Standard2 Standard3 Standard4 Standard5 Como parte fundamental para detectar la presencia de proteínas asociadas a adhesión celular en la biopsia de CaCU positiva a la variante AA-c, es importante evaluar la calidad del material biológico de las biopsias criopreservadas en All protect (Qiagen, No de Cat ), para lo cual se realizó la extracción de proteínas a través del RIPA+ inhibidores y la cuantificación de proteína mediante el método de Bradford (BIORAD, No. de Cat ). La concentración de proteína se estimó por absorbancia a 595 nm (Bradford) y se comparó con la curva de la proteína de referencia BSA (BIORAD, No. de Cat ), leída a un espectro visible de longitud de onda de 595 nm con el NanoDrop 2000c Spectrophotometer (Thermo Scientific), con un valor de R: Cuadro 5. Concentración de proteína de la biopsia con folio CC196 por el método Bradford. Folio Variante de E6 del Concentración VPH16 (µg/µl) CC-231 AA-c

18 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, 2016 Electroforesis unidimensional Como parte de la estandarización para la extracción de proteínas, se procesaron tres tejidos obtenidos de una rata macho de la cepa Wistar (cerebelo, músculo y páncreas), los cuales fueron proporcionados por la Dra. Mónica Espinoza Rojo profesor/investigador del Laboratorio DE Biología Molecular y Genómica; y procesados a través de dos métodos: RIPA + inhibidores y RIPA/Thio-urea+ inhibidores con el propósito de mejorar la obtención de proteína. Los extractos obtenidos se analizaron en una electroforesis 1D y los resultados fueron los siguientes: MPM kda µg DE PROTEÍNA Figura 5. SDS-PAGE 1D al 10% con concentraciones de 10 a 70 µg de proteína. En la figura se muestra una curva de concentración en un gel SDS-PAGE al 10% con concentraciones de 10 a 70 µg de proteína obtenida de músculo de rata con RIPA + inhibidores, teñido con Azul de 502

19 Memorias del 3 er Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero de Septiembre 2016 Coomassie. Se observan zonas con proteínas abundantes indicas en corchetes y alta resolución de proteínas de bajo peso molecular a una concentraciones de 50 a 70 µg. MPM kda µg DE PROTEÍNA Figura 6. SDS-PAGE 1D al 10% con concentraciones de 10 a 70 µg de proteína. En la figura se muestra una curva de concentración en un gel SDS-PAGE al 10% con concentraciones de 10 a 70 µg de proteína obtenida de músculo de rata con RIPA/Thio-urea + inhibidores, teñido con Azul de Coomassie. Se observa alta resolución de proteínas de alto peso molecular pero la intensidad en el patrón de bandas es baja. Se indican varias zonas con proteínas abundantes. 503

20 Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, 2016 CC KDa 97 KDa Figura 7. Detección de CDH2 por quimioluminiscencia. Se realizó un Wester blot para detectar la presencia de CDH2 en la biopsia CC-231 positiva a la variante AA-c del VPH16. La señal fue revelada por quimioluminiscencia en el C-DGit a sensibilidad alta. Se observan dos bandas correspondientes a la isoforma 1 (99.8 kda) y a la isoforma 2 (97 KDa) de CDH2. Conclusiones Se estandarizaron dos métodos para la extracción de proteínas: RIPA+inhibidores de proteasas y RIPA/Thio + inhibidores de proteasas, de los cuales el primero mostró alta resolución en la separación de proteínas de bajo peso molecular (~100 kda). Se detectó por WB la presencia de las dos isoformas de CDH2 en la biopsia CC231 positiva a la variante AA-c de E6 del VPH

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