VERSION OFICIAL FECHA: 12/3/2009 INVESTIGADOR RESPONSABLE: SMITH FERRER PATRICIO CRISTIAN

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1 5 GONIGYT CYMIIUN NACIONAL YE INYEK.LN CETIFICA Y TECNOLÓGICA ru GOBIL RNO DE CH ILE COMISION NACIONAL DE INVESI I(ALi()N CIENLL 1 L NOLOjli VERSION OFICIAL FECHA: 12/3/2009 PROYECTO REGULAR N INVESTIGADOR RESPONSABLE: SMITH FERRER PATRICIO CRISTIAN FONDO NACIONAL DE DESARROLLO CIENTIFICO Y TECNOLOGJCO (FONDECYT) Bernarda Morin 551, Providencia - casilla 297- y, Santiago 21 Telefono: FAX informes.fondecyt@conicyt.cl

2 INFORME FINAL PROYECTO FONDECYT RECULAR N PROYECTO: DURACIÓN: 3 años AÑO ETAPA: 2008 TÍTUIOPROYECTO: MECANISMOS REGULADORES DE LA REMODELACION TISUI,AR EN LA ENFERMI-DAD PERIODONTAL HUMANA. DISCIPLINA PRINCIPAL: 01 ODONTOLOGIA, ESTOMATOI.00IA Y CIRIJOIA GRUPO DE ESTUDIO: MEDICINA G] INVESTIGAI)OR(A) RESPONSARLE: SMITH FERRER PATRICIO CRTSTIAN DIRECCIÓN: Marcoleta 391. COMUNA: Santiago CIUDAD: Santiago REGIÓN: METROPOLITANA FONO: EMAIE : psmith@med.puc.cl INFORME OBJETIVOS Cumplimiento de los Objetivos planteados en el Proyecto. Recuerde que los objetivos del proyecto no se refieren a listar actividades desarrolladas sino a los objetivos desarrollados N F OBJETWOS CUMPLIMIENTO 1 FUNDAMENTO

3 Caracterizar el patrón de expresión de MMP-14 TOTAL Se evaluó la expresión de MMP-14 (MTI-MMP) (MTI-MMP) y TIMP-2 en tejidos gingivales y de TIMP-2 en biopsias de tejido gingival sano sanos y afectados por Enfermedad Periodontal (n= 10) y afectado por EP (n--l2). la expresión de (EP). estas proteínas fue determinada mediante Western-blot de homogeneizados del tejido gingival. A su vez, la razón entre MMP-14 y su inhibidor TIMP-2, indicador que puede mostrar el equilibrio entre proteasas e inhibidores en el tejido fue comparado entre individuos sanos y afectados por EP. La distribución de la producción de MMP-14 y TIMP-2 fue analizada además mediante inmunohistoquimica en biopsias de tejido gingival. Se pudo observar la producción (le MMP-14 en inacrófagos y fibrohiastos del leudo gingival. Por otra parte, la producción de T!MP-2 fue observada en macrófagos, fibroblastos. células endoteliales y epiteliales de la encía. Se está redactando una publicación :i partir de estos resultados. Estos resultados ha sido resumidos en el documento anexo a este informe e identificado como: Documentos Anexos Objetivo 1. 2 Evaluar el papel de la adhesión a colágeno tipo [VIAl Se determinó que tanto EGF como TNF-alfa son y de factores solubles como EGF y TNF-a en la potentes estímulos para la producción de expresión de MMP-I4ITIMP-2 en fibroblastos MMP-14 (MTI-MMP) en fibroblastos gingivales gingivales de origen humano. y que este efecto es potenciado por el cultivo de las células sobre una matriz de colágeno tipo 1. Estos resultados se muestran en las Figuras 1 y 2 del artículo anexo a este informe: Smith PC, Guerrero J, Tobar N, Cáceres M. González MJ, Martínez J. Tumor necrosis factor-alpha-stiniulated membrane type 1 matnx metal loproteinase production is moduiated by epidermal growth factor receptor signaling in human gingival fibroblasts. Journal of Periodontal Research2009;44:73-80.

4 3 Evaluar la capacidad de los factores solubles en TOTAL El estimulo de ambos factores (EGF y 1 NF-alfa) estudio (EGF y TNF-alfa) para inducir la indujo una fuerte expresión de la enzima degradación de colágeno tipo en íibroblastos colageiiolitica MMP-14 (MTI-MMP), lo que gingivales humanos, sugiere un efecto sobre la degradación de colágeno fibrilar (ver figura 1 y 2 de publicación anexa). Con el propósito de interferir en la capacidad TNF-alfa para inducir la actividad colagenolitica en estas células, se utilizó el inhibidor de EGFR (tirfostina; AG1478). Los ensayos realizados con la mencionada droga no lograron un resultado positivo. Pensamos que el poco tiempo de vida media del fármaco, sumado a lo prolongado de estos experimentos, puede haber jugado en contra de la visualización de este efecto. 4 Determinar si el bloqueo de EGFR puede alterar TOTAl. El bloqueo de EGFR, utilizando el inhibidor de la la expresión de MMP-14 (MTI-MMP) y TIMP-2 fosforilaeión de este receptor tirfostina- mostró en cxplantes de tejido gingival, que la producción de MMP-14 (M'l'l-MMP) es altamente dependiente de la actividad de FGFR. Este resultado se detalla en la figura 2 y 3 de la publicación del proyecto. Smith PC, Guerrero J, Tobar N, Cáceres M, González MJ, Martínez J. Tumor necrosis factor-alpha-stimulated ni embrane type 1 matrix metal loproteinase production is modulated by epidermal growth factor receptor signaling in human gingival fibrohlasts. Journal of Periodontal Researeh 2009; 44: (Anexo a este informe). 5 Identificar la activación de EGFR y la expresión TOTAL.. Este objetivo fue evaluado de mejor manera en de sus ligandos en tejido gingival sano y afectado cultivos primarios de fibroblastos gingivales. En por Enfermedad Periodontal. estas células, el estimulo con la ciloqulila TNF-alfa indujo la expresión del mrna para los ligandos de EGFR (HB-EGF y TGF-alfa). Ver figura 4 de La publicación del proyecto. Smith PC, Guerrero J, Tobar N. Cáceres M, González MJ, Martínez J. Tunior necrosis factor-alpta-stimulated membrane type 1 matrix metal loproteinase production is modulated by epidermal growth factor receptor signaling in human gingival fibroblasts. Journal of Periodontal Rescarch 2009; 44: (Anexo a este informe). Otro(s) aspecto(s) que Ud. considere importante(s) en la evaluación del cumplimiento de objetivos planteados en la propuesta original o en las modificaciones autorizadas por los Consejos.

5 RESULTADOS OBTENIDOS: Para cada uno de los objetivos específicos, describa o resuma los resultados. Relacione las publicaciones y /o manuscritos enviados a publicación con los objetivos específicos. En la sección Anexos incluya información adicional que considere pertinente para efectos de la evaluación. La extensión máxima de esta sección es de 5 páginas (letra tamaño 10, Anal o Verda na). Objetivos 1. Caracterizar el patrón de expresión de MMP-14 (MTI-MMP) y TIMP-2 en tejidos gingivales sanos y afectados por Enfermedad Periodontal (EP). Se evaluó la expresión de MMP-14 (MT1-MMP) y de TIMP-2 en biopsias de tejido gingival sano (n=10) y afectado por EP (n=12). La expresión de estas proteínas fue determinada mediante Western-blot de homogeneizados del tejido gingival. A su vez, a razón entre MMP-14 y su inhibidor TIMP-2, indicador que puede mostrar el equilibrio entre proteasas e inhibidores en el tejido fue comparado entre individuos sanos y afectados por EP. La distribución de la producción de MMP-14 y TIMP-2 fue analizada además mediante inmunohistoquímica en biopsias de tejido gingival. Se pudo observar la producción de MMP-14 en macrófagos y fibroblastos del tejido gingival. Por otra parte, la producción de TIMP-2 fue observada en macrófagos, fibroblastos, células endoteliales y epiteliales de la encía. Se está redactando una publicación a partir de estos resultados. Estos resultados ha sido resumidos en el documento anexo a este informe e identificado como: Documentos Anexos Objetivo Evaluar el papel de la adhesión a colágeno tipo 1 y de factores solubles como EGF y TNF-alfa en a expresión de MMP-14/TIMP-2 en fibroblastos gingivales de origen humano. Se determinó que tanto EGF como TNF-alfa son potentes estímulos para la producción de MMP- 14 (MT1-MMP) en fibroblastos gingivales y que este efecto es potenciado por el cultivo de las células sobre una matriz de colágeno tipo I. Estos resultados se muestran en las figuras 1 y 2 M artículo anexo a este informe: Smith PÇ Guerrero J, Tobar /V, Cáceres M, González MJ, Martínez 3. Tumor necrosis factor-a/pha-stimulated membrane type 1 matrix metalloproteinase production is modu/ated by epidermal growth factor receptor signaling in human gingival fibroblasts. Journal of Periodontal Research 2009; 44: Evaluar la capacidad de los factores solubles en estudio (EGF y TNF-alfa) para inducir la degradación de colágeno tipo 1 en fibroblastos gingivales humanos.

6 PV ReaiBreaJc El estímulo de ambos factores (EGF y TNF-alfa) indujo una fuerte expresión de la enzima colagenolítica MMP-14 (MT1-MMP), lo que sugiere un efecto sobre la degradación de colágeno fibrilar (ver figura 1 y 2 de publicación anexa). Con el propósito de interferir en la capacidad TNF-alfa para inducir la actividad colagenolftica en estas células, se utilizó el inhibidor de EGFR (tirfostina; AG1478). Los ensayos realizados con la mencionada droga no lograron un resultado positivo. Pensamos que el poco tiempo de vida media del fármaco, sumado a lo prolongado de estos experimentos, puede haber perjudicado la comprobación del efecto proteolftico en estudio. 4. Determinar si el bloqueo de EGFR puede alterar la expresión de MMP-14 (MT1-MMP) y TIMP- 2 en explantes de tejido gingival. El bloqueo de EGFR, utilizando el inhibidor de la fosforilación de este receptor tirfostinamostró que la producción de MMP-14 (MT1-MMP) es altamente dependiente de la actividad de EGFR. Este resultado se detalla en la figura 2 y 3 de la publicación del proyecto. Smith PC, Guerrero J, Tobar N, Cáceres M, González Mi, Martínez J. Tumor necrosis factor-alphastimulated membrane type 1 matrix metalloproteinase procluction is modu/ated by epidermal gro wth factor receptor signaling in human gingival fibroblasts. Journal of Periodontal Research 2009; 44: (Anexo a este informe). S. Identificar la activación de EGFR y la expresión de sus ligandos en tejido gingival sano y afectado por Enfermedad Periodontal. Este objetivo fue evaluado de mejor manera en cultivos primarios de fibroblastos gingivales. En estas células, el estímulo con la citoquina TNF-alfa indujo la expresión del mrna para los ligandos de EGFR (HB-EGF y TGF-alfa). Ver figura 4 de la publicación del proyecto. Smith PC; Guerrero 3, Tobar N, Cáceres M, González Mi, Martínez 3. Tumor necrosis factor-alpha- 5timulated membrane type 1 matrix metal/oproteinase production is modulated by epidermal gro wth factor receptor signaling in human gingival fibrob/asts. Journal of Periodontal Research 2009; 44: (Anexo a este informe). A CONTINUACIÓN SE RESUMEN GLOBALMENTE LOS RESULTADOS DEL PRESENTE PROYECTO. Uno de los objetivos centrales del presente proyecto era identificar si es que la producción de MT1-MMP, proteasa de potente actividad colagenolítica en el tejido gingival, era regulada por el Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR). Este es un hecho relevante ya que ratones deficientes en dicho receptor manifiestan serias alteraciones en la expresión de diferentes MMPs en tejido pulmonar. En el presente estudio pudimos determinar que el

7 estímulo de fibroblastos gingivales con TNF-L, citoquina pro-inflamatoria de abundante expresión en Ja Enfermedad Periodontal, era capaz de inducir Ja producción de MT1-MMP a través de un mecanismo que involucra la activación del receptor de EGF (EGFR) y la producción de ligandos del mismo receptor como HB-EGF y TGF-ct. Esto permite nos proponer que EGFR podría jugar un papel crucial en el control de la remodelación de tejidos periodontales sometidos al estímulo pro-inflamatorio de TNF-u como ocurre en la enfermedad periodontal (EP). Por otra parte, la producción de la proteasa MT1-MMP resultó ser inhibida por el inhibidor farmacológico de EGFR (Tirfostina), resultado que abre las puertas para la caracterización de un blanco terapéutico interesante en el control de la remodelación de tejidos en la Enfermedad Periodontal. Estos resultados han sido publicados en el siguiente artículo que se encuentra adjunto al presente proyecto (Smith PC, Guerrero J, Tobar N, Cáceres M, González MI, Martínez J. Tumor necrosis factor-alpha-stimulated membrane type 1 matrix metaioproteinase production is modulated by epidermal growth factor receptor signa/ing in human gingival fibroblasts. Journal of Periodontal Research 2009; 44: ) Una segunda pregunta relevante fue la caracterización de la producción de MT1-MMP y TIMP-2 en tejidos periodontales sanos y afectados por EP. Para esto se analizó, mediante Western-blot, la expresión de esta proteasa y su inhibidor en homogeneizados de tejido gingival. Por otra parte, mediante inmunohistoquímica, se caracterizó la distribución de MT1-MMP y TIMP-2 en biopsias de tejido gingival. Nuestros resultados muestran que MT1-MMP y TIMP-2 se expresan de manera aumentada en la EP y que el balance entre proteasa e inhibidor también se encuentran alterados en la enfermedad, lo que permite proponer que este eje proteolítico podría tener un papel significativo en la destrucción de los tejido de soporte del periodonto. Por otra parte, nuestros análisis nos permitieron caracterizar que la producción de MT1-MMP ocurre principalmente en fibroblastos y macrófagos del tejido gingival, mientras que TIMP-2 es expresado por células epiteliales, fíbroblastos, macrofagos y células endoteliales de la encía. Estos resultados han sido descritos en detalle en un documento anexo a este informe (Documento anexo al objetivo 1) y actualmente estamos redactando una publicación en base a estos datos. En forma paralela a estos estudios se desarrollaron 3 trabajos complementarios que fueron financiados completamente por el presente proyecto. Estos se han traducido en 3 publicaciones (1 publicada y 2 en prensa). Estos estudios forman parte de la línea principal de trabajo del Investigador Responsable de este proyecto y han sido anexados a este informe. Cáceres, M.; Hidalgo, R.; Sanz, A.; Martínez, J.; Riera, P.; Smith, PC. Effect of plateletrich plasma on cell adhesión, ceil migration, and myofibroblastic differentiation in human gingival fibroblasts.j Periodontol 2008; 79:

8 Gonzalez, R.; Arancibia, R.; Cáceres, M.; Martínez, 3.; Smith, PC. Cigarette smoke condensate stimulates urokinase production through the generation of reactive oxygen species and activation of the mitogen activated protein kinase pathways in human gingival fibroblasts. 3 Periodontal Res. En prensa. Arancibia, R.; Cáceres, M.; Martínez, J.; Smith, PC. Triclosan inhibits tumor necrosis factor alpha-stimulated urokinase production in human gingival fibroblasts. 3 Periodontal Res. En Prensa.

9 RESUMEN: La enfermedad periodontal (EP) es una patología inflamatoria de origen infeccioso de alta prevalencia en la población chilena y mundial. Esta lesión inflamatoria genera la destrucción de los tejidos de soporte dentarios (periodontales), lo que lleva a finalmente a la pérdida dentaria. El proceso de destrucción tisular puede ser mediado por un grupo de enzimas proteolíticas conocidas como Metaloproteasas de Matriz (MMPs), las cuales son capaces de degradar diferentes moléculas estructurales de la Matriz Extracelular. Dentro de las MMPs, la MT1-MMP es un proteasa que cumple un papel clave en la remodelación del colágeno, proteína fundamental en la mantención estructural y funcional de los tejidos de soporte dentario. En el presente proyecto hemos caracterizado los mecanismos involucrados en la producción de la proteasa MT1-MMP en fibroblastos gingivales sometidos a un estímulo inflamatorio. Nuestros resultados muestran que la inducción en la producción de dicha proteasa por la citoquina Factor de Necrosis Tumoral-alfa (TNF-alfa) es un proceso complejo que involucra la participación de un receptor clave en la fisiología y patología M tejido gingival como es el Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR). Este novedoso mecanismo permite proponer un interesante blanco terapéutico para el control de la producción de enzimas destructoras de tejido como es el caso de la MT1- MMP en la EP. Por otro lado, nuestro estudio se centró en la caracterización de la producción de esta misma proteasa y su inhibidor TIMP-2 en las encías de pacientes sanos y afectados por EP. Nuestro estudio muestra que en la EP existe un incremento en la producción de MT1-MMP y de TIMP-2. Por otra parte, en la EP se genera un desbalance entre la mencionada proteasa y su inhibidor, lo que permite proponer que en la EP existiría una mayor actividad proteolítica derivada de la MT1-MMP. Nuestros resultados muestran que el mencionado eje proteolítico (MT1-MMP / TJMP-2) puede jugar un papel clave en la destrucción de colágeno observado en la enfermedad períodontal. Por otro lado, la producción de esta proteasa puede ser inducida por citoquinas pro-inflamatorias presentes en la enfermedad periodontal como TNF-alfa, e involucra la participación de diferentes vías de señalización celular tales como EGFR.

10 PRODUCTOS ARTÍCULOS Para trabajos en Prensa/ Aceptados/Enviados adjunte copia de carta de aceptación o de recepción. Autor (a)(es/as) Nombre Completo de la Revista Título (Idioma original) Indexación ISSN: Año: Vol.: N : Páginas : Estado de la publicación a la fecha : Publicada Otras Fuentes de financiamiento, si las hay Smith, PC.; Guerrero, J.; Tobar, N. Cáceres, M.; González, MJ.; Martínez. Joumal of Periodontal Research Tumor necrosis factor-alpha-stimu]ated membrane type 1 matrix metal loproteiliase production is modulated by epidermal growth factor receptor signaling in human gingival fibroblasts. 'SI y Envía documento en papel: no Archivo Asociado al articulo : MTI_y_EGFR_en_Fib_Gingivales.pdf Iii 'r 'va j çvi Con CVI CII rl íom)c_ac,rdeirlreo/rrrdc'ç.php nvcsruiad rf4_arrcul s/dcscirrga ')95)7: (2 1 Ne: 2 Autor (a)(es/as) Cáceres, M.; Hidalgo, R.; Sanz, A.; Martínez, J.; Riera, P.; Smith, PC. Nombre Completo de la Revista : Journal of Periodontology Título (Idioma original) : Effecl of Platelet-Rich Plasma on Ccli Adhesion, Ccli Migtion. and Myofibrohlastic Differentiation in Human Gingival Fihroblasts Indexación : ISI ISSN : Año: 2008 Vol. : 79 N : 4 Páginas : Estado de la publicación a la fecha : Publicada Otras Fuentes de financiamiento, si las hay Envía documento en papel: no Archivo Asociado al articulo : Journal_of_Periodontology_2008Cáceres-2.pdf (()(5 44(, N : 3 Autor (a)(es/as) : Gonzalez, R.: Arancibia, R.; Cáceres, M.; Martínez, J.: Smith, PC.

11 Nombre Completo de la Revista : Journal of Periodontal Rcsearch Titulo (Idioma original) : Cigarette smoke condensate stimulates urokinase production through thc gencration of reactive oxygen species and activation of the milogen activated protcln kinase pathways in human gingival fibroblas Indexación : SI ISSN : Año Páginas Estado de la publicación a la fecha : En Prensa Otras Fuentes de financiamiento, si las hay: Envía documento en papel : no Archivo Asociado al articulo: CSC_stimulate_uPA_production.pdf hup:l Vacvt.inIcI ci!iffl imc_acadcmico!mdex.ihp.in& igadorf4..articuiosdcscarga!0)5 <))Ó7. (1(1 44t N : 4 Autor (a)(es/as) : Arancibia, R.; Cáceres, M. Martínez, J.: Smith, PC. Nombre Completo de la Revista : Journal of Periodontal Research Título (Idioma original) : Triclosan inhihits tumor necrosis factor alpha-stimulated urokinase pip Kduction in human gingival fibroblasts. Indexación : SI ISSN : Año: Vol.: N : Páginas Estado de la publicación a la fecha : En Prensa Otras Fuentes de financiamiento, si las hay Envía documento en papel : no Archivo Asociado al articulo : Triclosan_inhibits..JNFa_stimulated_uPA_production.pdf hup..c 0t OTRAS PUBLICACIONES Sin infirmación ingresada. CONGRESOS N : Autor (a)(es/as) : Arancibia, R.; Cáceres, M.; Martínez, J. Smith. PC.

12 Título (Idioma original) : Nombre del Congreso: País: CHILE Ciudad : Talca Fecha Inicio : 16/10/2008 Fecha Término: 18/10/2008 Nombre Publicación Año Vol.: N : Páginas Envía documento en papel: Archivo Asociado : Triclosan y su función antioxidante en el tejido gingival XXI Reunión Anua! de IADR Chile. no Triclosan_Talca.pdf / hop. tlevt conleyl 743 N : 2 Autor (a)(es/as) : Cáceres, M.; Sanz, A.; Martínez, J.: Smith, PC. Título (Idioma original) : Nombre del Congreso: País CHILE Ciudad : Talca Fecha Inicio : 16/ Fecha Término : 18/10/2008 Nombre Publicación Año Vol.: PRP estimula la contracción tisular y la expresión de alfa-sma XXI Reunión Anual de IADR Chile. / Páginas: Envía documento en papel : no Archivo Asociado : PRP_Talca.pdf hilp )(I O Autor (a)(es/as) : Cáceres, M.; Sanz, A.: Martínez, J.: Smith, PC. Título (Idioma original) : Plasma rico en plaquetas estimula la diferenciación miofibroblástica y la contracción de geles de colágeno en fibroblastos gingivales humanos. Nombre del Congreso: XXII Reunión Anual Sociedad de Biología Celular de Chile 7 País: CHILE Ciudad : Pucón Fecha Inicio: 05/10/2008 Fecha Término : 09/10/2008 Nombre Publicación Año Vol.:

13 Páginas: Envía documento en papel : no Archivo Asociado: Resumen_PRP_B iol_cel.pdf iuip: CVaICyi.CiI)iCyic /iiif rrrte_ac:dciiiicoiridc<.p1ip,nesc ieadw1coiiresos/descarga : 1 0 ( N : Autor (a)(es/as) 4 Arancibia, R.; Cáceres, M. Martínez, J.; Smith, PC. Título (Idioma original) Triclosan inhibe la producción de uroquinasa y de especies reactivas de oxigeno en fibroblastos gingivales. / Nombre del Congreso XXII Reunión Anual Sociedad de Biología Celular de Chile País: CHTLE Ciudad : Pucón Fecha Inicio: 05/10/2008 Fecha Término : 09/10/2008 Nombre Publicación Año Vol N : Páginas Envía documento en papel : Archivo Asociado : no Resumen_trilcosan_Biol_cel.pdt' Vil ip:: va] cvl.conicvi clinforme_acadcmlco:indexpi /Invcst :1)11 TESIS/MEMORIAS N : 1 Título de Tesis : Triclosán inhibe la producción de uroquinasa estimulada por TNF-alfa y peróxido de hidrógeno en fibroblastos gingivales humanos. Nombre y Apellidos del(de la) Alumno(a) : Rodrigo Arancibia Reyes Nombre y Apellidos del(de la) Tutor(a) : Patricio Smith Ferrer Título Grado : Pregrado Institución : Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile. País: CHILE Ciudad : Santiago Estado de Tesis : Terminada Fecha Inicio : 10/10/2007 Fecha Término : 16/01/2009 Envía documento en papel : Archivo Asociado : no Tesis _ro.pdf hitp:!.cvaic'i ccnicy I.'Jnlurmeacaderntço/Jnikxphp/Iiiy sligador.j4icsmcm,i ias dcsearga : : r, C.,^ ANEXOS N : Archivo Asociado : Documento_anexo_a_objetivo l_iow_res.pdf

14 hltp evalcyl e»ticyt c/infor!nc acdci c(,irde pipinvcsiigadorf5_anexos/(iescarga.995v9671 O A continuación se detallan los anexos fisicos/papel que no se incluyen en el informe en formato PDF.