UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS INSTITUTO SUPERIOR DE POSTGRADO MAESTRÍA DE MEDICINA TRANSFUSIONAL

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1 DETERMINACIÓN DE TRANSFUSIONES SANGUÍNEAS CON FENOTIPOS DEL SISTEMA RH INCOMPATIBLES, ANALIZADOS MEDIANTE PRUEBAS INMUNOHEMATOLÓGICAS EN RECEPTORES Y UNIDADES DE SANGRE TRANSFUNDIDAS, REMITIDAS POR EL BANCO DE SANGRE FAUSTO CASTELLO DE LA CRUZ ROJA PROVINCIAL DE NAPO DURANTE EL PERIODO ENERO A JUNIO DEL Lic. Judith Angélica Rivas Viteri Lic. Wilmer Ufredo Sucre Monserrate AUTORES UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS INSTITUTO SUPERIOR DE POSTGRADO MAESTRÍA DE MEDICINA TRANSFUSIONAL Quito, Agosto 2014

2 DETERMINACIÓN DE TRANSFUSIONES SANGUÍNEAS CON FENOTIPOS DEL SISTEMA RH INCOMPATIBLES, ANALIZADOS MEDIANTE PRUEBAS INMUNOHEMATOLÓGICAS EN RECEPTORES Y UNIDADES DE SANGRE TRANSFUNDIDAS, REMITIDAS POR EL BANCO DE SANGRE FAUSTO CASTELLO DE LA CRUZ ROJA PROVINCIAL DE NAPO DURANTE EL PERIODO ENERO A JUNIO DEL Lic. Judith Angélica Rivas Viteri. Lic. Wilmer Ufredo Sucre Monserrate. AUTORES UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS INSTITUTO SUPERIOR DE POSTGRADO MAESTRÍA DE MEDICINA TRANSFUSIONAL Tesis de Grado presentado como requisito parcial para optar el Título de Magíster en Medicina Transfusional Dr. Marcelo Fabricio Medrano Caicedo. DIRECTOR Dra. Jéssica Guarderas Muñoz. TUTOR METODOLÓGICO Quito, Agosto 2014

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5 iv CONTENIDOS INTRODUCCIÓN 1 pág. I CAPITULO 1.1. Planteamiento del problema Interrogantes de la investigación Hipótesis Objetivos de la Investigación Objetivo general Objetivos específicos Justificación de la investigación 7 II CAPITULO MARCO TEORICO 2. Marco teórico Antecedentes de la investigación Principios inmunológicos Antígeno Capacidad antigénica Clasificación por la naturaleza química de los antígenos Clasificación por el origen de los antígenos 14

6 v Antígenos de los eritrocitos Anticuerpos Estructura básica de los anticuerpos Clasificación de la inmunoglobulinas Determinantes antigénicos de las inmunoglobulinas Tipos de anticuerpos Reacción antígeno-anticuerpo Anticuerpos Monoclonales Reacciones adversa a la transfusión Reacciones de tipo inmunológico Reacción hemolítica retardada Ensayos inmunohematológicos Sistema de grupo sanguíneo El sistema Rh Teorías y nomenclaturas del sistema Rh Anticuerpos del anti-rh Eritroblastosis Fetal Control de calidad en el laboratorio de compatibilidad Control de procesos Controles de calidad externos Fundamentación legal 42

7 vi III CAPITULO MARCO METODOLOGICO 3.1. Diseño de la investigación Método de la investigación Matriz de variables Operacionalización de las variables Población y muestra Criterios de exclusión Aspectos éticos y de propiedad intelectual Técnicas e instrumentos de recolección de la información 45 IV CAPITULO MARCO ADMINISTRATIVO 4.1. Viabilidad o factibilidad del problema de investigación Recursos materiales Talentos humanos Recursos financieros y conflictivos de intereses 53

8 vii V CAPITULO 5.1. Análisis de los resultados Discusión 65 VI CAPITULO 6.1. Conclusiones Recomendaciones 69 Bibliografía 70 Anexos 74

9 viii RESUMEN El presente trabajo tiene como objetivo principal determinar la frecuencia de transfusiones sanguíneas con fenotipos del sistema Rh incompatibles, con el fin de prevenir posibles reacciones transfusionales que puedan presentar los receptores al quedar sensibilizados por los principales antígenos eritrocitarios, mediante la técnica en tubo realizamos las pruebas inmunohematológicas en los donantes y receptores de sangre que acuden al Banco de Sangre Fausto Castello de la Cruz Roja Provincial de Napo. Los cinco antígenos más frecuentes del sistema Rh son el D seguido de los antígenos c, E, C y e, tiene gran importancia por su poder inmunogénico en las reacciones hemolíticas. Se analizaron a 207 receptores, se realizó una base de datos tomando en cuenta los siguientes parámetros: sexo, número de transfusiones, frecuencia de fenotipos Rh en donadores y receptores de sangre, se analizó la compatibilidad e incompatibilidad de las transfusiones sanguíneas por causa de los antígenos inexistentes en los eritrocitos de los receptores, por último, se estableció el antígeno Rh incompatible que fue transfundido con mayor frecuencia. Encontrándose que los fenotipos más frecuente en los receptores y donadores de sangre son fenotipos CDe y CcDEe con el 39.6% y el 36.7% respectivamente. De las personas que recibieron transfusiones el 73.4% corresponde a las mujeres de ellas el 50,2% recibió varias concentrados de glóbulos rojos, aumentando el riesgo de sufrir una incompatibilidad. Por este motivo, es necesario realizar las pruebas de compatibilidad de antígenos del sistema Rh a todos los pacientes para precautelar el sistema inmunológico. Los antígenos incompatibles que con mayor frecuencia fueron transfundidos son el antígeno c 56.4%, seguido del C con el 21.3% y el E con el 16% son los antígenos más inmunológicos de acuerdo a lo que señala la literatura, que pueden provocar a futuro reacciones hemolíticas de leves a severas. Los porcentajes hallados en la presente investigación varían ligeramente de otros estudios pero mantienen la misma prevalencia de los fenotipos y antígenos. PALABRAS CLAVE. Antígeno, anticuerpo, fenotipo, transfusión.

10 ix ABSTRACT The main objective of this research work is to determine the frequency of blood transfusions with incompatible Rh phenotypes in order to prevent possible transfusion reactions in recipients that remain sensitized by major erythrocyte antigens. By tube technique we performed immunohematology tests on blood donors and recipients attending the Blood Bank Fausto Castello of Provincial Red Cross Napo. The five most common Rh antigens are D followed by c, E, C and e antigens. It is of great importance for its immunogenic power in hemolytic reactions. 207 recipients were analyzed, a database was performed taking into account the following parameters: sex, number of transfusions, frequency of phenotypes Rh in donors and recipients of blood, compatibility and incompatibility of blood transfusions was analyzed because of the nonexistent antigens in receptors erythrocytes, finally the incompatible Rh antigen was established that was transfused more frequently. It was found that the most common phenotypes in blood donors and recipients are phenotypes CDe and CcDEe with 39.6% and 36.7% respectively. Of those people who received transfusions, 73.4% were women, 50.2% of them received several packed red blood cells, thus increasing the risk of incompatibility. For this reason, compatibility tests of Rh antigens are necessary to perform at all patients in order to forewarn the immune system. The incompatible antigens most frequently transfused with "c" 56.4% antigen, followed by "C" with 21.3% and with "E" with 16% are the most immunological antigens according to the literature, which can cause future hemolytic reactions from mild to severe. The percentages found in this research vary slightly from other studies, but keep the same prevalence of antigens and phenotypes KEYWORDS Antigen, antibody, phenotype, transfusion

11 INTRODUCCIÓN La Medicina Transfusional, junto con la Inmunohematología tienen como objetivos el estudio y la cuantificación de los grupos sanguíneos y de sus componentes antigénicos presentes en la membrana de los eritrocitos (Lluís & Lluís, 2002). La medicina transfusional es una especialidad multidisciplinaria que se ocupa de la adecuada selección y utilización de los componentes y derivados sanguíneos. La transfusión de sangre es un recurso básico que apoya a una gran diversidad de modalidades terapéuticas. La transfusión sanguínea comprende numerosas etapas que deben controlarse estrictamente para proveer un mejor servicio para los donadores y pacientes, donde la exactitud y eficacia evolucionan cada día (Majluf & Pérez, 2006). Generalmente el término sangre se relaciona con la muerte o alguna enfermedad, pero en realidad es la solución a muchos problemas de salud. En el proceso de transfusión sanguínea se transfiere por vía intravenosa la sangre o células sanguíneas del donador al receptor y con ella el factor Rh. El sistema Rh clínicamente tiene gran importancia, debido a que sus antígenos son sumamente inmunogénicos y juegan un papel central en la patogénesis de las reacciones post transfusionales, porque pueden presentarse una serie de efectos adversos inmediatos o tardíos producidos por mecanismos inmunológicos (Bernard, 2005). La herencia de los antígenos Rh es determinada por un complejo de dos genes, RHD y RHCE uno codifica la proteína transportadora del antígeno D y 1

12 el otro codifica la proteína transportadora de los antígenos "C", "c", "E" y "e" (Parslow, Stites, Terr, & Imboden, 2001). Las pruebas inmunohematológicas son la base para la determinación de los diferentes fenotipos Rh, su realización es importante para evitar la destrucción de los eritrocitos portadores del antígeno durante el embarazo, en pacientes transfundidos previamente y en pacientes conocidos con anticuerpos irregulares circulantes, evitando reacciones postransfusionales. (BIO-RAD, 2012) La investigación propuesta busca servir como guía para evitar la sensibilización de los pacientes por la transfusión de diferentes fenotipos Rh, que pueden provocar daños irreversibles en el sistema inmune con efectos colaterales sobre todo en la enfermedad hemolítica del recién nacido. Para alcanzar los propósitos de la investigación se ha escogido como sitio de estudio La Cruz Roja Provincial del Napo. Durante un periodo de 6 meses, se analizaron las unidades de sangre obtenidas de los donantes y receptores tiempo en el que se determinó la expresión fenotípica de sistema Rh mediante la tipificación sanguínea directa en tubo de donantes y receptores, estableciendo el fenotipo predominante. Se identificó, además, el grupo sexual al que se transfundió con mayor frecuencia fenotipos Rh incompatibles. Los hallazgos obtenidos permitieron determinar que la frecuencia de transfusiones sanguíneas, con fenotipo del sistema Rh incompatibles no es representativa. Aportando de esta manera con información precisa para que la aplicación de las técnicas inmunohematológicas en la determinación de fenotipos Rh, sea adoptada como parte del protocolo de compatibilidad sanguínea. 2

13 I CAPITULO 1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA El proceso de transfusión es una sucesión de hechos simultáneos que inician con la decisión de que un paciente realmente necesita sangre, y finaliza, con la evaluación del resultado clínico de la transfusión, demostrando que sus procedimientos fueron seguros, eficientes y clínicamente eficaces. (McClelland DBL, 2011) En el transcurso de estos 100 años se han encontrado más de 300 antígenos en los eritrocitos, detectados por sus respectivos anticuerpos producidos después de una transfusión, y más comúnmente luego de haber recibido varias transfusiones o durante embarazos hematológicamente incompatibles. (Alcazar, 2007) Las transfusiones sanguíneas, con fenotipos Rh diferentes, pueden causar sensibilizaciones y éstas llegar a no ser diagnosticados si la persona no requiere una nueva transfusión sanguínea a lo largo de su vida o en el caso de una mujer, si no tiene embarazos al haber recibido una transfusión previa. Si la terapia transfusional se realiza sin cumplir todas las normas de seguridad, provocaría serios daños en el organismo del paciente, la mayoría de ellos irreversibles pudiendo incluso llegar a consecuencias fatales. Según Willy Flegel y Tello los cinco antígenos Rh más inmunogénicos (D, c, E, e y C), son la causa de más del 99 % de los problemas clínicos relacionados con este sistema; por cuanto algunos de los individuos carentes 3

14 de la expresión de alguno de estos antígenos, cuando son inmunizados, pueden producir anticuerpos contra el antígeno faltante. Desde el año 2000 las mujeres en edad reproductiva y niñas han recibido transfusiones compatibles para otros antígenos Rhesus como C, c, E y e. (Flegel, 2007) (Tello, 2012) Un estudio realizado en Costa Rica reporta que se realizó análisis a donantes entre el año de los cuales 251 (8.12%) son Rh negativos, de estos el 92,4% poseen el fenotipo ccdee y solo el 7.6 % de los donantes negativos poseen el antígeno E o C que podrían sensibilizar al paciente con fenotipo ccdee. A pesar de la baja frecuencia de fenotipos que poseen el antígeno C y el antígeno E 0.49 % y 0.13% respectivamente, es fundamental verificar el fenotipo Rh de la unidad sanguínea a transfundir para evitar la sensibilización de un paciente con uno o varios fenotipos y ofrecer componentes sanguíneos con menos riesgo de reacciones adversas. (Navarrete & Segura, 2012) La terapia transfusional sanguínea es de suma importancia dada las características clínicas del receptor, muchos profesionales pasan por alto la verificación del fenotipo Rh de las unidades sanguíneas sobretodo Rh negativo, tomando por hecho que todas son de fenotipo idéntico (compatible). Sin embargo, se debe tener en consideración que existen otros fenotipos que eventualmente pueden sensibilizar a un paciente. (Navarrete & Segura, 2012) En la provincia del Napo se realiza un promedio de 800 donaciones anuales que son analizadas y procesadas para ser remitidas a los diferentes servicios de Medicina Transfusional, la identificación de fenotipos Rh a receptores y a unidades sanguíneas a transfundir no se realiza de manera rutinaria, corriendo el riesgo de sensibilizar al paciente con un antígeno diferente, con los efectos colaterales subsecuentes. 4

15 1.2. INTERROGANTES DE LA INVESTIGACIÓN Será que la frecuencia de incompatibilidad del fenotipos Rh es alta en el Banco de Sangre Fausto Castello de la Cruz Roja Provincial de Napo, y se deberá, a que no se realizan de manera previa, a las transfusiones sanguíneas, las pruebas inmunohematológicas para determinar la existencia de compatibilidad por antígenos del sistema Rh? 1.3. HIPOTESIS La frecuencia de transfusiones sanguíneas con fenotipo del sistema Rh incompatibles es significativo, principalmente se debe a que no se aplican las pruebas inmunohematológicas para determinar el fenotipo del sistema Rh (D, c, C, E, e), lo cual guarda relación con el sexo y el número de transfusiones que los receptores han recibido en el Banco de Sangre Fausto Castello de la Cruz Roja Provincial de Napo. 5

16 1.4. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION OBJETIVO GENERAL: Determinar la frecuencia de transfusiones sanguíneas con fenotipos del Sistema Rh incompatibles o diferentes, y su relación con el sexo y el número de transfusiones recibidas, en el Banco de Sangre Fausto Castello de la Cruz Roja Provincial de Napo durante el período Enero a Junio del OBJETIVOS ESPECÍFICOS: Determinar la expresión fenotípica C, c, D, E y e, del sistema Rh mediante la tipificación sanguínea directa en tubo de donantes y receptores. Identificar el fenotipo más frecuente en receptores y donantes de sangre y cual es el grupo sexual al que se transfundió mayoritariamente. Determinar el antígeno (C, c, D, E y e) incompatible que se transfundió con mayor frecuencia. Establecer el número de transfusiones sanguíneas administradas a los receptores de sangre y su relación con la compatibilidad e incompatibilidad de fenotipos Rh. 6

17 1.5. JUSTIFICACION DE LA INVESTIGACIÓN La transfusión de sangre y derivados sanguíneos se considera como un procedimiento relativamente seguro, inocuo y eficaz. Sin embargo, no está exenta de complicaciones adversas, siendo entre otras la formación de anticuerpos contra uno o más antígeno eritrocitarios; así como también, reacciones transfusionales de diversos tipos que pueden presentarse de manera inmediata o tardía, siendo desde leves hasta muy graves que incluso pueden comprometer la vida del receptor. Se han establecido medidas específicas en los bancos de sangre para facilitar la disponibilidad y oportunidad en la entrega de hemocomponentes, cada vez se aplican nuevos controles y procedimientos que garanticen la seguridad transfusional (Cruz roja, 2011) El sistema Rh es clínicamente el más importante y complejo por su poder antigénico-eritrocitario atribuible a su base genética compleja, con más de 50 antígenos descritos hasta ahora, es el más grande de los 30 sistemas de grupos sanguíneos según la Sociedad Internacional de Transfusión de Sangre. (Bernard, 2005) La determinación del fenotipo Rh incluye los antígenos D, C, c, E y e, reconocibles in vitro mediante métodos inmunohematológicos. Su importancia en medicina transfusional se debe a la capacidad de producir enfermedad hemolítica del recién nacido y/o reacciones hemolíticas intravasculares. Tras el antígeno D, le siguen en capacidad inmunogénica por orden decreciente el c, E, e, y el C. En la población general, el antígeno C tiene una frecuencia aproximada de 70 %, frente a la frecuencia del 80% del antígeno c, el antígeno E tiene una frecuencia del 30% mientras que el e se aproxima al 98 % de frecuencia. El Antígeno c es el más inmunógeno 7

18 luego del D y como tal es el causante de riesgo en la E.H.R.N. y R.H.T. (BIO- RAD, 2012) (Lluís & Lluís, 2002) (Flegel, 2007) (Tello, 2012) La inmunogenicidad del antígeno D es tal que el 80% de los individuos RhD negativo producen anticuerpos anti-d con la transfusión de solamente una unidad de sangre RhD positiva. (Martinez, 2008). Considerando la mayor inmunogenicidad de los Antígenos Rh, un receptor RhD positivo carente del antígeno correspondiente puede ser inmunizado por antígeno c, así mismo un receptor RhD negativo puede ser inmunizado o presentar reacción transfusional con antígeno E. Este sistema estratégico está diseñado para fortalecer la seguridad transfusional, por lo tanto, nuestra responsabilidad es proteger la integridad del sistema inmune de los receptores de hemocomponentes. 8

19 II CAPITULO 2. MARCO TEÓRICO 2.1. Antecedentes de la investigación El Ministerio de Salud Pública cuenta con 135 unidades hospitalarias, la mayoría de ellos son hospitales básicos, en menor cantidad hospitales generales y muy pocos hospitales de especialidad, los mismos que se encuentran ubicados básicamente en las principales ciudades del país. Todos estos hospitales tienen como denominador común entre otras permisiones la de realizar transfusiones de derivados sanguíneos, función para lo cual se abastece de hemocomponentes desde los Bancos de Sangre de distintas Instituciones del país. Según la Organización Mundial de la Salud, el Ministerio de Salud Pública para el año 2010 calculó la necesidad de componentes sanguíneos para cubrir la demanda de sus unidades operativas de salud. Un gran Hemocentro Nacional, junto con seis Centros Zonales de Fraccionamiento y 29 Centros cantonales y provinciales de Captación de Donantes de Sangre y Distribución de Productos Sanguíneos, forman la Red Nacional de Servicios de Sangre con que trabaja la Cruz Roja Ecuatoriana con lo cual ha llegado a cubrir el 70% de la demanda nacional de sangre. El Hemocentro Nacional distribuye aproximadamente 200 unidades de sangre diarias y como promedio unos hemocomponentes mensuales. 9

20 En Ecuador en el año 2010, se captaron algo más de pintas de sangre, de ellas, 130 mil fueron captadas por la Red Nacional de Bancos de Sangre de la Cruz Roja Ecuatoriana, siendo el 50% de donantes voluntarios. En la provincia de Napo, existen 3 hospitales con capacidad de realizar transfusiones de componentes sanguíneos los mismos que son abastecidos por el Banco da Sangre Fausto Castello de la Cruz Roja Ecuatoriana Junta Provincial de Napo. Cada unidad de sangre que se remite para transfusión desde el Banco de Sangre es analizada y sometida a todas las pruebas inmunohematológicas de compatibilidad, para tratar de garantizar seguridad transfusional en cada proceso y por tanto evitar el mínimo impacto por transfusión de hemoderivados. (MSP, 2008) (Cruz roja, 2011) 2.2. Principios inmunohematológicos De acuerdo a lo propuesto por John Bernard el término Inmunohematologia se refiere a las reacciones inmunológicas basadas en dos términos frecuentes, antígenos y anticuerpos cada uno es dependiente del otro, que reaccionan a nivel de las membranas celulares y afectan todos los componentes de la sangre. (Bernard, 2005) La Inmunohematologia, junto con la medicina transfusional, es una rama de la patología clínica que entre otras materias se ocupa de transfusión de sangre, de sus componentes y de sus derivados, investigaciones y una serie de exámenes han ayudado en el estudio de la patogénesis, diagnóstico, prevención y tratamiento de la inmunización (sensibilización) (Bernard, 2005) Las características de los antígenos y anticuerpos eritrocitarios es la base de las pruebas de compatibilidad del laboratorio de transfusión para minimizar el 10

21 riesgo de reacciones hemolíticas postransfusionales. Los glóbulos rojos portan en su superficie celular numerosas estructuras que pueden ser reconocidas como antígenos por el sistema inmune de sujetos que carezcan de tales estructuras. (Beutler E, 2007) Antígeno Se denominan así a toda sustancia propia o extraña, que introducida en el organismo es capaz de provocar una reacción inmunitaria. La cual se conoce también como inmunógeno o capacidad de estimular la producción de anticuerpos estas características de los antígenos vienen determinadas por el tamaño, forma, rigidez del antígeno, por el número y localización de los determinantes antigénicos o epítopos en la membrana eritrocitaria (figura 1), que varía según la naturaleza del antígeno y puede reaccionar in vitro o in vivo con el anticuerpo específico. In vitro la reacción antígeno-anticuerpo dependerá de ciertas condiciones, tales como temperatura, ph, fuerza iónica del medio de reacción, proporción entre anticuerpos y antígenos, tiempo de incubación. Existen varios métodos in vitro para visualizar las reacciones antígeno-anticuerpo, los más utilizados en Banco de Sangre son aglutinación y hemólisis. (Lluís & Lluís, 2002) (Beutler E, 2007) 11

22 Figura 1. Esquema de Antígeno Fuente: La reacción inmune es siempre específica frente al antígeno que la desencadena y puede ser de dos tipos: (Lluís & Lluís, 2002) 1. La inmunidad tipo humoral comprende la producción de inmunoglobulinas (anticuerpos), por los linfocitos B, que se unen específicamente al antígeno correspondiente, como respuesta a estímulos antigénicos específicos, los linfocitos T, ayudan en este proceso. 2. La inmunidad celular comprende la interacción directa de los linfocitos T, actúa como mecanismo de ataque en contra de los microorganismos intracelulares, como virus y algunas bacterias, capaces de sobrevivir y proliferar en el interior de los fagocitos y otras células del huésped, lugar al que no tienen acceso los anticuerpos circulantes (Lluís & Lluís, 2002). Ambos mecanismos son capaces de eliminar las células portadoras de antígenos específicos. 12

23 Capacidad antigénica La composición, complejidad química y el tamaño molecular de un antígeno determinan muchas de sus propiedades físicas y biológicas, incluyendo la inmunogenicidad. Un antígeno habitualmente tiene un peso molecular mayor a daltons, a mayor tamaño, mayor inmunogenicidad. Sustancias de unos dalton (Da) suelen ser buenos inmunógenos, mientras que las de menos de daltons son malos inmunógenos, algunas moléculas pequeñas, pueden unirse específicamente a los anticuerpos pero no activan a las células B o T, sin embargo, moléculas con bajo peso molecular, por lo general inferior a daltons, llamadas haptenos son incapaces de estimular de manera directa una respuesta inmune específica, pero pueden adquirir propiedades inmunogénicas cuando se unen a otras moléculas llamadas transportadoras, que permiten activar los distintos mecanismos inductores de la respuesta inmune. Las células extrañas al organismo o los gérmenes como las bacterias, hongos, virus y parásitos tienen gran potencial inmunogénico. (Resino, 2012) (Vega, 2009) (Rugeles López, Patiño, & Montoya, 2009) Clasificación por la naturaleza química de los antígenos Proteínas. Los antígenos en su mayoría son de naturaleza proteica estas pueden ser proteínas puras o bien de composición mixta glicoproteínas o lipoproteínas. En general las proteínas son muy buenos inmunógenos cuanto mayor es la complejidad más fuerte es la respuesta. 13

24 Polisacáridos. Polisacáridos puros y lipopolisacáridos son buenos inmunógenos. El ejemplo clásico de antigenicidad de los polisacáridos es la respuesta a los antígenos sanguíneos del sistema ABO, que son polisacáridos de la superficie de los glóbulos rojos. Ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos son generalmente inmunógenos débiles. Sin embargo pueden llegar a ser inmunogénicos cuando se encuentran formando una sola cadena o cuando se encuentran acoplados a proteínas y polisacáridos. Lípidos. En general los lípidos no son inmunogénicos pero pueden comportarse como haptenos. (Hunt, 2009) (Rojas M, 2012) Clasificación por el origen de los antígenos Naturales. Corresponden al material nativo en la forma en la que existe en la naturaleza como parte de los microorganismos, proteínas, suero de la leche, células y granos de polen Artifíciales. Es aquel material que se modifica por unión de diversos grupos químicos por tratamientos con enzimas, ácidos, álcalis o aldehídos, o físicamente por calentamiento o congelación Sintéticos. Es aquel fabricado en el laboratorio por síntesis química a partir de sus componentes elementales y suelen aplicarse en el diseño de vacunas. (Salinas, 2010) 14

25 Antígenos de los eritrocitos La membrana del glóbulo rojo presenta varias moléculas antigénicas que permiten su clasificación en distintos grupos y subgrupos, los antígenos de los eritrocitos son abundantes y diferentes, la estructura química de los antígenos ha sido utilizado para clasificarlos en diferentes sistemas: ABO, Rh, Lewis, Kid, Duffy, Kell, MNS y otros más (Salinas, 2010). Por otra parte la producción de anticuerpos contra estos antígenos ocasionan reacciones transfusionales cuando la sangre es incompatible. (Rojas M, 2012) Los antígenos son glúcidos unidos a proteínas y lípidos de la superficie celular que sintetizan enzimas glucosiltransferasa polimórficas, cuya actividad varía en función del alelo heredado. Los antígenos de los grupos sanguíneos ABO varían grandemente en su capacidad de provocar una respuesta inmune. Los antígenos A, B, y D son ciertamente los más inmunógenos. Aproximadamente del 50% al 75% de los individuos D- negativos pueden producir anti-d si son transfundidos sólo con una unidad de sangre D-positivo. (Abbas, Lickman, & Shiv, 2012) Después del antígeno D otros antígenos incluidos dentro del sistema Rh, como el C, c, E, y e, son clasificados como bastante inmunogénicos basándose en la frecuencia con que sus correspondientes anticuerpos son encontrados. (Bernard, 2005) 15

26 Anticuerpos Son las proteínas plasmáticas más abundantes en el suero después de la albumina, que se han formado en el organismo por las células plasmáticas y los linfocitos B como respuesta a la entrada de un antígeno. Los anticuerpos son proteínas que se encuentran en la circulación sanguínea y en las secreciones bilógicas. Pertenecen al grupo de las globulinas y desde el punto de vista electroforético se hallan situadas en la región de las gammaglobulinas. (Abbas, Lickman, & Shiv, 2012) (Salinas, 2010). Debido a su relación directa con la inmunidad se conocen con el nombre de inmunoglobulinas. (Lluís & Lluís, 2002) La molécula de anticuerpo tiene dos funciones: una es unirse de manera específica a moléculas del agente patógeno que desencadenaron la respuesta inmunitaria; la otra es reclutar otras células y moléculas para destruir dicho agente una vez que el anticuerpo está unido a él. (Murphy, Traves, & Walport, 2009) Estructura básica de los anticuerpos El conocimiento de la estructura química de los anticuerpos nos permite entender sus funciones biológicas. Los anticuerpos son proteínas glucosiladas constituidas por cadenas polipeptídicas que representan del 82 al 96% del total de la molécula y por carbohidratos que constituyen un 4 a 18% de la estructura. Hay características comunes entre todas las inmunoglobulinas, y específicas o propias de cada clase (Salinas, 2010). La característica general más importante y común se basa en dos tipos de 16

27 cadenas polipeptídicas; dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), debido a su diferente peso molecular, unidas entre sí mediante enlaces, covalentes y puentes de disulfuro, las cuatro cadenas originan entre sí una estructura en forma de Y, llamándose región bisagra a la zona que conecta los tres brazos de la Y, lo que permite movimiento independiente de los dos brazos, como se aprecia en la Figura 2. (McKenzie, 2000) (Majluf & Pérez, 2006) Figura 2. Estructura del anticuerpo Fuente: sistema inmunológico, importancia y principales enfermedades Las inmunoglobulinas pueden ser fraccionadas mediante la utilización de enzimas proteolíticas. Al tratar esta región con papaína, rompe en el extremo N-terminal de los disulfuros que se hallan entre las cadenas pesadas que las 17

28 une entre sí y los puentes que unen a las cadenas ligeras obteniéndose tres fragmentos de tamaño más o menos similar. (Parslow, Stites, Terr, & Imboden, 2001) Dos de ellos son idénticos, cada uno consta de una cadena ligera y la porción amínoterminal (N-terminal) de una cadena pesada, y contienen la capacidad de combinarse con el antígeno éstos reciben el nombre de fragmentos Fab, sigla que significa fragmento de unión a antígenos (fragmentantigenbinding). El tercero fragmento no contiene actividad de unión a antígenos, pero al inicio se observó que se cristaliza con facilidad por tal razón se le nombró fragmento Fc, que significa fragmento cristalizable, está constituido por las porciones carboxiterminales de las cadenas pesadas. (Murphy, Traves, & Walport, 2009) Todas las moléculas de anticuerpos comparten las mismas características estructurales básicas, pero muestran una variedad acentuada en las regiones que se unen a los antígenos y, así, se conoce como la región variable V. La variabilidad de las moléculas de anticuerpos permite que cada anticuerpo se una a un antígeno específico diferente, (Murphy, Traves, & Walport, 2009) el resto de la cadena está formada por dominios muy parecidos en la mayoría de las inmunoglobulinas que recibe el nombre de regiones constante C. Las cadenas ligeras pueden ser o kappa o lambda, están formadas por 220 aminoácidos que dan un peso molecular aproximado de dalton, de los cuales la mitad forma la región variable (VL) y la otra mitad la región constante (CL). (Bernard, 2005) Dos de las características principales de los anticuerpos que deben considerarse son el tamaño y el número de sitios de combinación con el antígeno, el sitio del contacto físico del anticuerpo con el determinante antigénico o epítopo, se denomina parátopo. (Montgomery, 1989) 18

29 Clasificación de las inmunoglobulinas En los seres humanos existen cinco clases o isotipos diferentes de anticuerpos que se conocen como inmunoglobulinas, inmunoglobulina G (IgG), inmunoglobulina M (IgM), inmunoglobulina A (IgA), inmunoglobulina D (IgD) e inmunoglobulina E (IgE), la forma abreviada de estos anticuerpos es universal. Las diferencias entre los isotipos radican en su cadena pesada y el número de sus monómeros que es característica de cada uno de ellos, que difieren en sus propiedades biológicas, localizaciones funcionales y capacidad para reconocer diferentes tipos de antígenos, se denominan con una letra del alfabeto griego. Así, la cadena pesada de la IgG se llama gamma, la cadena pesada de la IgM se llama mu, la cadena pesada de la IgA se llama alfa, la cadena pesada de la IgD se llama delta, la cadena pesada de la IgE se llama épsilon. En los seres humanos, los isotipos IgA, IgG pueden subdividirse, a su vez, en subclases, llamadas IgA1 IgA2 e IgG1 IgG2 IgG3 IgG4. (Salinas, 2010) La estructura básica de las dos cadena livianas unidas a dos cadenas pesadas, que a la vez se unen entre sí forman un monómero que es la forma de representación más común de la inmunoglobulina G, D y E. La IgM suele presentarse predominantemente como pentamérica. La IgA puede circular en el plasma en forma monomérica, pero en las mucosas es secretada como un dímero (Figura 3). (Rojas M, 2012) 19

30 Figura 3. Representación esquemática de las inmunoglobulinas Fuente: Instituto De Inmunología Facultad De Ciencias Médicas - UNR Las clases G y M son las más importantes en reacciones transfusionales. Los anticuerpos IgG por su bajo peso molecular de daltons atraviesan la placenta con facilidad y destruyen los eritrocitos fetales que poseen los antígenos, causando la enfermedad hemolítica del feto y del recién nacido. Los anticuerpos IgM son mucho más grandes tienen un peso molecular de daltons no atraviesan la placenta. Aglutinan los glóbulos rojos suspendidos en solución salina. Durante las reacciones antígeno-anticuerpo activan el complemento, causando hemólisis de los eritrocitos, más que aglutinación. (Majluf & Pérez, 2006) (Abbas, Lickman, & Shiv, 2012) (Parslow, Stites, Terr, & Imboden, 2001) 20

31 Determinantes antigénicos de las inmunoglobulinas Isotipos. Son variaciones en las regiones constantes de las cadenas pesadas y ligeras y que están presentes en todos los individuos sanos de la especie. El isotipo de la cadena pesada establece las propiedades funcionales del anticuerpo. (McKenzie, 2000) (Murphy, Traves, & Walport, 2009) Alotipo. Se entiende por alotipo las pequeñas diferencias en la secuencia de aminoácidos, llamadas determinantes alotípicos, que ocurren en algunos miembros de una misma especie, la suma de los determinantes alotípicos individuales que muestra un anticuerpo establece su alotipo. (Goldsby, Kindt, Barbara, & Kuby, 2004) Idiotipos. El término idiotipo significa tipo propio y se refiere a las secuencias de aminoácidos en la región variable de las moléculas homogéneas de las inmunoglobulinas, cuando los anticuerpos tienen una estructura exclusiva en sus regiones variables, se dice que tiene un idiotipo privado, pero a veces distintos anticuerpos pueden compartir una misma estructura a nivel de sus regiones variables, se habla entonces de idiotipos públicos o de regiones cruzadas. (Parslow, Stites, Terr, & Imboden, 2001) Tipos de anticuerpos Los anticuerpos que definen los antígenos de los grupos sanguíneos se dividen en: autoanticuerpos cuando están dirigidos contra antígenos presentes en los hematíes del propio sujeto, y aloanticuerpos cuando reaccionan con aloantígenos presentes en los hematíes, leucocitos y 21

32 plaquetas de otros sujetos. Estos anticuerpos a su vez, se pueden clasificar según el modo de sensibilización en naturales, es decir, los estímulos antigénicos son desconocidos o inmunes resultado de inmunización por transfusión o inducidos por eritrocitos fetales durante el embarazo o en el momento del parto. (Beutler E, 2007) (Rodríguez, 2004) Reacción antígeno- anticuerpo Los antígenos de los hematíes son estructuras químicas que proporcionan propiedades específicas a su superficie y que solo pueden detectarse con anticuerpos que corresponden a esos antígenos, la mayoría de estas reacciones antígeno-anticuerpo implican la aglutinación o hemólisis de los hematíes. (Escobar, 2012) La aglutinación de los glóbulos rojos, por el anticuerpo depende de la capacidad física de la molécula de inmunoglobulina para cubrir la distancia que separa los glóbulos rojos y formar un enlace tridimensional, la declinación se presentará solamente si la molécula es suficientemente larga para cubrir esta distancia, tres factores intervienen en el fenómeno de aglutinación: Tamaño molecular del anticuerpo. Posición y número de los antígenos celulares. Fuerza y repulsión entre los eritrocitos o potencial zeta. (McKenzie, 2000) Las reacciones antígeno-anticuerpo presentan aspectos diferentes en función de la naturaleza tanto del antígeno como del anticuerpo. En Inmunohematología, los antígenos se hallan generalmente fijados a las 22

33 células sanguíneas circulantes (eritrocitos, leucocitos, plaquetas) o a las proteínas plasmáticas. (Bernard, 2005) Las reacciones antígeno-anticuerpo pueden desarrollarse in vitro o in vivo. La fijación in vivo del anticuerpo a los antígenos eritrocitarios generalmente ocurre con la invasión al organismo, de agentes extraños, los que reacciona produciendo anticuerpos, en estados de autoinmunidad, la reacción in vivo antígeno-anticuerpos puede causar enfermedades tales como anemia hemolítica autoinmune, purpura trombocitopénica Idiopática, etc. Los métodos in vitro permiten en primer lugar identificar si hay o no anticuerpos y en segundo, lugar cuantificarlo. (Rojas M, 2012). La naturaleza de estas reacciones, depende de una magnitud de variables, relacionadas con el antígeno y con el anticuerpo. La mayoría de estas reacciones antígeno-anticuerpos, suceden en dos etapas: la primera es donde el antígeno se combina con el anticuerpo y la segunda, mediante ciertos cambios electroquímicos, se produce un complejo antígeno-anticuerpo, haciéndole visible la reacción en un tubo o en una lámina de vidrio en el que se forma puentes o uniones entre eritrocitos sensibilizados. (Parslow, Stites, Terr, & Imboden, 2001). (Rodríguez, 2004) La aglutinación de eritrocitos se conoce con el nombre de hemaglutinación, en uso para la tipificación del grupo sanguíneo para la transfusión de sangre humana, es decir identificar la compatibilidad del sistema ABO entre donador y el receptor y efectuar pruebas de compatibilidad cruzadas que pueden detectar anticuerpos en potencia perjudiciales contra otros grupos sanguíneos. (Murphy, Traves, & Walport, 2009). Para esto se utiliza reactivos biológicos que contienen anticuerpos IgM poli o monoclonales que reaccionan con los eritrocitos humanos. La hemaglutinación ocurre cuando en los eritrocitos están presentes los antígenos que son reconocidos por los anticuerpos del reactivo. 23

34 La hemaglutinación también resulta útil para la tipificación del sistema Rh, sólo que en este caso el reactivo contiene anticuerpos IgG. La capacidad aglutinante de los anticuerpos IgG es menor que de los anticuerpos IgM, sin embargo la aglutinación de los eritrocitos con anticuerpos del isotipo IgG se aumenta con el uso de un segundo anticuerpo, también IgG dirigido contra el primer anticuerpo, como es el caso del reactivo de Coombs para demostrar autoanticuerpos contra eritrocitos en el diagnóstico de anemia hemolítica. (Salinas, 2010) Anticuerpos Monoclonales. Los reactivos de tipificación monoclonales son una poderosa herramienta y están siendo usados cada vez con mayor insistencia para la fenotipificación antigénica de los glóbulos rojos en lugar de los reactivos policlonales. Los anticuerpos monoclonales son producidos por hibridomas linfocitarios que se producen por la fusión de células productoras de anticuerpos (linfocitos B) de animales inmunizados y células neoplásicas de mieloma. Los anticuerpos monoclonales humanos con especificidad para antígenos de grupo sanguíneo también han sido sintetizados por transformación de linfocitos B humanos con virus de Epstein Barr en células linfoblastoideas que pueden crecer en cultivo y secretar anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales difieren de los anticuerpos convencionales en tres características: 1) Especificidad: reaccionan con un único determinante antigénico en lugar de hacerlo con múltiples de ellos. 2) Pureza: todo, no solamente una fracción del contenido proteico sérico es inmunoglobulina. 3) Reproductibilidad: se espera la misma especificidad y afinidad para cada subcultivo proveniente de un único clon. Cuando se están usando 24

35 anticuerpos monoclonales para tipificación eritrocitaria, sin embargo, debemos familiarizarnos con sus características. Los anticuerpos monoclonales del anti-d, anti-c, anti-e, anti-c, son derivados de humanos no así los anticuerpos monoclonales para la tipificación ABO son derivados de animales murinos. (Henry, 2007) (García 2011) Reacciones adversas a la transfusión. La transfusión sanguínea es cada vez más segura y eficaz, aun así ocurren reacciones adversas, (Parslow, Stites, Terr, & Imboden, 2001). En la transfusión clínica, la elección de los donantes de sangre para un receptor particular se basa en la expresión de antígenos del grupo sanguíneo y de las respuestas de anticuerpos frente a ellos. (Abbas, Lickman, & Shiv, 2012) El término reacción transfusional lleva inherente un alto riesgo de complicaciones se refiere a la introducción de un tejido extraño dando una respuesta anormal del receptor a la administración de cualquiera de los componentes celulares o no celulares. (Zamudio-Godínez, 2003) La transfusión sanguínea se realiza más a menudo para reponer la sangre pérdida por hemorragia o para corregir defectos causados por una producción inadecuada de células sanguíneas. La principal barrera para el éxito de la transfusión es la respuesta inmunitaria a las moléculas de la superficie celular que difieren entre donante y receptor lo que obliga a considerar en cada indicación los riesgos/beneficios de nuestra actuación. (Abbas, Lickman, & Shiv, 2012) Por la intensidad de la reacción puede ser leve o intensa, por el tiempo de aparición de estas reacciones se clasifican en inmediatas (durante la 25

36 transfusión o hasta máximo 24 horas después) y tardías, todas las reacciones posteriores a las 24 horas. El cuadro 1 detalla una lista de reacciones transfusionales. (MSP, 2008) Cuadro 1: Reacciones Transfusionales REACCIONES INMEDIATAS INMUNES Hemolíticas agudas Incompatibilidad ABO Otros grupos NO HEMOLITICAS Reacción anafiláctica Edema pulmonar no cardiogénico (TRALI) Reacción febril no hemolítica Reacción alérgica urticariante NO INMUNES Contaminación bacteriana Sobre carga circulatoria REACCIONES TARDIAS INMUNES Hemolíticas tardías Púrpura postransfusional Enfermedad injerto-huésped NO INMUNES Infecciones de transmisión por transfusión VIH Hepatitis C Hepatitis B Enfermedad de Chagas Paludismo Sífilis Físicas: congelación calentamiento, catéter pequeño calibre Químicas: medicamentos, lactatos, dextrosas en vía de transfusión Fuente: Manual Sobre Criterios Técnicos para el uso Clínico de Sangre y Hemocomponentes MSP 26

37 Reacciones de tipo inmunológico Los eritrocitos portan en su membrana celular numerosas estructuras que pueden ser reconocidos como antígenos por el sistema inmune de sujetos que carezcan de tales estructuras. (Rojas M, 2012). Estas reacciones son provocadas por la interacción in vivo de un antígeno con su correspondiente anticuerpo. (Majluf & Pérez, 2006) La caracterización de los antígenos y anticuerpos eritrocitarios es la base de las pruebas de compatibilidad del laboratorio de transfusión y con ello se minimiza el riesgo de reacciones hemolíticas postransfusionales. Los anticuerpos transferidos con el plasma de un donador pueden originar hemólisis al combinarse con los eritrocitos del paciente o con los de otro donador (Majluf & Pérez, 2006), esto además proporciona una base para comprender la enfermedad hemolítica del recién nacido y las anemias hemolíticas autoinmunes. (Rojas M, 2012). Por lo general, el anticuerpo está en el plasma del receptor y el antígeno en los eritrocitos del donador. (Majluf & Pérez, 2006) Reacción hemolítica retardada Por lo general las reacciones transfusionales hemolíticas retardadas se presentan en personas que recibieron transfusiones repetidas de sangre ABO compatible que es incompatible con respecto a otros antígenos de grupos sanguíneos. Estas reacciones se desarrollan dos a seis días después de la transfusión. La reacción es carácter extravascular, que rara vez 27

38 compromete la vida del paciente, o precisa tratamiento de soporte. (Goldsby, Kindt, Barbara, & Kuby, 2004) Ensayos inmunohematológicos El término Inmunohematología se refiere a las reacciones inmunológicas de los antígenos y anticuerpos que reaccionan a nivel de las membranas celulares y que afectan todos los componentes de la sangre. Para seleccionar la sangre de donadores que estén libres de antígenos eritrocitarios específicos, se utiliza técnicas comerciales con anticuerpos monoclonales que contienen anticuerpos eritrocitarios conocidos para probar que la sangre del donador está libre del antígeno, para confirmar la ausencia de una reacción antígeno-anticuerpo, el suero del receptor se prueba en contra de las células sanguíneas del donador. (Parslow, Stites, Terr, & Imboden, 2001) (BIO-RAD, 2012) Sistema de grupo sanguíneo Cada individuo posee determinados antígenos que le son transmitidos genéticamente según las leyes Mendelianas con un gen autosómico dominante. Los llamados grupos sanguíneos un conjunto de sustancias de naturaleza proteica compleja que se encuentra, fundamentalmente, en la membrana de las células hemáticas. Los antígenos del sistema ABO se detectan sobre los eritrocitos entre la quinta y sexta semana del embrión y no se desarrollan completamente hasta después del nacimiento. Entre los 2 y 4 años de edad están completamente desarrollados y permanecen estables y constantes durante toda la vida. (Arbeláez, 2009) Tienen carácter antigénico y, por tanto, existen también unos anticuerpos capaces de reaccionar con ellos, son caracteres alotipicas ya que son propios de un grupo de individuos dentro de una especie. (Lluís & Lluís, 2002) (Arbeláez, 2009) 28

39 Se conocen 600 antígenos de eritrocitos de los cuales 207 pertenecen a los 30 sistemas de grupos sanguíneos reconocidos. Cada antígeno se controla por un gen, los determinantes antigénicos de un grupo sanguíneo se producen de manera directa (para proteínas) e indirecta (para carbohidratos). La determinación del grupo sanguíneo es una práctica habitual e imprescindible para la transfusión de componentes hemáticos, se detecta un antígeno específico en la superficie del eritrocito, haciendo reaccionar eritrocitos con un suero en el cual se conoce la presencia de anticuerpos reactivos con ese antígeno, estas pruebas definen el fenotipo. (Parslow, Stites, Terr, & Imboden, 2001) El Sistema Rh Cuando se descubrió el sistema ABO se pensó que las dificultades que planteaban las transfusiones de sangre podrían superarse y que el procedimiento sería más seguro y sencillo. No obstante, no fue así. Aunque en general no surgían problemas, algunos pacientes que recibían sangre ABO compatible experimentaban reacciones transfusionales. Tampoco era inusual que una madre tuviera un hijo ABO compatible con signos obvios de anemia. Se creía que este cuadro se debía a anticuerpos presentes en el suero materno, que cruzaban la placenta y destruían los glóbulos rojos fetales, provocando enfermedad hemolítica del recién nacido. Pueden también ocasionar reacciones hemolíticas por transfusión. (Parslow, Stites, Terr, & Imboden, 2001) (Dueñas, 2003) La importancia del sistema Rhesus radica probablemente en que es el sistema antigénico eritrocitario mas complejo y de mayor polimorfismo, en los humanos está constituido aproximadamente por unos 50 antígenos distintos, 29

40 cinco de los cuales revisten una importancia especial (D, C o c, E o e). (Bernard, 2005). Investigaciones recientes han aclarado la base genética de los antígenos Rh primarios (D, C o c, E o e), se encuentran situado en el brazo corto del cromosoma 1, consiste en dos genes homólogos estructurales adyacentes designados como RHD y RHCE el primero codifica la proteína portadora del antígeno D (RhD positivos), mientras que en el segundo esta ausente, en el genoma son individuos RhD negativos. (Parslow, Stites, Terr, & Imboden, 2001). (Abbas, Lickman, & Shiv, 2012) El antígeno D, a diferencia de los antígenos del sistema ABO, solamente está presente en los eritrocitos y no en otras células ni en las secreciones. El número de moléculas de antígenos D que están presentes en la superficie de los eritrocitos de las personas Rh positivas es variables en comparación con el número de moléculas del antígeno A en personas A positivas del subgrupo A1, que es superior al medio millón. A pesar de estas diferencias cuantitativas, resulta claro que el antígeno D es inmunogénico y capaz de inducir una fuerte respuesta de anticuerpos del isotipo IgG como para ocasionar anemia hemolítica fetoneonatal, reacciones hemolíticas transfusionales y en algunas anemias hemolíticas autoinmunes. (Salinas, 2010) Teorías y Nomenclaturas Sistema Rh Se pueden usar varias nomenclaturas para describir los genes y antígenos del sistema Rh. 30

41 La teoría de Fisher Race: se basa en la suposición de tres pares de genes (Cc, Dd, Ee), estrechamente unidos, responsables de los antígenos D, C o c, E o e, que se expresan por la terminología de tres letras C, D, E, para referirse a tres locus del cromosoma y las letras d, c y e para sus alelos. Las combinaciones de los antígenos son múltiples la que presentan los hijos dependen de las de sus padres, el haplotipo más heredado es CDe y cde, para sujetos con Rh positivo y negativo respectivamente. (Parslow, Stites, Terr, & Imboden, 2001) En base a los cinco antígenos (D, C, c, E, e) del sistema Rh, existen ocho posibles combinaciones de antígenos comunes o haplotipos, dependiendo de los genes que contenga los cromosomas. (Beutler E, 2007) (Cuadro 2). Cuadro 2: fenotipos Fisher- Rice Fisher- Rice Fenotipos Rh positivo Rh negativo Genes DCE Dce DcE DCe dce dce dce dce Fuente: ecaths1.s3.amazonaws.com/.../