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1 Editado por DR. Ming SOUND Tsao, FRCPC DR. Fred R. Hirsch, PhD DR. Yasushi Yatabe, PhD Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en CAncer de PulmOn international Association for the Study of Lung Cancer

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3 Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en CAncer de PulmOn

4 International Association for the Study of Lung Cancer, Aurora, Colorado, EEUU Editores: Dr. Ming Sound Tsao, FRCPC Dr. Fred R. Hirsch, PhD Dr. Yasushi Yatabe, PhD Una publicación de la IASLC publicada por IASLC Press Patricia Vigués, Spanish translation Cubierta original y diseño del libro por Biographics Oficina de Prensa de la IASLC: IASLC, East Colfax Ave., Unit 10, Aurora, Colorado 80011, EEUU Primera publicación por la IASLC Octubre ISBN: Copyright 2013 International Association for the Study of Lung Cancer Reservados todos los derechos Ninguna parte de esta publicación puede ser reproducida, almacenada, introducida o transmitida en cualquier forma o por cualquier medio sin permiso previo y por escrito del titular del copyright. Aunque la información de este libro se cree que es verdadera y exacta a partir de la fecha de publicación, ni la IASLC ni los editores ni la editorial aceptan ninguna responsabilidad legal por cualquier error u omisión que pueda haber. La editorial no ofrece ninguna garantía, expresa o implícita, en cuanto al material contenido en el mismo.

5 Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en CAncer de PulmOn Editado por Dr. Ming Sound Tsao, FRCPC Dr. Fred R. Hirsch, PhD Dr. Yasushi Yatabe, PhD international Association for the Study of Lung Cancer

6 Agradecimientos La IASLC agradece la generosa aportación y apoyo proporcionado por Pfizer Oncology para este atlas de pruebas de ALK. Los co-editores y todos los colaboradores también agradecen la asistencia editorial de Lori Alexander, MTPW, ELS, el apoyo de Deborah A. Whippen, Editorial Rx, Inc., y Rania Gaspo, PhD, Pfizer Oncology, durante la preparación de esta publicación.

7 Indice Lista de colaboradores...6 Abreviaturas Fabricantes Introducción Capítulo 1 Candidatos para las pruebas de ALK...11 Capítulo 2 Obtención de muestras, procesamiento y diagnóstico general de procedimientos Capítulo 3 Hibridación In Situ Fluorescente (FISH) Capítulo 4 La Inmunohistoquímica (IHC)...29 Capítulo 5 Capítulo 6 Retrotranscriptasa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR por sus Siglas en Inglés) y varios ensayos genéticos Comparación de diferentes plataformas de ensayo para pruebas de ALK Capítulo 7 Análisis de ALK en citología...53 Capítulo 8 Presentación de informes de la prueba ALK...58 Capítulo 9 Líneas de actuación y estudios de estandarización Capítulo 10 Resumen y perspectivas futuras...67 Referencias Anexo 1 Anexo 2 Resumen de estudios publicados sobre las pruebas de reordenamiento del gen ALK en cáncer de pulmón...74 Guía de pruebas moleculares propuestas por CAP/IASLC/AMP para la selección de pacientes con cáncer de pulmón elegibles para el tratamiento con inhibidores de la tirosina cinasa para EGFR y ALK...76

8 6 Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón Lista de colaboradores Editores Dr. Ming Sound Tsao, FRCPC Patólogo y Científico Senior, Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network Profesor, Departamento de Medicina De Laboratorio y Patobiología, University of Toronto Toronto, Canadá Dra. Elisabeth Brambilla, PhD Profesora, Département d Anatomie et Cytologie Pathologiques INSERM U823 Institut Albert Bonniot Centre Hospitalier Universitaire de Grenoble, Université Joseph Fourier Grenoble, Francia Dr. Lukas Bubendorf Profesor y Jefe de la División de Citopatología Instituto de Patología, University Hospital Basel Basel, Suiza Dr. Jin-Haeng Chung, PhD Profesor, Departamento de Patología Seoul National University Bundang Hospital Seoul, Corea del Sur Dr. Fred R. Hirsch, PhD Profesor, Departamento de Medicina Departamento de Patología University of Colorado en Denver Denver, Colorado, EE.UU. Autores colaboradores Keith M. Kerr, FRCPath Profesor, Departamento de Patología Aberdeen University Medical School Aberdeen Royal Infirmary Aberdeen, Escocia, Reino Unido Dra. Sylvie Lantuéjoul, PhD Profesor y Presidente del Departement d Anatomie et Cytologie Pathologiques INSERM U 823 Institut Albert Bonniot Centre Hospitalier Universitair A Michallon, Université Joseph Fourier Grenoble, Francia Dr. Kengo Takeuchi, PhD Objetivos Moleculares en Patología Instituto del Cáncer División de Patología del Cancer Institute Hospital Fundación Japonesa para la Investigación del Cáncer Tokyo, Japón Yasushi Yatabe, MD, PhD Jefe de Departamento de Patología y Diagnóstico Molecular, Aichi Cancer Center Nagoya, Japón Dr. Erik Thunnissen, PhD Patólogo, Consultor, VU University Medical Center Amsterdam, Holanda Marileila Varella-Garcia, PhD Profesora, Departamento de Medicina/Oncología Médica Departamento de Patología University of Colorado en Denver Denver, Colorado, EE.UU. Dr. Ignacio Wistuba Profesor y Presidente emérito de Jay and Lori Eisenberg Departamento de Patología Molecular Traslacional University of Texas MD Anderson Cancer Center Houston, Texas, EE.UU. Dr. Akihiko Yoshida, PhD Patólogo, Departamento de Patología National Cancer Center Hospital Tokyo, Japón Asistentes al Workshop IASLC ALK Testing, Sorrento, Italia, Primera fila, de izquierda a derecha Y. Yatabe, M. Varella-Garcia, E. Brambilla, S. Lanteujoul, R. Gaspo (Pfizer Oncology), J-H Chung. Última fila, de izquierda a derecha A. Yoshida, I. Wistuba, F. R. Hirsch, M. S. Tsao, E. Thunnissen, L. Bubendorf, K. Kerr.

9 7 Abreviaturas Abreviaturas Las siguientes abreviaturas se usan en el texto: AEC: 3-amino-9-etilcarbazol ALK: cinasa del linfoma anaplásico AMP: Asociación de Patología Molecular ATS: Sociedad Torácica Americana CAP: Colegio de Patólogos Americanos CISH: hibridación in situ cromogénica CPCP: cáncer de pulmón de células pequeñas CPCNP: cáncer de pulmón de células no pequeñas DAB: 3, 3 diaminobencidina EBUS: ecografía endobronquial EDTA: ácido etilendiaminotetraacético EGFR: receptor del factor de crecimiento epidérmico EML4: proteína 4 asociada al microtúbulo del equinodermo ERS: Sociedad Respiratoria Europea ETOP: Plataforma Oncológica Torácica Europea FDA: US Food and Drug Administration FFPE: fijado en formol e incluido en parafina FISH: hibridación in situ fluorescente H&E: hematoxilina & eosina HER2: factor de crecimiento epidérmico humano receptor 2 iaep: polímero intercalado de anticuerpos mejorado IASLC: Asociación Internacional para el Estudio de Cáncer de Pulmón IHC: inmunohistoquímica ISH: hibridación in situ KIF5B: miembro de la familia cinesia 5B NOS: no especificado NGS: secuenciación de nueva generación PAAF: Punción-aspiración con aguja fina RET: proto-oncogen ret ROS1: ros oncogen 1 RT-PCR: retrotranscriptasa-reacción en cadena de la polimerasa TKI: inhibidor de la tirosina cinasa USE: ecografía transesofágica v: variante

10 8 Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón Fabricantes Los siguientes fabricantes y sus productos se destacan en este Atlas. Las localizaciones dadas por cada fabricante no son únicas. La mayoría de los fabricantes tienen oficinas en todo el mundo. Abbott Molecular Abbott Park, Illinois, EE.UU. Vysis LSI ALK Break Apart FISH Probe Kit, Spectrum Orange Probe, and Spectrum Green Probe Abcam Cambridge, Reino Unido Anticuerpo Anti-ALK (5A4) BD (Becton, Dickinson and Company) Diagnostics Franklin Lakes, New Jersey, EE.UU. SurePath Cell Signaling Technology Danvers, Massachusetts, EE.UU. Anticuerpo D5F3 (ALK [D5F3] XP Rabbit mab) Dako Glostrup, Dinamarca Carpinteria, California, EE.UU. ADVANCE, anticuerpo ALK1, EnVision, EnVision+, EnVision FLEX, y EnVision FLEX+, PT Link, y Target Retrieval Solution Hologic, Inc. Bedford, Massachusetts, EE.UU. ThinPrep Invitrogen, Life Technologies Corporation Carlsbad, California, EE.UU. Anticuerpo Anti-ALK Leica Biosystems Buffalo Grove, Illinois, EE.UU. Wetzlar, Alemania Bond-Max, Novolink Polymer Detection System Nichirei Biosciences, Inc. Tokyo, Japón Anticuerpo 5A4 (Histofine ALK Detection Kit) Novocastra Newcastle, Reino Unido Anticuerpo 5A4 NanoString Technologies Seattle, Washington, EE.UU. NanoString assay Pfizer Oncology New York, New York, EE.UU. Xalkori TM Ventana Medical Systems, Inc. (miembro del grupo Roche) Tucson, Arizona, EE.UU. BenchMark XT, iview DAB Detection Kit, OptiView DAB IHC Detection Kit, OptiView Amplification Kit, y ultraview Universal DAB Kit, y Ensayo de Anticuerpo Primario Monoclonal de Conejo ZytoVision GmbH Bremerhaven, Alemania ZytoDot 2C SPEC ALK break-apart probe

11 INTRODUCCIÓN Por Ming Sound Tsao, Fred R. Hirsch y Yasushi Yatabe En los últimos años, el diagnóstico y el tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón avanzado ha sufrido grandes cambios. El modelo actual para la prescripción de nuevas terapias especializadas se basa en la selección de pacientes de acuerdo a la presencia de anormalidades oncogénicas específicas en el tumor. Las primeras anomalías en ser descubiertas en el cáncer de pulmón fueron las mutaciones en el dominio cinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Se encontró que los tumores con estas mutaciones tenían sensibilidad a los inhibidores de la tirosina cinasa de EGFR (TKIs). Desde entonces, el gen de la cinasa del linfoma anaplásico (ALK) se ha convertido en el segundo oncogén diana en el cáncer de pulmón para el que se han desarrollado nuevas terapias altamente efectivas. El nuevo gen de fusión ALK está formado por un reordenamiento que ocurre en el brazo corto del cromosoma 2 y afecta a los genes que codifican para ALK (2p23.2) y la proteína 4 asociada al microtúbulo del equinodermo (EML4) (2p21) o, raramente, a los genes en otros cromosomas. El producto proteíco de este nuevo gen de fusión tiene una cinasa constitutivamente activa de ALK porque el dominio básico del gen EML4 proporciona un mecanismo para la dimerización de la nueva proteína quimérica. Se han identificado numerosas variantes de reordenamiento del gen de fusión EML4-ALK en los diferentes tipos de cáncer de pulmón. Las fusiones implican la parte del extremo N-terminal del gen EML4 y el dominio de cinasa en la parte C-terminal del gen ALK. Debido a que esta reordenación génica implica una gran inversión y translocación cromosómica, la hibridación in situ fluorescente (FISH) se ha convertido en el método elegido para la detección de todas las formas de reordenamiento del gen ALK, y fue el ensayo utilizado para detectar esta aberración genética en los primeros ensayos clínicos del inhibidor de ALK, crizotinib (Xalkori, Pfizer Oncology) (Bang 2010, Kwak 2010, Camidge 2012). Por lo tanto, FISH y las sondas break-apart para detectar reordenamiento se han convertido en el método estándar para el diagnóstico de cáncer de pulmón con el reordenamiento ALK, y la Food and Drug Administration (FDA) de los EE.UU. ha aprobado la prueba Vysis LSI ALK Break-Apart FISH Probe Kit (Abbott Molecular) para ello. Este ensayo, junto con criterios bien definidos para los resultados positivos y negativos, se utilizó para identificar a los pacientes con cáncer de pulmón avanzado de células no pequeñas (CPCNP) que eran positivos para el reordenamiento del gen ALK. En un estudio fase I/II, la tasa de respuesta objetiva con crizotinib fue del 61% y una mediana de supervivencia libre de progresión de 9,7 meses (Camidge 2012). En un estudio en fase III aleatorizado (PROFILE 1007), en la que crizotinib se comparó con la quimioterapia en pacientes en los que la enfermedad había progresado durante la quimioterapia convencional, la tasa de respuesta objetiva con el tratamiento con crizotinib fue del 65 % (comparada con el 20% para la quimioterapia) y una mediana de supervivencia libre de progresión de 7,7 meses (en comparación con 3,0 meses para la quimioterapia) (Shaw 2013).

12 10 Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón Se ha desarrollado una nueva generación de inhibidores de ALK, y estos inhibidores se están estudiando en ensayos clínicos continuamente. En cuanto se detectan nuevos reordenamientos del gen, se ponen en marcha ensayos utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR): la secuenciación para detectar los genes de fusión. Además, los estudios de varias instituciones han demostrado que la proteína ALK puede ser detectada por inmunohistoquímica (IHC) con amplificación de la señal en casi todos los tumores que son ALK positivo en FISH, y varios informes describen casos en que los tumores CPCNP que albergan patrones atípicos de ALK en FISH (FISH ALK negativo) que son ALK positivo en la IHC pueden responder al tratamiento con inhibidores de ALK (Peled 2012). En este contexto se están desarrollando y validando los kits comerciales de la IHC actualmente. El desarrollo de estas múltiples plataformas de diagnóstico proporciona métodos alternativos para que los laboratorios detecten reordenamientos del gen ALK o proteínas de fusión, dependiendo de la experiencia y el equipo técnico disponible. Es necesario estandarizar estos ensayos dado que las pruebas de diagnóstico clínico requieren ensayos con una sólida reproducibilidad y fiabilidad. Para abordar esta cuestión, el Comité de Patología de la Asociación Internacional para el Estudio del Cáncer de Pulmón (IASLC) convocó a un panel de expertos para publicar esta guía que puede ayudar a los patólogos, científicos de laboratorio y médicos en ejercicio a entender mejor el trasfondo, el protocolo y la interpretación de los resultados de las pruebas de ALK en pacientes con CPCNP avanzado.

13 CAPÍTULO 1 Candidatos para las pruebas de ALK Por Fred R. Hirsch, Elisabeth Brambilla y Ming Sound Tsao Es ampliamente reconocido que la detección de reordenamientos del gen ALK es importante para la selección de la mejor terapia para los pacientes con CPCNP avanzado. Sin embargo, no está claro si las características clínico-patológicas pueden ayudar a determinar qué pacientes deben someterse a las pruebas de ALK. Los reordenamientos del gen ALK se encuentran con mayor frecuencia en los tumores de pulmón de los no fumadores, ex fumadores ocasionales, los pacientes más jóvenes y en los tumores clasificados como adenocarcinomas. Pero, es plausible excluir a los pacientes de edad avanzada y fumadores con histología escamosa de las pruebas de ALK? En estudios publicados, alrededor del 70 % al 80 % de los pacientes con CPCNP ALK- positivo han sido siempre no fumadores (comparado con el 20 % y el 30 % de los fumadores actuales o ex fumadores), y han sido más jóvenes (40 a 50 años) que las personas con CPCNP en general (60 a 70 años) o personas con CPCNP con mutación en EGFR (60 a 65 años) (Rodig 2009). Sin embargo, en todos los estudios, también se han encontrado tumores que albergaban reordenamiento de ALK en pacientes mayores de 70 años o menores de 40. De acuerdo con estos datos, no está claro que los antecedentes de tabaquismo y la edad debieran excluir las pruebas ALK en ningún paciente. La histología parece ser el criterio de selección más importante. De entre las más de muestras de cáncer de pulmón que se han descrito en la literatura, los reordenamientos de ALK se encuentran principalmente en los carcinomas no neuroendocrino y no escamoso de pulmón. (Figura 1; Anexo 1). Según estos A B 5.2 CPCNP ADSC (n=78) 5.7 ADC CCE (n=1411) ADC (n=6775) 11.1 ADC (no seleccionado) (seleccionado) CPCNP-Otros (n=376) CPCNP (n=4025) Figura 1. Resumen de los estudios sobre el reordenamiento del gen ALK en CPCNP. A. Número de casos de CPCNP que han sido estudiados sobre la aberración ALK y descritos en la literatura hasta mayo de CPCNP se refiere a los casos de los estudios que no especificaron los tipos de tumores, y los CPCNP-otros incluyen carcinoma adenoescamoso (ADSC) y carcinoma de células grandes/ sarcomatoide. B. Tasa estimada de casos ALKpositivo según la histología del tumor. Para adenocarcinoma (ADC), la figura 1 muestra la prevalencia en los estudios con o sin criterios clínicos de selección (por ejemplo, antecedentes de tabaquismo, negativo en EGFR o mutación en KRAS). Las cifras se basan en datos que se presentan en el Anexo 1. CCE=carcinoma de células escamosas CCE ADSC CPCNP- Otros

14 12 Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón datos, varias guías publicadas, incluyendo la guía de más reciente publicación desarrollada por el Colegio Americano de Patólogos (CAP)/Asociación Internacional para el Estudio del Cáncer de Pulmón (IASLC)/Asociación para la Patología Molecular (AMP), han recomendado que las pruebas de ALK no se realicen de forma rutinaria en el CPCNP avanzado con histología escamosa (Lindeman 2013). (Véase el Anexo 2 y el capítulo 9 para una discusión completa de las líneas de actuación para las pruebas de ALK). Sin embargo, el reordenamiento de ALK se ha detectado en aproximadamente el 1,3 % de más de carcinomas de pulmón de células escamosas (Anexo 1) y en varios informes de casos en los que el reordenamiento de ALK se verificó mediante la IHC (Alrifai 2013, An 2013, Ochi 2013). La discordancia entre los estudios de carcinoma de pulmón de células escamosas puede ser causada por las dificultades que todavía existen para diagnosticar los subtipos histológicos de CPCNP. Un diagnóstico de cáncer de pulmón a menudo se hace de acuerdo con el examen de una pequeña muestra de biopsia o muestras citológicas, pero los diagnósticos histopatológicos realizados en pequeñas muestras de biopsia no siempre son representativos de todo el tumor. En la revisión de un diagnóstico de cáncer de células escamosas de especímenes que no mostraban evidencia de mutaciones en EGFR ni mutaciones en KRAS, se demostró la presencia de componentes de adenocarcinoma en 15 de 16 tumores (Rekhtman 2012). Por lo tanto, la guía CAP/IASLC/AMP sugiere que las pruebas de ALK se hagan sólo a los pacientes con adenocarcinoma y cáncer de pulmón mixto con un componente de adenocarcinoma en muestras de cáncer de pulmón completamente extirpadas. La prueba ALK también se recomienda para muestras limitadas, como las muestras de biopsia y de citología, cuando no se puede excluir por completo el componente de adenocarcinoma. La detección de ALK con la IHC podría ser una solución ideal para los problemas de las pruebas de ALK en el carcinoma de pulmón de células escamosas. Teniendo en cuenta su bajo coste y su alta reproducibilidad, sensibilidad y especificidad, las pruebas de IHC se conciben para los pacientes con carcinoma de pulmón de células escamosas en combinación con la prueba FISH, que es más cara, y que se utiliza para confirmar los resultados positivos de la IHC. Las pruebas para el reordenamiento del ALK no se asocian actualmente con resultados terapéuticos inmediatos en los pacientes con CPCNP localizado o loco-regional. Sin embargo, pueden ser beneficiosas ya que muchos de estos pacientes, posteriormente, pueden sufrir una recidiva, y los resultados de las pruebas podrán ahorrar tiempo y esfuerzo en el futuro.

15 CAPÍTULO 2 Obtención de muestras, procesamiento y diagnóstico general de procedimientos Por Keith M. Kerr, Ignacio Wistuba y Yasushi Yatabe Las pruebas para detectar reordenamientos del gen ALK (en muestras de tejido afectadas por cáncer de pulmón) es uno de los varios procedimientos de diagnóstico necesarios. En la mayoría de los pacientes, un único procedimiento de muestreo va a generar una cantidad relativamente pequeña de tejido que luego debe ser utilizado de la manera más eficiente para permitir el diagnóstico más completo posible. Deben tenerse en cuenta dos puntos importantes sobre muestras de tejido: existe la posibilidad de que una muestra no contenga tejido tumoral, y sólo hay una oportunidad de fijar y procesar el tejido. Por lo tanto, la adquisición y el procesamiento son pasos cruciales en el control de calidad con el fin de facilitar todos los procedimientos de diagnóstico que se necesiten hacer sobre una muestra de tejido. La obtención de tejido para el diagnóstico En la mayoría de los casos, las pruebas de ALK se realizan en una pequeña muestra de tejido obtenida por biopsia o en muestras citológicas tomadas de los pacientes con enfermedad avanzada. Con menos frecuencia, se encuentra disponible todo el tumor de un paciente al que se le practicó una resección quirúrgica de la enfermedad en etapa inicial y recurrencia posterior. La toma de muestras de tejido para el diagnóstico debe tener como objetivo la obtención del mayor rendimiento del tumor en la forma más segura y menos invasiva posible (Thunnissen 2012d). El muestreo puede implicar al tumor primario, la enfermedad metastásica intratorácica o metástasis extratorácica. Aunque se han descrito discrepancias en el estado de ALK entre la enfermedad primaria o metastásica (Kim 2013), no hay suficientes datos para recomendar ningún método en concreto para la obtención de tejido. El tumor primario puede ser muestreado con endoscopia (por biopsia endobronquial o transbronquial, criobiopsia o punción aspiración con aguja fina [PAAF]), o con una técnica percutánea transtorácica (por biopsia con aguja o PAAF). Hoy en día la enfermedad metastásica intratorácica es rutinariamente muestreada usando ultrasonido endobronquial (EBUS) o una ecografía transesofágica (USE). Normalmente la enfermedad pleural (ya sea biopsia pleural o citología del líquido) es una buena fuente de material diagnóstico. La enfermedad metastásica distante (extratorácica) se puede muestrear dependiendo de su procedencia; en todos los casos, varias técnicas de imagen son útiles para determinar la selección de las muestras para mejorar el rendimiento del tumor (Rivera 2007). En muchos de los centros, se utilizan procedimientos quirúrgicos para obtener tejido si no se obtiene el material suficiente con los procedimientos guiados por imagen o cuando dichos procedimientos no han tenido éxito. Tejido para la prueba de ALK Para la prueba de ALK se puede utilizar tanto la biopsia de tejido como las muestras procedentes

16 14 Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón de citología; la clave está en que el material debe ser procesado y manipulado de forma adecuada y la muestra debe contener suficientes células tumorales (Thunnissen 2012b). El número de células tumorales necesarias para la determinación inmunohistoquímica (IHC) de la proteína ALK aún no está definido, pero para evaluar la técnica FISH para determinar el reordenamiento del gen ALK, se requiere un mínimo de 50 células tumorales. Existen diferentes enfoques para las muestras de frotis citológico, pero el más adecuado con las muestras de citología es generalmente el bloque celular que permite preparar y tratar las secciones de la misma manera que las secciones de muestras de biopsia de tejido. En general, todo el tejido o material celular recibido en el laboratorio de patología debe ser procesado. Los especímenes de resección quirúrgica son una excepción, aunque, como regla general, los tumores con un diámetro de 3cm o menos deben ser procesados en su totalidad. Los derrames pleurales abundantes también pueden ser procesados en parte. Se recomienda el almacenamiento del fluido hasta que todos los procedimientos de diagnóstico hayan concluido. Procesamiento de tejidos Se recomienda la fijación por inmersión, o cuando corresponda, por insuflación, con formaldehído tamponado al 10%. La pre-fijación con algunos fijadores a base de alcohol puede alterar la antigenicidad del tejido o la integridad del DNA. Las soluciones descalcificadoras ácidas utilizadas en muestras de biopsia ósea pueden interferir con la IHC, con frecuencia comprometer la prueba FISH y a menudo degradar el DNA, y por ende hacer que las pruebas para determinar las mutaciones sean menos fiables. También se deben evitar los agentes de fijación que son ácidos (tales como el fluido de Bouin) o a base de sales de metales pesados. En general, se recomienda un periodo de fijación de más de 6 horas y menos de 48 horas, especialmente cuando se tengan que hacer pruebas de biomarcadores (para las que la integridad del DNA es importante) (Wolff 2007, Hunt 2007). Un defecto o un exceso de fijación pueden tener efectos nocivos en el DNA y sobre los epítopos de una proteína antigénica (Werner 2000, Atkins 2004, Oyama 2007, Bussolati 2008, Eberhard 2008). Una de las partes importantes de dicha fase en la manipulación de tejidos es el periodo de tiempo que comienza inmediatamente después de extirpar la muestra del paciente y colocarla en el fijador. La mayoría de los laboratorios no tienen ni el control, ni los datos sobre la cantidad de tiempo transcurrido entre la extracción de tejidos y la inmersión en un fijador y su llegada al laboratorio. Además, la mayoría de las máquinas de procesamiento de tejidos tienen una etapa de fijación, lo que aumenta el tiempo de fijación. En la práctica, la mayoría de los laboratorios ajustan sus procesos de tinción pertinentes para la IHC y la hibridación in situ (ISH) para determinar su propio tiempo medio de fijación. La determinación de la naturaleza y duración de la fijación es un desafío aún mayor en los laboratorios que reciben muestras de muchas fuentes externas con muy diferentes métodos de fijación. Manejo de tejidos para pruebas de biomarcadores La mayoría de las investigaciones con biomarcadores (IHC, ISH, o estudios de RNA / DNA) se llevan a cabo durante el estudio diagnóstico inicial. En estas circunstancias, se deben utilizar las secciones recién cortadas para las pruebas de biomarcadores. El tejido previamente cortado y almacenado en un portaobjetos se deteriorará en cuestión de días o semanas y, ciertamente, a lo largo de los meses. La degradación depende de las condiciones de almacenamiento y muy probablemente también del biomarcador específico (Atkins 2004). La estabilidad de la proteína ALK en secciones no teñidas aún no se ha estudiado sistemáticamente. Por lo tanto, de forma similar que en la determinación de HER2 en cáncer de mama, los cortes de secciones de tejido almacenadas durante más de 6 semanas no se deben utilizar para las pruebas de IHC para ALK. Si se requiere su almacenamiento, las secciones

17 15 CAPÍTULO 2: Obtención de muestras, procesamiento y diagnóstico general de procedimientos deben estar revestidas en cera o un medio similar para evitar la oxidación por aire y además deben mantenerse en un lugar fresco, oscuro y seco. El tejido fijado en formol e incluido en parafina (FFPE) es menos propenso al deterioro, y en la mayoría de las circunstancias, resulta útil recortar el bloque de tejido según sea necesario en un momento posterior. Existen diversas estrategias que pueden ayudar a limitar el número de veces que el bloque debe ser cortado para proporcionar material para la evaluación inicial morfológica, la tinción IHC, y posterior análisis molecular. Por ejemplo, las secciones adicionales se pueden cortar en la primera sesión de corte, y aunque esta estrategia puede salvar la inevitable pérdida de material de gran valor en cada nueva sesión de corte, se puede dar el caso de cortar innecesariamente y ello puede plantear cuestiones relacionadas con el almacenamiento de las secciones cortadas (Figura 1). Procedimiento rutinario actual El Tinción con H&E para diagnóstico histológico Repetir cortes para la IHC Repetir cortes para las pruebas moleculares El procedimiento en la era de las terapias molecularmente dirigidas Tinción con H&E para diagnóstico histológico para la IHC para las pruebas moleculares Figura 1. Preparación de las secciones de tejido durante la evaluación diagnóstica. La práctica rutinaria actual consiste en hacer secciones adicionales para el ensayo IHC y/o pruebas moleculares después de los cortes iniciales para la tinción de hematoxilina- eosina (H&E) para el diagnóstico histológico. El corte seriado múltiple puede mermar el volumen del tumor cada vez que se recorte el bloque. En la era de las terapias molecularmente dirigidas, la preparación de las secciones adicionales sin teñir para posibles análisis de IHC y/o pruebas moleculares puede reducir significativamente la cantidad de muestra de tejido perdido y mejorar el tiempo de respuesta.

18 16 Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón primer paso en la evaluación de una muestra es identificar la presencia o ausencia de malignidad. Dependiendo de la selección de pacientes, elección de la técnica de muestreo y la habilidad del cirujano, la tasa de hallazgos tumorales positivos es generalmente alta, pero puede variar desde aproximadamente el 60 % hasta más del 90 % (Schreiber 2003). Es bien sabido que, incluso cuando el tumor está presente en la muestra, puede no estar presente en todos los fragmentos de tejido y por lo general comprende una pequeña proporción de la muestra (Coghlin 2010). Una vez que se confirma la malignidad, el siguiente paso es excluir la posibilidad de tumores malignos no epiteliales (tales como linfoma o sarcoma) y/o la posibilidad de que un cáncer, especialmente el adenocarcinoma, no sea la metástasis de pulmón de otro órgano (Kerr 2013b). Este paso se suele hacer fácilmente basándose en la evaluación de la información clínica y radiográfica adecuada que acompaña a la muestra y la evaluación morfológica básica basada en H&E. La falta de información clínica, sin embargo, puede conllevar a la realización de pruebas auxiliares de IHC innecesarias en la muestra en un intento de excluir posibles fuentes extratorácicas de un adenocarcinoma, lo cual puede conllevar a que se agote el material para posteriores estudios moleculares. Suponiendo que el tumor es un cáncer primario de pulmón, el siguiente paso es distinguir el cáncer de pulmón de células pequeñas (CPCP) de otros tipos, ya que el CPCP avanzado se trata de manera distinta al CPCNP. Por lo general, esta discriminación se puede hacer con gran precisión basándose en las características morfológicas (Burnett 1994), pero aún así, la IHC podría llegar a ser necesaria. La mayoría de los casos que no son CPCP pueden ser diagnosticados con precisión y clasificados morfológicamente como carcinomas escamosos, adenocarcinomas o, en raras ocasiones, otro tipo de CPCNP. Entre 25% y 40% de los casos, sin embargo, dependiendo del tipo de muestra y casuística, las características morfológicas no son adecuadas para la clasificación precisa y consistente del subtipo CPCNP; tales casos deben ser designados inicialmente como CPCNP no especificado (NOS) (Chuang 1984). A continuación, se puede utilizar la IHC en el diagnóstico para predecir la probabilidad del subtipo de CPCNP (Loo 2010, Travis 2011, Travis 2013). Este enfoque, utilizando un panel de IHC limitado, puede reducir la proporción de casos de CPCNP-NOS a menos del 10% y predecir el subtipo de CPCNP en la mayoría de los casos de NOS con una precisión de más del 80% (Loo 2010). Los casos descritos juntamente con este uso de IHC deben ser informados usando la terminología recomendada (por ejemplo, CPCNP, probable adenocarcinoma) en un caso morfológicamente indiferenciado, donde la IHC puede predecir adenocarcinoma (Travis 2011, Kerr 2013a). Conclusión El criterio estándar se basa en la identificación de pacientes con dianas moleculares terapéuticas en sus tumores. La necesidad de más pruebas moleculares, más allá de las requeridas para el diagnóstico morfológico inicial y el perfeccionamiento de la clasificación de tumores por la IHC cuando sea necesario, hace que la adquisición, la manipulación, el procesamiento y el aprovechamiento razonable de tejido tumoral de diagnóstico sea de suma importancia. Se debe hacer todo lo posible para asegurar que una cantidad suficiente de tejido tumoral esté disponible para los pasos diagnósticos posteriores. Sin embargo, la falta de tejido suficiente puede ser inevitable en algunos casos, y conlleva a un gran impacto en las pruebas moleculares que siguen al diagnóstico del tumor. Cuando la cantidad de tejido es insuficiente, es cada vez más frecuente realizar la biopsia de repetición.

19 CAPÍTULO 3 Hibridación In Situ Fluorescente (FISH) Por Akihiko Yoshida y Marileila Varella-Garcia La sonda FISH de rotura (o break-apart) fue originalmente desarrollada para la detección de fusiones de genes creados por translocaciones intracromosomales. FISH break-apart es un método de diagnóstico fiable en la patología quirúrgica, ya que es fácilmente aplicable a especímenes FFPE, incluso cuando no se conocen las parejas exactas de fusión. Las sondas FISH ALK break-apart se han incorporado con éxito en la práctica habitual de diagnóstico de linfomas y de los tumores mesenquimales, y el descubrimiento del reordenamiento de ALK en un subgrupo raro de CPCNP amplió su aplicación (Soda 2007). Sin embargo, en este último escenario, la prueba FISH se ha enfrentado a complicaciones inesperadas, principalmente debido a que las variantes comunes de fusión se producen entre ALK (2p23.2) y el gen situado muy cerca de EML4 (2p21) a través de inversiones intracromosomales. Rara vez el gen ALK se fusiona con otros genes por translocación intracromosomal. Por lo tanto, la técnica FISH break- apart para detectar el reordenamiento del gen ALK, se debe realizar prestando mucha atención a los aspectos técnicos y a la interpretación de los resultados. Diseño de la sonda FISH La sonda de rotura ALK está originalmente diseñada mediante el marcaje de la región 3' (telomérica) del punto de rotura con un fluorocromo y la región 5' (centromérica) con otro fluorocromo distinto. Existen algunas variaciones entre los diferentes reactivos comerciales o hechos a medida para las zonas genómicas específicas cubiertas por las sondas y los distintos fluorocromos utilizados para el marcaje. En el kit desarrollado por Abbott Molecular (Figura 1; Vysis LSI FISH ALK break apart Probe Kit), la región 3' (aproximadamente de 300 kb) se representa por una señal naranja (espectro naranja, a menudo referido como rojo en la literatura debido a que la señal es detectada por el filtro de interferencia en la longitud de onda roja), y la región 5' (aproximadamente de 442 kb) está representada por una señal verde (espectro verde). Este conjunto de sonda fue aprobado como un ensayo de diagnóstico complementario para un inhibidor de ALK por la FDA de EE.UU. y se utiliza comúnmente en todo el mundo. 300 kb 442 kb 5' 3' 2p23.2 Normal ALK ALK:EML4 EML4 ALK:EML4 ~12.5 Mb inversión Gen de fusión EML4- ALK Figura 1. El Vysis LSI FISH ALK Break Apart Probe Kit (Abbott Molecular) para la prueba para detectar la presencia del gen de fusión EML4-ALK (reordenamiento en ALK) en el cáncer de pulmón.

20 18 Atlas de la IASLC de Pruebas de ALK en Cáncer de Pulmón Requisitos de manipulación preanalítica Como cualquier ensayo basado en el DNA, la técnica FISH tiene una ventaja importante por su solidez. Sin embargo, el ensayo se ve afectado por muchos factores, especialmente el momento de la fijación, el tiempo de fijación, y el tipo de fijador, todo lo cual puede conducir a la degradación del DNA (Tabla 1) (Hunt 2007, Babic 2010). Por ejemplo, la larga isquemia fría, o que transcurra más de 1 hora desde el momento en que el tejido se extirpa hasta que se fija, puede provocar la degradación del DNA y por consiguiente que las pruebas de FISH no sean valorables (Khoury 2012). Se considera que el momento ideal para la fijación es de entre 6 y 48 horas (Hunt 2007, Babic 2010); tanto los tiempos de fijación más cortos como los más largos pueden influir en el rendimiento de las pruebas de manera significativa. Tabla 1. Recomendaciones preanalíticas para la obtención de unos buenos resutados de las pruebas FISH Parámetro Recomendaciones Tiempo de fijación Lo más corto posible, que no exceda 1 hora Fijador Formaldehído tamponado al 10% Tiempo de fijación Preparación Almacenamiento de la muestra Tiempo de almacenamiento de los bloques 6-48 horas Muestras parafinadas cortadas a un grosor de 5 ±1 μm Bloques de tejido (ideal) No es relevante si las condiciones son adecuadas Condiciones de almacenamiento de los bloques Tiempo de almacenamiento para los cortes histológicos Descalcificación Protegidos de la luz, del calor y la humedad 4-6 semanas (ideal); los cortes menos recientes requieren un protocolo personalizado EDTA, si es necesario El fijador óptimo es el formaldehído tamponado al 10%; el fijador Prefer y el fijador de Bouin impedirán la hibridación. Es casi seguro que los tejidos descalcificados con soluciones de ácido fuerte no puedan hibridar. La descalcificación suave con EDTA o ácido fórmico en general no afecta sustancialmente el rendimiento de la prueba. La descalcificación es particularmente relevante cuando la única muestra disponible para el análisis molecular es una lesión ósea metastásica; en tales casos, el grado de descalcificación ósea puede deducirse a partir del tejido teñido con H&E, lo cual puede ayudar a decidir si se pueden utilizar las muestras para la prueba FISH. Otro factor relevante para la eficacia del ensayo es el tiempo y las condiciones de almacenamiento de las secciones. El tejido seccionado en portaobjetos que se guarda durante un periodo prolongado a temperatura ambiente no suele dar buenos resultados en ensayos FISH estándar, requiriendo protocolos personalizados. Por lo tanto, el bloque de tejido incluido en parafina es el formato ideal de almacenamiento. El tiempo de almacenamiento aceptable para los bloques de parafina varía en función de las condiciones de almacenamiento (por ejemplo, la temperatura, la exposición a la luz, al calor o a la humedad), y los materiales sometidos a condiciones que degradan el DNA pueden fallar para hibridar. Numerosas variables antes y después de la hibridación también pueden afectar a la prueba. El proceso de prehibridación incluye una serie de pasos para facilitar la penetración de la sonda en el núcleo de las células tumorales. La permeabilización del tejido se consigue con la digestión de las

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