SECCIÓN PARASITOLOGÍA INSTRUCTIVO PARA LA TOMA Y ENVIO DE MUESTRAS. INFECCIÓN POR Plasmodium sp. (Malaria)

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Francisco Cuenca Martín
hace 8 años
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1 INTRODUCCION SECCIÓN PARASITOLOGÍA INSTRUCTIVO PARA LA TOMA Y ENVIO DE MUESTRAS INFECCIÓN POR Plasmodium sp. (Malaria) La Malaria es una enfermedad parasitaria causada por diferentes especies de Plasmodium y es transmitida por un vector (mosquito) del género Anopheles. El período de incubación de la enfermedad es de 10 a 28 días, según la especie de Plasmodium y los síntomas se presentan bruscamente con escalofríos intensos, fiebre y sudoración. Chile no es un país endémico para Malaria, sin embargo cuenta con el vector que transmite la enfermedad. Por lo tanto los mecanismos de vigilancia deben estar atentos a la reaparición de nuevos casos, ya sea por la introducción debido a viajeros, residentes en países endémicos o por la reactivación de la transmisión en áreas donde el vector se encuentre presente. Un diagnóstico certero y oportuno mediante antecedentes clínicos-epidemiológicos y eámenes de laboratorio es fundamental para la elección del un tratamiento eficaz y una buena evolución de la enfermedad. Frente a la sospecha clínica de Malaria, se debe enviar las muestras al Instituto de Salud Pública (ISP) para su confirmación mediante técnicas específicas de laboratorio. Tanto el diagnóstico de laboratorio como el seguimiento en el tratamiento se basan en la confirmación de la presencia del parásito en sangre, el diagnóstico de especie, estadios presentes y su carga parasitaria. La Sección Parasitología del ISP basa el diagnóstico y la confirmación del caso en el uso de un algoritmo que incluye: técnicas inmunocromatográficas, moleculares como Reacción de la Polimerasa en Cadena (PCR) y la observación microscópica en gota gruesa y frotis. La observación microscópica en la gota gruesa es el método Gold Estándar en el diagnóstico de laboratorio, donde utilizando la tinción de Giemsa un microscopista entrenado puede diferenciar las diferentes especies de Plasmodium, sus estadios y su carga parasitaria. El uso del frotis se considera un apoyo a lo observado en gota gruesa Los métodos inmunocromatográficos por su parte poseen una alta especificidad y rapidez en su ejecución, con un promedio de 15 minutos y son capases de diferencias algunas especies de Plasmodium. El uso complementario de la técnica de PCR permite detectar secuencias específicas de las principales especies del parásito y es útil para la detección de Malarias mitas y bajas parasitemias. Estas últimas dos metodologías son recomendadas para países no endémicos como Chile. El éito de un buen diagnóstico se encuentra establecido principalmente en la calidad y condiciones de la muestra enviada. Por este motivo, el presente instructivo tiene el objetivo de indicar la correcta manera de la toma de muestra, confección de los frotis y gota gruesa, y del envío y transporte de la muestra al Instituto de Salud Pública de Chile. 1

El período de incubación de la enfermedad es de 10 a 28 días, según la especie de Plasmodium y los síntomas se presentan bruscamente con escalofríos intensos, fiebre y sudoración.

2 DEFINICIONES Gota gruesa: Es una técnica de rutina y consiste en una muestra de una gota de sangre conformada por numerosas capas en su mayoría de glóbulos rojos, los que son deshemoglobinizados durante la coloración con Giemsa. Esta concentración de glóbulos rojos facilita la detección de los parásitos que pudieran estar presentes en su interior en densidades bajas. Frotis o Etendido sanguíneo: Es una capa delgada, única de células sanguíneas, fijadas con metanol y coloreadas con Giemsa, que facilitan la observación de las características morfológicas de los parásitos presentes en los glóbulos rojos. REQUISITOS DE TIPO Y CANTIDAD DE MUESTRA Para la confirmación de Malaria mediante observación microscópica, inmunocromatografía y PCR se solicita el envío de: 2 portaobjetos con un frotis de sangre desde punción capilar cada uno. 2 portaobjetos con una gota gruesa de sangre desde punción capilar. 2 portaobjetos con un frotis + una gota gruesa en sangre desde punción capilar cada uno. 1 tubo de sangre venosa en EDTA como anticoagulante (entre 2 y 5 ml) para las técnica inmunocromatográficas y PCR. Se requiere el envío de todas las muestras solicitadas. La ausencia o mala calidad de las muestras enviadas es causal de rechazo inmediato y solicitud de nueva muestra. TOMA Y PREPARACION DE LA MUESTRA Para el proceso de toma de muestra se deben seguir las medidas correspondientes a un nivel de bioseguridad clase II de acuerdo al Manual de Bioseguridad y buenas prácticas del establecimiento. Las muestras deben ser obtenidas de preferencia antes de que el paciente haya recibido tratamiento antimalárico y para un mayor rendimiento se recomienda que la muestra sea tomada durante un pick febril > a 37.5 C, ya que corresponde a los momentos de mayor parasitemia. El periodo de toma de muestra frente a un caso sospechoso es de 2 a 3 días con intervalos de 8 a 12 entre muestras. En el caso que el tratamiento haya sido iniciado al momento de la toma de muestra, debe destacarse en el formulario de envío de muestra. La etracción de la muestra de sangre con EDTA como anticoagulante se debe realizar de acuerdo a los procedimientos técnicos propios de cada laboratorio e identificar el tubo con los datos del paciente. 2

Frotis o Etendido sanguíneo: Es una capa delgada, única de células sanguíneas, fijadas con metanol y coloreadas con Giemsa, que facilitan la observación de las características morfológicas de los

3 Punción capilar Para la preparación de los frotis y gotas gruesas se recomienda sangre directamente desde punción capilar y no desde sangre con anticoagulante. El detalle del proceso se presenta a continuación: 1. Limpiar el lugar de trabajo con alcohol 70%. 2. Limpiar 6 portaobjetos de preferencia con borde esmerilado con ayuda de algodón y alcohol 70%. Secar los portaobjetos con un paño limpio evitando la presencia de pelusas. 3. Desinfectar con alcohol 70% la zona para la obtención de la muestra y dejar secar. De preferencia utilizar el dedo anual de la mano menos hábil. Se puede puncionar lóbulo de la oreja o talón en caso de recién nacido o lactante. 4. Puncionar con lanceta estéril la zona lateral (menos sensible) del pulpejo del dedo y presionar para la salida de sangre. Eliminar la primera gota obtenida con gasa estéril. Preparación del frotis Desde el dedo puncionado, presionar y colocar suavemente una gota pequeña de sangre, no más grande que la cabeza de un palo de fósforos (7-8 ul), justo en el centro del portaobjetos. Etender la gota con ayuda de otro portaobjeto o cubreobjeto en un ángulo de 45º desde el centro al borde eterno de la lámina de manera que quede un etendido fino; de un tamaño no mayor a 3 cm y con una clara distinción entre cabeza, cuerpo y cola (Ver figura 1). Figura 1 El nombre del paciente debe se colocado con lápiz de mina en el etremo superior del frotis 3

Secar los portaobjetos con un paño limpio evitando la presencia de pelusas. 3. Desinfectar con alcohol 70% la zona para la obtención de la muestra y dejar secar.

4 Preparación de la gota gruesa Desde el dedo puncionado, presionar y colocar suavemente una gota pequeña de sangre, no más grande que la cabeza de un palo de fósforos (7-8 ul), a 2,5 cm del borde de la lámina que posee el esmerilado. Realizar movimientos circulares desde adentro hacia fuera y viceversa con el ángulo de otro portaobjeto hasta generar un círculo uniforme de 1 cm de diámetro (ver figura 2). Figura 2 Preparación de frotis + gota gruesa Desde el dedo puncionado, presionar y colocar suavemente 2 gotas pequeñas de sangre tal cual se preparara un frotis y una gota gruesa en un mismo portaobjetos con borde esmerilado. (Ver figura 3). Figura 3 Rotulado, secado y fijación de los frotis y gota gruesa Rotular con lápiz grafito en la zona esmerilada con el nombre del paciente y la fecha de obtención de la muestra. Dejar secar el frotis en posición horizontal durante 30 minutos protegida de los polvo, de la luz solar directa y del calor etremo. insectos, del Fijar solo los frotis sumergiéndolos en metanol por 3 segundos. Para el caso de la lámina que posee gota gruesa y frotis al mismo tiempo, sumergir solo la zona del frotis en metanol por 3 segundo procurando no fijar la zona que posee la gota gruesa. Las gotas gruesas no se fijan ya que impiden la deshemoglobinización de los glóbulos rojos durante la tinción. NOTA En el caso de los portaobjetos sin borde esmerilado escribir sobre el borde del frotis o etiquetar. 4

Realizar movimientos circulares desde adentro hacia fuera y viceversa con el ángulo de otro portaobjeto hasta generar un círculo uniforme de 1 cm de diámetro (ver figura 2).

5 ENVÍO DE LAS MUESTRAS Las muestras no deben sobrepasar las 48 horas desde su obtención hasta el envío al ISP. Las muestras deben ser enviadas en un recipiente apropiado para su transporte al laboratorio con la finalidad de evitar cualquier derrame o rotura. Enviar las láminas de gota gruesa y frotis protegidas del polvo y a T ambiente. La muestra de sangre en EDTA debe ser transportada en cadena de frío a 4 º C. Las muestras deben ser enviadas junto al formulario disponible en la página Web institucional a la dirección Av. Marathon #1000, Ñuñoa, Santiago. El horario de recepción de las muestras es continuado pero lo recomendado para que sea entregado en el mismo día al laboratorio es de lunes a viernes de 8:30 a 15:00 hrs. INFORMACIÓN Y CONSULTAS Para consultas comunicarse al teléfono , Red MINSAL o por correo electrónico a parasito@ispch.cl. IMPORTANTE Imprima la hoja N 4 ya que sirve como plantilla pa ra la realización de la gota gruesa y la forma combinada. 5

Enviar las láminas de gota gruesa y frotis protegidas del polvo y a T ambiente. La muestra de sangre en EDTA debe ser transportada en cadena de frío a 4 º C.

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