Enzygnost* Anti-HBc monoclonal

Transcripción

1 Enzygnost* Anti-HBc monoclonal Enzyme Immunoassay for qualitative Determination of Antibodies to Hepatitis B (core)-antigen in serum and plasma Enzymimmunoassay zum qualitativen Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis B (core)-antigen in Serum oder Plasma Test immunoenzymatique pour la détection qualitative des anticorps anti-antigène de (core) de l hépatite B dans le sérum ou le plasma Metodo immunoenzimatico per la determinazione qualitativa degli anticorpi contro l antigene dell epatite B («core») nel siero e nel plasma Prueba inmunoenzimática para la determinación cualitativo de los anticuerpos contra el antígeno de la hepatitis B (core) en el suero o en el plasma Teste imunoenzimático para determinação qualitativa de anticorpos contra o antigénio da hepatite B (core) no soro ou no plasma English: Page 2 to 10 Deutsch: Seite 11 bis 18 Français: Pages 19 à 26 Italiano: Pagina 27 fino 34 Español: Pagina 35 hasta 42 Português: Página 43 a 50 Summary of Test Procedure Page 10 Kurzanleitung Testdurchführung Seite 18 La technique en bref Page 26 Istruzioni in breve, esecuzione del test Pagina 34 Resumen de la técnica: Página 42 Resumo da técnica Página 50 Bibliography/Literatur/Littérature/ Bibliografia/Bibliografía/Bibliografia Page/Seite/Pagina/Página 51 OUWE G13 C0541 (879) CS/R 1 Edition February 2004

2 Enzygnost* Anti-HBc monoclonal Intended Use Enzyme Immunoassay for qualitative determination of Antibodies to Hepatitis B (core)-antigen The enzyme immunoassay is processed using the BEP II, BEP III and BEP 2000 ELISA processors. The test was developed for testing individual samples, not for pooled samples. The product is for in vitro diagnostic use only. Summary and Explanation Antibodies to hepatitis B (core) antigen (anti-hbc) are the first antibodies to appear in an acute hepatitis B infection. They occur shortly after the antigens HBsAg and HBeAg 1, and often persist for life 5. Consequently, the determination of anti-hbc in the serum can be utilized for monitoring the course of a hepatitis B infection 2. Furthermore, anti-hbc can serve as a marker for the differential diagnosis of hepatitis A, hepatitis B, and non-a/non-b hepatitis. When the anti-hbc assay is used for screening purposes, a positive finding will indicate past contact with the hepatitis B virus even in cases of sera negative for HBsAg and anti-hbs. Approximately 10% of all infections can be detected only by the serological determination of anti-hbc 3. Prior to the administration of hepatitis B vaccine, the anti-hbc test yields information on the immune status of the person to be vaccinated 4. In epidemiological studies the antibody to HBc antigen is a valuable parameter as it can be detected over a longer period of time than the antibody to HBs antigen 5. Principle of the Method Enzygnost* Anti-HBc monoclonal is competitive one-step enzyme immunoassay for the in vitro determination of antibodies to HBcAg in serum or plasma. The anti-hbc contained in the sample and the Anti-HBc/POD Conjugate compete for binding to the HBcAg coated onto the wells of the microtitration plate. Unbound reactants are washed out and the enzyme activity of the peroxidase is then determined. The enzymatic conversion of hydrogen peroxide and chromogen is terminated by the addition of dilute sulphuric acid. Due to the competitive principle of the test, the colour intensity is inversely proportional to the concentration of anti-hbc in the sample. Reagents Materials provided Enzygnost* Anti-HBc monoclonal 2 x 96 Enzygnost* Anti-HBc 2 test plates Anti-HBc/POD Conjugate monoclonal 2 x 1.2 ml Conjugate Buffer (anti-hbc monoclonal) 4 x 12.5 ml Anti-HBc Control Serum, negative 2 x 0.7 ml Anti-HBc Control Serum, positive 2 x 0.5 ml Washing Solution POD** 1 x 100 ml Buffer/Substrate TMB** 1 x 30 ml Chromogen TMB** 1 x 3 ml Stopping Solution POD** 1 x 100 ml Empty bottle for Working Chromogen Solution 1 pcs. Adhesive foils 6 pcs. PE bag 1 pcs. Barcode table 1 pcs. Instructions for use 1 pcs. Further packs: 100 x 96 ** These components are also included in the Supplementary Reagents for Enzygnost* TMB kit (code no. OUVP). OUWE G13 C0541 (879) CS/R 2 Edition February 2004

3 Composition Enzygnost* Anti-HBc monoclonal (test plate): Microtitration plate coated with genetically engineered hepatitis B core antigen. Anti-HBc/POD Conjugate monoclonal: Monoclonal anti-hbc, peroxidase (POD)-conjugated. Preservative: phenol (max. 1 g/l) Conjugate Buffer (anti-hbc monoclonal) Tris Buffer containing Boviserin and Tween 20. Preservative: phenol (max. 1 g/l) Anti-HBc Control Serum, negative: Human serum, stabilised, nominal absorbance: 0.7 A Preservatives: amphotericin (approx. 5 mg/l), gentamicin (approx. 100 mg/l) Anti-HBc Control Serum, positive: Human serum, stabilised, nominal absorbance: 0.1 A Preservatives: amphotericin (approx. 5 mg/l), gentamicin (approx. 100 mg/l) Washing Solution POD (concentrate): Phosphate buffer solution containing Tween. Preservative: phenol (max. 1 g/l) Buffer/Substrate TMB: Hydrogen peroxide (approx. 0.1 g/l) in acetate buffer solution Preservative: n-butanol (approx. 1%) Chromogen TMB: Tetramethylbenzidine dihydrochloride Stopping Solution POD: 0.5 N sulphuric acid Warnings and Precautions 1. For In vitro diagnostic use. 2. Each individual blood donation for use in manufacture of the control sera is tested for HBsAg, anti-hcv, anti-hiv1 and anti-hiv2. Only donations with negative findings are used for manufacture. Nevertheless, since absence of infectious agents cannot be proven, all materials obtained from human blood should always be handled with due care, observing the precautions recommended for biohazardous material It is advisable to wear protective gloves throughout the entire test procedure. 4. For disposal, it is recommended that solid infectious materials should be autoclaved for at least one hour at +121 C. All aspirated liquids should be collected in two receptacles connected in series, which should both contain a disinfectant suitable for inactivating pathogenic human viruses. The concentrations and times specified by the manufacturer must be observed. Preparation of thereagents Bring all the reagents and samples to +18 to +25 C before beginning the test (without removing the test plate from its container). For each test plate, dilute 20 ml of Washing Solution POD to 400 ml with distilled or deionized water. Working Chromogen Solution: For each test plate, dilute 1 ml of Chromogen TMB with 10 ml of Buffer/Substrate TMB in the empty plastic bottle supplied with the kit (= Working Chromogen Solution) and store closed and protected from light. Rinse the bottle thoroughly with distilled water after use. For technical reasons (overfill) it is not permissible to pour together the full contents of the Chromogen TMB vial and of the Buffer/Substrate TMB vial. Working Conjugate Solution: For each test plate add 0.5 ml of Anti-HBc/POD Conjugate to an original vial (12.5 ml) of Conjugate Buffer (Anti-HBc monoclonal) (1+25). Shake gently to mix, avoiding the formation of foam. Storage and Stability Stored unopened at +2 to +8 C, all components of the Enzygnost* Anti-HBc monoclonal combination pack remain stable up to the dates of expiry given on the labels. For complete stability and storage data see Table 1 in the Appendix. OUWE G13 C0541 (879) CS/R 3

4 Equipment required: BEP II: For automatic dispensing of reagent and washing BEP III: For automatic processing of the test after dispensing the samples as well as for evaluation BEP 2000: For fully automatic processing and evaluation of the test Pipettes: piston-type pipettes: 25, 100 and 1000 µl Incubator: Covered water bath (+37 ± 1 C) or comparable incubation methods All the equipment used in the test must have been validated. Specimens Suitable specimens are individual samples (human sera or EDTA/ heparinized/citrated plasma) obtained by standard laboratory techniques. The samples should be stored for not more 3 days at C. If the samples are to be stored for a longer period of time, they must be frozen. Procedure Procedure using the BEP II 1. Assay scheme: Ascertain the number of wells required (= number of samples to be tested plus 6 wells for controls). Strips not required for the test should be removed from the holder and stored for later use (See Table 1 for stability data). 2. Dispense samples: Pipette 25 µl/well of negative Control, into 4 wells, 25 µl of positive control into the next well and then fill the following wells with 25 µl/well of undiluted sample. At the end of the series / plate pipette 25 µl of positive control once more and proceed to 3. Dispense conjugate as soon as possible, max. 15 min after completion of the sample dispensing step. As an alternative to the above pipetting scheme, it is also possible to pipette the positive control twice at the start of the series. Pipetting scheme: Pipette 25 µl/well of the negative control into 4 wells, 25 µl/well of the positive control into 2 wells, and fill the subsequent wells with 25 µl/well of undiluted sample. 3. Dispense conjugate: Pipette 100 µl of the Working Conjugate Solution into each well, seal with fresh foil and immediately place into the incubator. 4. Incubate: Incubate at +37 C ± 1 C for 60 ± 5 min., then proceed immediately to the wash step. 5. Wash: Remove the foil, aspirate all the wells and wash 4 times with approx. 0.3 ml/well of Washing Solution POD. 6. Add substrate: Pipette 100 µl of Working Chromogen Solution into each well and seal the plate with fresh foil. 7. Incubate: Incubate protected from light at +18 to +25 C for 30 ± 2 min. 8. Stop reaction: Remove foil, and add 100 µl of Stopping Solution POD to each well, keeping to the same timing as in 6. Add substrate. 9. Read: Read at 450 nm within one hour. The use of a photometer with two wavelengths (measurement and reference beams) is recommended. The absorbances of the control and patient samples are to be measured at a wavelength of 450 nm. The wavelength recommended for the reference reading is 650 nm (if necessary between 615 nm and 690 nm). OUWE G13 C0541 (879) CS/R 4

5 Test procedure using the BEP III Before using the BEP III, prepare the test plates and sample dispensing steps (Section 1 and 2 at "Test procedure with the BEP II"). Immediately afterwards place the uncovered test plates (i.e. not covered with adhesive foil) into the BEP III. Note that partially filled test plates need to be made up to at least half plates (6 test strips) by adding "water-filled strips". The test is then processed fully automatically (see BEP III instruction manual). The settings for the incubation times in the BEP III software may differ from the times on the BEP II for technical reasons (system speed) but have been validated for Enzygnost* on the BEP III. Test procedure using the BEP 2000 The sample dispensing steps and subsequent processing of the test are performed fully automatically by the analyzer (see BEP 2000 instruction manual). Test validation The individual values of the absorbances for the control sera are used to calculate the mean values if: A neg A pos If one of the absorbance values of the Anti-HBc Control Serum, negative, is outside the specification, this value can be neglected. Both absorbance values of the positive control must comply with the specification. If these conditions are not fulfilled, the test is to be repeated. Evaluation The evaluations are performed automatically if the BEP 2000 or BEP III is used. Please consult the relevant instruction manuals. The following sections apply if the measurements are carried out without using a software. Calculate the mean absorbance value of the negative controls and then calculate the cut-off value by multiplying the mean value by a factor of 0.4: A neg. x 0.4 = cut-off value The equivocal range is defined as: cut-off ± 10% Based on the criteria of the test, the samples are classed as follows: Test result: 1. A sample > cut-off + 10% ^= negative 2. A sample < cut-off 10% ^= positive 3. cut-off - 10% A sample cut-off + 10% ^= equivocal If an equivocal result is obtained the sample is to be retested in dual determination. If, in the retest, both absorbance values are above or below the equivocal range, the initial equivocal result can be ignored and the sample can be classed as negative or positive, respectively. However, if the sample again reacts equivocally in one or both of the determinations of the retest, to obtain final clarification it is recommended that a new sample should be tested which has been collected 2 to 4 weeks after the first sample. Limitations of the Procedure 1. Samples containing sodium azide must not be used! 2. Anticoagulants such as heparin, EDTA and citrate do not affect the test result. 3. No interferences were observed with heat-treated samples (60 min, +56 C). 4. Serum from insufficiently coagulated blood, and cellular blood components, may lead to unreliable results. 5. Samples that are haemolytic or contain rheumatoid factors do not impair the test results. 6. Samples containing antibodies to CMV, and samples which are positive for anti-hbs, do not interfere with the test result. OUWE G13 C0541 (879) CS/R 5

6 7. Samples from patients with circulating immune complexes as well as samples containing anti-mouse IgG were not observed to interfere with the test result. 8. Samples containing antibodies to hepatitis A virus, EBV, HIV, HCV as well as lipaemic and icteric samples may exhibit elevated reactivity. 9. Samples from haemodialysis patients, transplant patients, patients with multiple blood transfusions as well as from patients with raised transaminase values may exhibit elevated reactivity. 10. When using thawed samples, ensure good homogenization of the material prior to use. 11. The pack contains a matched set of reagents. Reagents must not be interchanged with other kits unless the reagents are from an identical lot (i.e. they must display the required 6-digit lot numbers printed on the pack and given in the enclosed barcode table). Washing Solution POD, Stopping Solution POD and Working Chromogen Solution are exceptions to this requirement. Note that the Working Chromogen Solution must first be prepared from matched components (do not use Chromogen TMB and Buffer/Substrat TMB from kits with a different number). 12. Buffer/Substrate TMB, the Working Chromogen Solution and the Stopping Solution POD must not be allowed to come into contact with heavy metal ions or oxidizing substances (do not use pipettes with metal parts in contact with the liquid!). Do not perform the substrate reaction in the proximity of disinfectants containing hypochlorite. If the Working Chromogen Solution has spontaneously developed a blue colour before transferral into the test plate, this indicates that the solution is contaminated; in such cases prepare a fresh solution in a clean container. Skin contact with the above-mentioned solutions is to be avoided. 13. The test plate should be protected from vibration during the incubation phase (e.g. placed on a secured floatation aid, or in a non-circulating water bath); the wells of the plate must be in contact with the thermostated water. If stabilizers are used to prevent microbial contamination of the water, care must be taken that neither the surface of the test plate nor the wells come into contact with these solutions since such contamination can lead to unspecific reactions. 14. With highly reactive samples the dye may precipitate during the stopping reaction. This does not interfere with the photometric evaluation. 15. The control sera have been prepared from native human sera. As a result, turbidity may occur but this has no effect on the test result. 16. Dade Behring has validated use of these reagents on various analyzers to optimize product performance and meet product specifications. User defined modifications are not supported by Dade Behring as they may affect performance of the system and assay results. It is the responsibility of the user to validate modifications to these instructions or use of the reagents on analyzers other than those included in Dade Behring Application Sheets or these instructions for use. 17. Results of this test should always be interpreted in conjunction with the patient s medical history, clinical presentation and other findings. Specific Performance Characteristics Sensitivity and Specificity The results for the sensitivity and specificity study are summarized in Tables 2+3 (in the Appendix). The sensitivity of the test was studied using a total of 1266 anti-hbc positive samples and the results obtained were 96.9 to 100% (initial testing) and 97.5% (retest result). It cannot be ruled out that when the test is used on a large scale some samples may escape detection. The specificity of the test was studied using a total of 6116 anti-hbc negative blood donation samples and the specificity results obtained were 99.2% (initial testing) and 99.6% (retest result). Different values may be obtained depending on the group of samples used, variations in procedure, etc. Current knowledge indicates that a positive result in the anti-hbc test is not a certain sign of HBV infection, just as a negative test result does not reliably exclude HBV infection. OUWE G13 C0541 (879) CS/R 6

7 Reproducibility The results for intra-/inter-assay reproducibility are summarized in Table 4 (in the Appendix). For intra-assay reproducibility the coefficients of variation obtained were 3.9 to 13.6%. For interassay reproducibility the coefficients of variation obtained were 5.6 to 15.3%. These are typical data. Different values may however be obtained depending on variations in test procedure, etc. * Enzygnost is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in Germany and other countries. BEP is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in the USA, in Germany and other countries. Boviserin is a registered Trademark of Aventis Behring. Dade Behring Marburg GmbH 0197 Emil-von-Behring-Str. 76 D Marburg USA Distributor: Dade Behring Inc. Newark, DE U.S.A. OUWE G13 C0541 (879) CS/R 7

8 Tab. 1 Enzygnost* Anti-HBc monoclonal Stability and Storage Material/reagent State Storage Stability Enzygnost* Anti-HBc once opened +2 to +8 C 4 weeks monoclonal in the bag (test plate) with the desiccant Anti-HBc/POD Conjugate once opened +2 to +8 C 4 weeks monoclon. -20 C 3 months Conjugate Buffer once opened +2 to +8 C 4 weeks Working Conjugate to +8 C 4 weeks Solution +18 to +25 C 1 week Anti-HBc Control Serum, once opened +2 to +8 C 4 weeks positive Anti-HBc Control Serum, once opened -20 C 3 months negative Chromogen TMB once opened +2 to +8 C expiry date Buffer/Substrate TMB once opened +2 to +8 C expiry date Working Chromogen to +8 C 5 days Solution +18 to +25 C 8 hours closed container, protected from light Washing Solution POD undiluted +2 to +8 C expiry date (concentrate) once opened 1:20 +2 to +8 C 1 week 1: to +25 C 1 day Stopping Solution POD once opened +2 to +8 C expiry date use each component by the expiry date at the latest Tab. 2 Sensitivity The sensitivity studies performed at two independent centres (T, Tr) yielded the following data: Sample panel Number of samples Initially positive Retest positive (T) Acute HBV infection Chronic HBV infection Past HBV infection Follow-up samples (Tr) Acute HBV infection Chronic HBV infection Past HBV infection Follow-up samples OUWE G13 C0541 (879) CS/R 8

9 Tab. 3 Specificity The specificity studies performed at four independent centres (T, J, R, W) yielded the following data: Sample panel Number of sample Initially reactive Retest reactive (T) Normal negative sera (J) Normal negative sera Normal negative plasmas (R) Normal negative sera (W) Normal negative sera/plasmas Tab. 4 Reproducibility The studies on intra-assay reproducibility performed at two independent centres (T, Tr) yielded the following data: Sample Repeats Ratio % CV (T) (Tr) The studies on inter-assay reproducibility performed at three independent centres (T, J, Tr) yielded the following data: Sample Repeats Ratio % CV (T) (J) (Tr) Ratio = absorbance / cut-off OUWE G13 C0541 (879) CS/R 9

10 Tab. 5 Test procedure and programming BEP II Prepare reagents 4 x 25 µl Control Serum, negative 2 x 25 µl Control Serum, positive 25 µl per undiluted sample BEP III 100 µl In the case of partially filled Conjugate plates: Add water-filled strips to make up to half a plate 60 min ± 5 min (37 ± 1 C) Wash 4x: BEP II 100 µl Working Automatic Chromogen Solution processing 30 min ± 2 min +18 C to +25 C protected from light 100 µl Stopping Solution after max. 1 h Evaluate at 450 nm (Referencewavelength: 650 nm) Enzygnost* Anti-HBc monoclonal Test procedure (BEP II, BEP III, BEP 2000) Test result BEP 2000 Menu programming for the BEP II MENU OPERATE 1 WASHINGS ASPIRATE SOAKTIME DISP VOL CHANNEL PHOT OPERATE 2 YES DISPENSE CONJUGATE WASHINGS 0 ASPIRATE SOAKTIME 0 DISP VOL 100 CHANNEL 1 PHOT OPERATE 3 YES WASH AND DISPENSE CHROMOGEN WASHINGS 4 ASPIRATE SOAKTIME 0 DISP VOL 100 CHANNEL 4 PHOT OPERATE 4 YES DISPENSE STOPPING SOLUTION WASHINGS 0 ASPIRATE SOAKTIME 0 DISP VOL 100 CHANNEL 5 PHOT YES MEAS WL 450 REF WL 650 BLK COR EVAL MODE 4 GEN CUT NEG CONT 4 MAX NEG - MIN NEG FACT NEG 0.4 MAX POS THRESH - CUT OFF - OUWE G13 C0541 (879) CS/R 10

11 Enzygnost* Anti-HBc monoclonal Anwendungsbereich Enzymimmunoassay zum qualitativen Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis B (core)-antigen in Serum oder Plasma. Die Abarbeitung des Enzymimmunoassays erfolgt mit den ELISA Prozessoren BEP II, BEP III und BEP Der Test wurde entwickelt für die Untersuchung von Einzelproben, nicht von gepoolten Proben. Das Produkt darf nur für in vitro diagnostische Zwecke angewendet werden. Diagnostische Bedeutung Antikörper gegen das Hepatitis B (core)-antigen (Anti-HBc) treten bei einer akuten Hepatitis B- Infektion als erste Antikörper kurz nach den Antigenen HBsAg und HBeAg auf 1 und persistieren oft lebenslang 5. Die Anti-HBc-Bestimmung im Serum kann demzufolge zur Überwachung des Verlaufs einer Hepatitis B-Infektion herangezogen werden 2. Zusätzlich kann Anti-HBc als ein Marker zur Differentialdiagnose von Hepatitis A, Hepatitis B und Non A/Non B-Hepatitis dienen. Wird die Anti-HBc-Bestimmung als Screening-Parameter verwendet, kann bei HBsAg und Anti- HBs-negativen Sera ein positiver Anti-HBc-Befund doch noch auf einen früheren Kontakt mit dem Hepatitis B-Virus hinweisen. Ca. 10% aller Infektionen sind nur durch die Anti-HBc-Bestimmung serologisch nachweisbar 3. Vor der Verabreichung eines Hepatitis B-Impfstoffes gibt der Nachweis von Anti-HBc Aufschluß über den Immunstatus des Impflings 4. Für epidemiologische Untersuchungen ist der Antikörper gegen HBc-Antigen ein wertvoller Parameter, da er über einen längeren Zeitraum als der Antikörper gegen HBs-Antigen nachgewiesen werden kann 5. Prinzip der Methode Enzygnost* Anti-HBc monoclonal ist ein Enzymimmunoassay zur In-Vitro-Bestimmung von Antikörpern gegen HBcAg im Serum oder Plasma nach dem kompetitiven Einschritt-Prinzip. Das Anti-HBc der Probe konkurriert mit dem Anti-HBc/POD-Konjugat um die Bindung an das an der Oberfläche der Mikrotitrationsplatte fixierte HBcAg. Nach Auswaschen der Vertiefung wird die gebundene Enzymaktivität der Peroxidase bestimmt. Die enzymatische Umsetzung von Wasserstoffperoxid und Chromogen wird durch den Zusatz von verdünnter Schwefelsäure unterbrochen. Aufgrund des kompetitiven Prinzips des Tests ist die Farbintensität der in der Probe vorhandenen Anti-HBc-Konzentration umgekehrt proportional. Reagenzien Inhalt der Handelspackung Enzygnost* Anti-HBc monoclonal 2 x 96 Enzygnost* Anti-HBc 2 Testplatten Anti-HBc/POD-Konjugat monoclonal 2 x 1,2 ml Konjugat-Puffer (Anti-HBc monoclonal) 4 x 12,5 ml Anti-HBc-Kontroll-Serum, negativ 2 x 0,7 ml Anti-HBc-Kontroll-Serum, positiv 2 x 0,5 ml Waschlösung POD** 1 x 100 ml Puffer/Substrat TMB** 1 x 30 ml Chromogen TMB** 1 x 3 ml Stopplösung POD** 1 x 100 ml Leerflasche für Chromogen-Gebrauchslösung 1 Stück Abklebefolien 6 Stück PE-Beutel 1 Stück Barcodewertetabelle 1 Stück Packungsbeilage 1 Stück Weitere Handelspackung: 100 x 96 ** Diese Komponenten sind auch Bestandteile der Packung Zusatz-Reagenzien für Enzygnost* TMB (Bestell-Nr. OUVP). OUWE G13 C0541 (879) CS/R 11 Ausgabe Februar 2004

12 Zusammensetzung Enzygnost* Anti-HBc monoclonal (Testplatte): Mit gentechnologischem Hepatitis B-core-Antigen beschichtete Mikrotitrationsplatte. Anti-HBc/POD-Konjugat-monoclonal: Monoclonales Anti-HBc, Peroxidase (POD)-konjugiert. Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l) Konjugat-Puffer (Anti-HBc monoclonal): Tris-Puffer mit Boviserin und Tween 20. Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l) Anti-HBc-Kontroll-Serum, negativ: Humanserum, stabilisiert, Extinktionsrichtwert: 0,7 Konservierungsmittel: Amphotericin (ca. 5 mg/l), Gentamicin (ca. 100 mg/l). Anti-HBc/Kontroll-Serum, positiv: Humanserum, stabilisiert, Extinktionsrichtwert: 0,1 Konservierungsmittel: Amphotericin (ca. 5 mg/l), Gentamicin (ca. 100 mg/l). Waschlösung POD (Konzentrat): Tween-haltige Phosphat-Pufferlösung. Konservierungsmittel: Phenol (max. 1g/l) Puffer/Substrat TMB: Wasserstoffperoxid (ca. 0,1 g/l) in Acetat-Pufferlösung. Konservierungsmittel: n-butanol (ca. 1%) Chromogen TMB: Tetramethylbenzidin-dihydrochlorid Stopplösung POD: 0,5 N Schwefelsäure Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen 1. Nur zur in vitro diagnostischen Anwendung 2. Jede individuelle Blutspende, die zur Herstellung von Kontroll-Sera vorgesehen war, wurde auf HBsAg, auf Anti-HCV auf Anti-HIV1 und auf Anti-HIV2 untersucht. Für die Herstellung wurden nur Spenden mit negativem Befund verwendet. Unabhängig davon sollten alle aus menschlichem Blut gewonnenen Materialien wegen nie auszuschließender Gefährdung durch Krankheitserreger mit angemessener Sorgfalt unter Einhaltung der bei Biogefährdung empfohlenen Sicherheitsmaßnahmen gehandhabt werden Das Tragen von Untersuchungshandschuhen während der gesamten Testdurchführung wird angeraten. 4. Für die Entsorgung fester infektiöser Materialien empfiehlt sich eine Autoklavierung von mindestens 1 Stunde bei +121 C. Alle abgesaugten Lösungen sind in zwei hintereinandergeschalteten Vorlagen zu sammeln. Die Vorlagen sollten ein Desinfektionsmittel enthalten, das geeignet ist, human-pathogene Viren zu inaktivieren. Die vom Hersteller angegebenen Konzentrationen und Einwirkungszeiten müssen beachtet werden. Vorbereitung der Reagenzien Alle Reagenzien und Proben vor Testbeginn auf +18 bis +25 C erwärmen. Dabei die Testplatte nicht dem Behältnis entnehmen. Je Testplatte 20 ml Waschlösung POD mit destilliertem oder entionisiertem Wasser auf 400 ml verdünnen. Chromogen-Gebrauchslösung: Je Testplatte 1 ml Chromogen TMB mit 10 ml Puffer/Substrat TMB in der mitgelieferten Kunststoffflasche verdünnen (Chromogen-Gebrauchslösung) und verschlossen unter Lichtschutz aufbewahren. Flasche nach Gebrauch sorgfältig mit destilliertem Wasser spülen. Wegen technisch bedingter Überfüllung ist das Zusammengießen der Flascheninhalte von Chromogen TMB und Puffer/Substrat TMB nicht zulässig. Konjugat-Gebrauchslösung: Pro Testplatte 0,5 ml Anti-HBc/POD-Konjugat zu einer Originalabfüllung (12,5 ml) Konjugat-Puffer (Anti-HBc monoclonal) zugeben (1 + 25) und unter leichtem Schütteln mischen, aber Schaumbildung vermeiden. Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen Ungeöffnet sind alle Bestandteile der Kombinationspackung Enzygnost* Anti-HBc monoclonal bei einer Lagertemperatur von +2 bis +8 C bis zu den auf den Etiketten angegebenen Daten verwendbar. Die Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen der geöffneten bzw. gebrauchsverdünnten Reagenzien sind der Tabelle 1 im Anhang zu entnehmen. OUWE G13 C0541 (879) CS/R 12

13 Erforderliche Geräte BEP II: Zur automatischen Durchführung der Reagenzien-Dosierung und der Waschschritte BEP III: Zur automatischen Testabarbeitung nach der Probendosierung sowie Auswertung BEP 2000: Zur vollautomatischen Testabarbeitung sowie Auswertung Pipetten: Kolbenhubpipetten: 25, 100 und 1000 µl Inkubator: Bedecktes Wasserbad (+37 ± 1 C) oder vergleichbare Inkubationsmethoden Alle zur Testdurchführung eingesetzten Geräte müssen validiert sein. Untersuchungsmaterial Zur Untersuchung können Einzelproben (Human-Seren oder -EDTA/Heparin/Citrat-Plasmen) verwendet werden, welche nach Standard-Labortechniken entnommen wurden. Die Proben sollen maximal 3 Tage bei +2 bis +8 C gelagert werden. Zur längeren Lagerung sind die Proben einzufrieren. Testdurchführung Testdurchführung mit BEP II 1. Ansatzschema: Benötigte Anzahl der Auftragsstellen feststellen (Anzahl der zu untersuchenden Proben plus 6 Vertiefungen für Kontrollen). Für die Testdurchführung nicht benötigte Riegel dem Halterahmen entnehmen und für die spätere Verwendung lagern (siehe Tabelle 1). 2. Proben-Dosierung: In 4 Vertiefungen je 25 µl negative, in eine Vertiefung 25 µl positive Kontrolle, in die folgenden Vertiefungen je 25 µl unverdünnte Probe und am Ende der Serie bzw. Testplatte noch einmal 25 µl positive Kontrolle dosieren und die nachfolgende Konjugat- Dosierung (siehe Punkt 3.) baldmöglichst, max. 15 min nach Beendigung der Proben-Dosierung anschließen. Alternativ zu oben aufgeführtem Pipettierschema ist es auch erlaubt, die positive Kontrolle zweimal zu Beginn der Testreihe aufzutragen. Pipettierschema: In 4 Vertiefungen je 25 µl negative und in 2 Vertiefungen je 25 µl positive Kontrolle einfüllen; in die folgenden Vertiefungen je 25 µl unverdünnte Proben dosieren. 3. Konjugat-Dosierung: In jede Vertiefung 100 µl der Konjugat-Gebrauchsverdünnung einfüllen, mit Folie abkleben und sofort in den Inkubator stellen. 4. Inkubation: 60 min ± 5 min bei +37 C ± 1 C inkubieren, Waschvorgang unmittelbar anschließen. 5. Waschen: Folie abziehen, alle Vertiefungen absaugen und mit je ca. 0,3 ml Waschlösung 4 mal waschen. 6. Substrat-Dosierung: In jede Vertiefung 100 µl der Chromogen-Gebrauchslösung einfüllen, Platte mit neuer Folie abkleben. 7. Substrat-Inkubation: 30 min ± 2 min bei +18 bis +25 C lichtgeschützt inkubieren. 8. Stoppreaktion: Folie entfernen. Je Vertiefung 100 µl Stopplösung POD zugeben, dabei den gleichen Zeittakt wie bei Punkt 6. einhalten. 9. Messung: Innerhalb einer Stunde bei 450 nm photometrieren. Die Verwendung eines Photometers mit zwei Wellenlängen (Meß- und Referenzstrahl) ist empfehlenswert. Die Extinktionsmessung der Kontroll- und Patientenproben erfolgt bei 450 nm, als Wellenlänge der Referenzmessung wird 650 nm (ggfs. zwischen 615 und 690 nm) empfohlen. Testdurchführung mit BEP III Bei der Abarbeitung mit BEP III müssen die Testplatten einschließlich der Probendosierung (Punkt 1 und 2 der Testduchführung BEP II ) vorbereitet werden. Unmittelbar im Anschluß daran werden die Testplatten offen, d. h. nicht mit Folie abgeklebt, in den BEP III eingegeben. Dabei ist zu beachten, dass teilbestückte Testplatten mit Wasserriegeln auf mindestens halbe Testplatten (6 Testriegel) zu ergänzen sind.die anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch (siehe BEP III-Bedienungsanleitung). Die in der BEP III Software eingestellten Inkubationszeiten können auf Grund der technischen Rahmenbedingungen (Gerätetaktung) von denen der BEP II Prozessierung abweichen, sind jedoch in der Kombination BEP III/Enzygnost* validiert worden. OUWE G13 C0541 (879) CS/R 13

14 Testdurchführung mit BEP 2000 Die Probendosierung und anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch im Gerät (siehe BEP 2000-Bedienungsanleitung). Testvalidierung Die Einzelwerte der Extinktionen für die Kontroll-Sera werden zur Berechnung der Mittelwerte eingesetzt, wenn E neg. 0,700-0,010 E pos. 0,100 Von den Extinktionswerten des Anti-HBc-Kontroll-Serums, negativ, kann ein außerhalb der Spezifikation liegender Wert vernachlässigt werden. Die Extinktionswerte der positiven Kontrolle müssen beide die Spezifikation erfüllen. Werden diese Bedingungen nicht erfüllt, ist der Test zu wiederholen. Testauswertung Die Auswertungen erfolgen mit BEP 2000 und BEP III automatisch. Bitte dazu die Bedienungsanleitungen heranziehen. Die nachfolgenden Kapitel sind bei Auswertung ohne Softwareunterstützung zu beachten. Aus den Extinktionswerten der negativen Kontrollen wird der Mittelwert gebildet. Zur Grenzwertberechnung wird der Extinktionsmittelwert der negativen Kontrollen mit dem Faktor 0,4 multipliziert. E neg.. x 0,4 = Grenzwert (cut off) Als grenzwertiger Bereich wird definiert: Grenzwert ± 10%. Nach den Kriterien des Tests werden die Untersuchungsproben wie folgt klassifiziert: Testergebnis: 1. E Probe > cut off +10% ^= negativ 2. E Probe < cut off 10% ^= positiv 3. cut off - 10% E Probe cut off + 10% ^= grenzwertig Bei grenzwertigem Ergebnis wird die Probe erneut, dann jedoch als Doppelbestimmung getestet. Liegen in der Wiederholungstestung beide Extinktionswerte ober- bzw. unterhalb des grenzwertigen Bereichs, so kann das initial grenzwertige Ergebnis vernachlässigt und die Probe als negativ bzw. positiv betrachtet werden. Sollte die Probe in einer oder beiden Bestimmungen des Wiederholungstests grenzwertig reagieren, empfiehlt sich zur endgültigen Abklärung die Testung einer neuen, im Abstand von 2 bis 4 Wochen gewonnenen Probe. Einschränkungen der Testdurchführung 1. Natriumazid-haltige Proben dürfen nicht verwendet werden! 2. Antikoagulantien wie Heparin, EDTA und Citrat beeinflussen das Testergebnis nicht. 3. Bei hitzebehandelten Proben (60 min, +56 C) wurden keine Störungen beobachtet. 4. Ungenügend geronnenes Serum sowie zelluläre Blutbestandteile können zu unzuverlässigen Ergebnissen führen. 5. Rheumafaktorhaltige oder hämolytische Proben führen zu keiner Testbeeinträchtigung. 6. Proben mit Antikörpern gegen CMV sowie Anti-HBs positive Proben beeinflussen das Testergebnis nicht. 7. Mit Proben von Patienten mit zirkulierenden Immunkomplexen sowie Anti-Maus IgG haltigen Proben wurde keine Beeinflussung des Testergebnisses beobachtet. 8. Proben mit Antikörpern gegen Hepatitis A Virus, EBV, HIV, HCV sowie lipämische oder ikterische Proben können erhöhte Reaktivität zeigen. 9. Proben von Hämodialyse-Patienten, Transplantations-Patienten, Patienten mit mehrfacher Bluttransfusion sowie Patienten mit erhöhten Transaminasen-Werten können erhöhte Reaktivität zeigen. 10. Bei aufgetauten Proben ist auf eine gute Homogenisierung des Materials zu achten. OUWE G13 C0541 (879) CS/R 14

15 11. Die Reagenzien (ausgenommen Waschlösung POD, Stopplösung POD und die aus den chargengebundenen Reagenzien Chromogen TMB und Puffer/Substrat TMB hergestellte Chromogen-Gebrauchslösung) sind nur chargengebunden zu verwenden, d.h. nur in der Kombination der einzelnen 6-ziffrigen Chargen-Bezeichnungen, die auf der Packung aufgedruckt bzw. der separat beigepackten Barcode-Tabelle zu entnehmen sind. 12. Puffer/Substrat TMB, Chromogen-Gebrauchslösung und Stopplösung POD dürfen nicht in Kontakt mit Schwermetallionen oder oxidierenden Substanzen kommen (keine Pipetten mit flüssigkeitsführenden Metallteilen verwenden). Die Substratreaktionen nicht in der Nähe von Hypochlorit-haltigen Desinfektionsmitteln durchführen. Eine spontane Blaufärbung der Chromogen-Gebrauchslösung vor der Übertragung in die Testplatte deutet auf Kontamination hin; eine frische Lösung ist in einem sauberen Gefäß anzusetzen. Hautkontakt mit den vorgenannten Lösungen ist zu vermeiden. 13. Die Testplatte soll während der Inkubation ruhig liegen (z.b. auf fixierter Schwimmhilfe oder im nicht zirkulierenden Wasserbad); die Kavitäten sind dabei in Kontakt mit dem temperierten Wasser. Werden Stabilisatoren zur Verhinderung der Verkeimung des Wassers verwendet, so ist sorgfältig darauf zu achten, daß weder die Testplattenoberfläche noch die Näpfchen mit diesen Lösungen in Kontakt kommen, da dadurch unspezifische Reaktionen hervorgerufen werden könnten. 14. Bei stark reaktiven Proben kann bei der Stoppreaktion der Farbstoff ausfallen. Die photometrische Auswertung wird dadurch nicht beeinflußt. 15. Die Kontrollsera sind unter Verwendung nativer Humansera hergestellt. Daher können Trübungen auftreten, die das Testergebnis jedoch nicht beeinflussen. 16. Dade Behring hat den Einsatz dieser Reagenzien auf verschiedenen Analysengeräten auf optimale Produktleistung und Einhaltung der Produktspezifikationen überprüft. Vom Benutzer vorgenommene Änderungen werden von Dade Behring nicht unterstützt, da sie die Leistung des Systems und die Testergebnisse beeinflussen können. Es liegt in der Verantwortung des Benutzers, Änderungen an diesen Anleitungen oder die Verwendung dieser Reagenzien auf anderen als in den Applikationsvorschriften von Dade Behring oder diesen Gebrauchsanweisungen genannten Analysengeräten zu validieren. 17. Resultate dieses Tests sollten stets in Verbindung mit der Vorgeschichte des Patienten, dem klinischen Bild und anderen Untersuchungsergebnissen interpretiert werden. Leistungsmerkmale des Tests Sensitivität und Spezifität Die Ergebnisse zur Prüfung der Sensitivität und Spezifität sind in den Tabellen 2+3 (im Anhang) zusammengefaßt. Bei der Ermittlung der Sensitivität wurden insgesamt 1266 Anti-HBc-positive Proben untersucht und eine Sensitivität von 96,9 bis 100% (initiale Testung) bzw. 97,5% (Retestung) ermittelt. Es kann nicht ausgeschlossen werden, daß sich bei breiter Anwendung des Tests einzelne Proben dem Nachweis entziehen können. Bei der Ermittlung der Spezifität wurden insgesamt 6116 Anti-HBc-negative Blutspendeproben untersucht und eine Spezifität von 99,2% (initiale Testung) bzw. 99,6% (Retestung) ermittelt. Bedingt durch das Untersuchungskollektiv, die Testdurchführung u. a. sind abweichende Werte möglich. Nach derzeitigem Kenntnisstand kann aus einem positiven Ergebnis der Anti-HBc-Testung nicht mit Sicherheit eine HBV-Infektion abgeleitet werden, wie auch ein negatives Testergebnis keineswegs eine HBV-Infektion sicher ausschließt. Reproduzierbarkeit Die Ergebnisse zur Intra/Inter-assay-Reproduzierbarkeit sind in der Tabelle 4 (im Anhang) zusammengefaßt. Für die Intra-assay-Reproduzierbarkeit wurden Variationskoeffizienten von 3,9 bis 13,6% erhalten. Für die Inter-assay-Reproduzierbarkeit wurden Variationskoeffizienten von 5,6 bis 15,3% erhalten. Es handelt sich hierbei um beispielhaft ermittelte Daten. Abhängig von der Testdurchführung u. a. sind durchaus abweichende Werte möglich. * Enzygnost ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in Deutschland und anderen Ländern. BEP ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in den USA, Deutschland und anderen Ländern. Boviserin ist eine eingetragene Marke von Aventis Behring. Dade Behring Marburg GmbH 0197 Emil-von-Behring-Str. 76 D Marburg OUWE G13 C0541 (879) CS/R 15

16 Tab. 1 Enzygnost* Anti-HBc monoclonal Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen Material/Reagenz Zustand Lagerung Stabilität Enzygnost* Anti-HBc nach Öffnen +2 bis +8 C 4 Wochen monoclonal im Beutel mit (Testplatte) Trockenkapseln Anti-HBc/POD-Konjugat nach Öffnen +2 bis +8 C 4 Wochen monoclonal -20 C 3 Monate Konjugat-Puffer nach Öffnen +2 bis +8 C 4 Wochen gebrauchsfertig verdünntes bis +8 C 4 Wochen Konjugat +18 bis +25 C 1 Woche Anti-HBc-Kontroll-Serum, nach Öffnen +2 bis +8 C 4 Wochen positiv Anti-HBc-Kontroll-Serum, nach Öffnen -20 C 3 Monate negativ Chromogen TMB nach Öffnen +2 bis +8 C bis Verfallsdatum Puffer/Substrat TMB nach Öffnen +2 bis +8 C bis Verfallsdatum Chromogen-Gebrauchs bis +8 C 5 Tage lösung +18 bis +25 C 8 Stunden geschlossenes, Gefäß, lichtgeschützt Waschlösung POD unverdünnt +2 bis +8 C bis Verfallsdatum (Konzentrat) nach Öffnen 1:20 +2 bis +8 C 1 Woche 1: bis +25 C 1 Tag Stopplösung POD nach Öffnen +2 bis +8 C bis Verfallsdatum in keinem Fall länger als bis zum Verfallsdatum Tab. 2 Sensitivität Bei den Untersuchungen zur Sensitivität wurden an zwei unabhängigen Zentren (T, Tr) folgende Daten ermittelt: Probenkollektiv Probenanzahl initial positiv retest positiv (T) akute HBV-Infektion chronische HBV-Infektion zurückliegende HBV-Infektion Verlaufskontrollproben (Tr) akute HBV-Infektion chronische HBV-Infektion zurückliegende HBV-Infektion Verlaufskontrollproben OUWE G13 C0541 (879) CS/R 16

17 Tab. 3 Spezifität Bei den Untersuchungen zur Spezifität wurden an vier unabhängigen Zentren (T, J, R, W) folgende Daten ermittelt: Probenkollektiv Probenanzahl initial reaktiv retest reaktiv (T) normal negative Seren (J) normal negative Seren normal negative Plasmen (R) normal negative Seren (W) normal negative Seren/Plasmen Tab. 4 Reproduzierbarkeit Bei den Untersuchungen zur Intra-assay-Reproduzierbarkeit wurden an zwei unabhängigen Zentren (T, Tr,) folgende Daten ermittelt: Probe Wiederholung Ratio % CV (T) (Tr) Bei den Untersuchungen zur Inter-assay-Reproduzierbarkeit wurden an drei unabhängigen Zentren (T, J, Tr) folgende Daten ermittelt: Probe Wiederholung Ratio % CV (T) (J) (Tr) Ratio = Absorption/Grenzwert OUWE G13 C0541 (879) CS/R 17

18 Tab. 5 Testdurchführung und -programmierung Enzygnost*Anti-HBc monoclonal Testdurchführung (BEP II, BEP III, BEP 2000) Vorbereitung der Reagenzien BEP 2000 Menüprogrammierung für den BEP II BEP II 100 µl Konjugat 60 min ± 5 min (37 ± 1 C) 4 x Waschen: BEP II 4 x 25 µl Kontroll-Serum, negativ 2 x 25 µl Kontroll-Serum, positiv 25 µl unverdünnte Probe BEP III teilbestückte Platten mit Wasserriegeln auf halbe Platten ergänzen 100 µl Chromogen- automatische Gebrauchslösung Testabarbeitung 30 min ± 2 min +18 C bis +25 C lichtgeschützt 100 µl Stopplösung nach maximal 1 h Auswertung 450 nm (Referenzwellenlänge: 650 nm) Testergebnis MENU OPERATE 1 WASHINGS ASPIRATE SOAKTIME DISP VOL CHANNEL PHOT OPERATE 2 YES DOSIERUNG KONJUGAT WASHINGS 0 ASPIRATE SOAKTIME 0 DISP VOL 100 CHANNEL 1 PHOT OPERATE 3 YES WASCHEN UND DOSIERUNG CHROMOGEN WASHINGS 4 ASPIRATE SOAKTIME 0 DISP VOL 100 CHANNEL 4 PHOT OPERATE 4 YES DOSIERUNG STOPPLÖSUNG WASHINGS 0 ASPIRATE SOAKTIME 0 DISP VOL 100 CHANNEL 5 PHOT YES MEAS WL 450 REF WL 650 BLK COR EVAL MODE 4 GEN CUT NEG CONT 4 MAX NEG - MIN NEG FACT NEG 0.4 MAX POS THRESH - CUT OFF - OUWE G13 C0541 (879) CS/R 18

19 Enzygnost * Anti-HBc monoclonal Domaine d utilisation Test immunoenzymatique pour la détection qualitative des anticorps anti-antigène de (core) de l hépatite B dans le sérum ou le plasma. Le test immunoenzymatique s effectue à l aide des ELISA Processors BEP II, BEP III et BEP Il a été mis au point pour l analyse d échantillons individuels et non pas d échantillons poolés. Les réactifs ne peuvent être utilisés qu à des fins de diagnostic in vitro. Intérêt diagnostique Dans une hépatite B aiguë, ce sont les anticorps dirigés contre l antigène de core de l hépatite B (anti-hbc) qui apparalissent comme premiers anticorps peu de temps apres les antigènes AgHBs et AgHBe 1 ; ils persistent souvent toute la vie 5. C est pourquoi le dosage des anti-hbc dans le sérum peut-il être utilisé pour la surveillance de l évolution d une hépatite B 2. L anti-hbc peut également servir de marqueur pour le diagnostic différentiel des hépatites A, B et non A/non B. Lorsque l anti-hbc est utilisé comme paramètre de dépistage, un résultat positif en anti-hbc dans des sérums AgHBs et anti-hbs-négatifs peut indiquer un contact ancien avec le virus de l hépatite B. Environ 10% de l ensemble des infections ne sont sérologiquement détectables que par le dosage des anti-hbc 3. Avant une vaccination contre l hépatite B, une recherche des anti-hbc permet de connaître l état immunitaire du sujet 4. Pour les études épidémiologiques, l anti-hbc est un paramètre précieux, dans la mesure où il est plus longtemps détectable que l anti-hbs 5. Principe de la méthode L Enzygnost* Anti-HBc monoclonal est un test immunoenzymatique permettant le dosage in vitro des anticorps dirigés contre l AgHBc dans le sérum ou le plasma selon le principe de compétition en une étape. L anti-hbc de l échantillon est en compétition avec le conjugué anti- HBc/POD pour se lier à l AgHBc fixé à la surface de la plaque de microtitration. Après rinçage des cupules, on mesure l activité enzymatique liée de la peroxydase. La transformation enzymatique du peroxyde d hydrogène et du chromogène est interropue par l addition d acide sulfurique dilué. Du fait du principe de compétition du test, l intensité de la coloration est inversément proportionnelle à la concentration d anti-hbc de l échantillon. Réactifs Contenu du coffret Enzygnost* Anti-HBc monoclonal 2 x 96 Enzygnost* Anti-HBc Conjugué anti-hbc/pod monoclonal Tampon conjugué (anti-hbc monoclonal) Sérum de contrôle anti-hbc négatif Sérum de contrôle anti-hbc positif Solution de lavage POD (concentrée)** Tampon/substrat TMB** Chromogène TMB** Solution d arrêt POD** Flacon vide pour solution d emploi du chromogène Feuilles adhésives Sachet PE Tableau de codes à barres Fiche technique Autre conditionnement : 100 x 96 2 plaques-tests 2 x 1,2 ml 4 x 12,5 ml 2 x 0,7 ml 2 x 0,5 ml 1 x 100 ml 1 x 30 ml 1 x 3 ml 1 x 100 ml 1 pièce 6 pièce 1 pièce 1 pièce 1 pièce ** Ces éléments font également partie du Coffrert de réactifs complémentaries pour Enzygnost* TMB (code OUVP). OUWE G13 C0541 (879) CS/R 19 Edition Février 2004

20 Composition Enzygnost* Anti-HBc monoclonal (plaque-test): plaque de microtitration recouverte de l antigène de core de l hépatite B obtenu par génie génétique. Conjugué anti-hbc/pod monoclonal: anti-hbc monoclonal conjugué à la peroxydase (POD). Agent de conservation: phénol (max. 1 g/l) Tampon conjugué (anti-hbc monoclonal) Tampon Tris additionné de Boviserin et de Tween 20. Agent de conservation: phénol (max. 1 g/l) Sérum de contrôle anti-hbc négatif: sérum humain, stabilisé, valeur de D. O. indicative: 0,7 D.O. Agent de conservation: amphotéricine (env. 5 mg/l), gentamycine (env. 100 mg/l) Sérum de contrôle anti-hbc positif: sérum humain, stabilisé, valeur de D. O. indicative: 0,1 D.O. Agent de conservation: amphotéricine (env. 5 mg/l), gentamycine (env. 100 mg/l) Solution de lavage POD (concentrée): solution tampon phosphate additionnéede Tween Agent de conservation: phénol (max. 1g/l) Tampon/substrat TMB: peroxyde d hydrogène (0,1 g/l) en solution tampon acétate. Agent de conservation: n-butanol (env. 1%) Chromogène TMB: tétraméthylbenzidine-dihydrochlorure Solution d arrêt POD: acide sulfurique 0,5 N Mises en garde et précautions d emploi 1. Ne doit être employé que pour un usage in vitro 2. Tout don de sang individuel prévu pour la préparation des sérums de contrôle a été testé visà-vis de l anticorps AgHBs, de l anticorps anti-vhc, de l anticorps anti-vih 1 et de l anticorps anti-vih 2. Seuls les dons trouvés négatifs ont été utilisés. Néanmoins, toutes les préparations obtenues à partir de sang humain doivent être manipulées avec les précautions nécessaires en cas de risque biologique, dans la mesure où l on ne peut exclure totalement un risque d infection Il est recommandé de porter des gants de protection pendant toute la réalisation du test. 4. Pour décontaminer le matériel de laboratoire infecté, l autoclaver pendant au moins 1 heure à +121 C. Toutes les solutions aspirées doivent être récoltées dans deux récipients reliés l un à l autre et contenant chacun un désinfectant spécialement conçu pour inactiver les virus pathogènes pour l homme. Respecter les concentrations et temps d incubation indiqués par le fabricant. Préparation des réactifs Porter tous les réactifs et échantillons à +18/+25 C avant le début du test, sans sortir la plaquetest de son emballage. Pour une plaque, diluer 20 ml de solution de lavage POD avec de l eau distillée ou désionisée en complétant à 400 ml. Solution d emploi du chromogène: pour une plaque, diluer 1 ml de Chromogène TMB avec 10 ml de Tampon/substrat TMB dans le flacon plastique vide inclus dans le coffret (solution d emploi du chromogène), et la conserver dans le flacon fermé à l abri de la lumière. Après emploi, bien rincer le flacon avec de l eau distillée. Pour des raisons de capacité de flacon, il est impossible de verser la totalité du contenu d un flacon de Chromogène TMB dans un flacon de Tampon/substrat TMB. Solution d emploi du conjugué: pour une plaque, ajouter 0,5 ml de Conjugué AgHBc/POD au contenu d un flacon (12,5 ml) de Tampon conjugué (anti-hbc monoclonal) (dilution au 1/26), et mélanger en agitant légèrement et en évitant la formation de mousse. Stabilités et conditions de conservation Tous les éléments du coffret Enzygnost* Anti-HBc monoclonal conservés à +2/+8 C dans leur flacon ou sachet d origine non ouvert peuvent être utilisés jusqu à la date indiquée sur l étiquette. Pour les stabilités et conditions de conservation des réactifs ouverts ou dilués à la dilution d emploi, se reporter au Tableau 1 en annexe. OUWE G13 C0541 (879) CS/R 20

21 Matériel nécessaire BEP II : pour la distribution automatique des réactifs et l automatisation des étapes de lavage BEP III : pour l automatisation du test après la distribution des échantillons et de l exploitation des résultats BEP 2000 : pour l entière automatisation du test et de l exploitation des résultats Pipettes : pipettes à embout de 25, 100 et 1000 µl. Incubateur : bain-marie couvert (+37 ± 1 C) ou méthode d incubation équivalente Tout le matériel utilisé pour la réalisation du test doit être validé. Echantillons à tester Utiliser des échantillons (sérums humains ou plasmas citratés, héparinés ou prélevés sur EDTA) obtenus selon les techniques standard des laboratoires. Les échantillons peuvent être conservés 3 jours maximum à +2/+8 C. Pour une conservation plus longue, les congeler. Réalisation du test Réalisation du test sur le BEP II 1. Schéma de distribution: déterminer le nombre de cupules nécessaires (nombre d échantillons à tester + 6 cupules pour les contrôles). Sortir du cadre les barrettes inutiles et les conserver pour un test futur (cf. Tableau 1). 2. Distribution des contrôles et échantillons: distribuer 25 µl de contrôle négatif dans les 4 premières cupules, 25 µl de contrôle positif dans la cupule 5, 25 µl de chacun des échantillons non dilués dans les cupules suivantes, puis de nouveau 25 µl de contrôle positif à la fin de la série ou de la plaque. Enchaîner ensuite le plus rapidement possible, mais au plus tard dans les 15 min, la distribution du conjugué (cf. point 3). Comme alternative au schéma de pipetage indiqué ci-dessus, on peut également déposer le contrôle positif deux fois en début de série. Schéma de pipetage : distribuer 25 µl de contrôle négatif dans 4 cupules, 25 µl de contrôle positif dans 2 cupules, puis 25 µl de chacun des échantillons non dilués dans les cupules suivantes. 3. Distribution du conjugué: ajouter dans chaque cupule 100 µl du conjugué à la dilution d emploi, recouvrir la plaque d une feuille adhésive et la placer immédiatement dans l incubateur. 4. Incubation: laisser incuber 60 ± 2 min à +37 C ± 1 C, et enchaîner immédiatement le processus de lavage. 5. Lavage: retirer la feuille adhésive, aspirer le contenu de toutes les cupules, et distribuer dans chacune d elles env. 0,3 ml de Solution de lavage; faire 4 lavages. 6. Distribution du substrat: ajouter dans chaque cupule 100 µl de la solution d emploi du chromogène, et couvrir la plaque d une nouvelle feuille adhésive. 7. Incubation du substrat: laisser incuber 30 ± 2 minutes à +18/+25 C a l abri de la lumière. 8. Arrêt de la réaction: retirer la feuille adhésive et ajouter dans chaque cupule 100 µl de Solution d arrêt POD en respectant le même rythme qu en Mesure: faire une mesure photométrique dans l heure qui suit a 450 nm. Il est recommandé d utiliser un photomètre avec deux longueurs d onde (une de mesure et une de référence). La mesure de la densité optique des contrôles et des échantillons de patients se fait à 450 nm. La longueur d onde de référence doit être de 650 nm (éventuellement comprise entre 615 à 690 nm). Réalisation du test sur le BEP III Pour une utilisation sur le BEP III, les plaques-tests doivent être préparées jusqu y compris la distribution des échantillons (points 1 et 2 du paragraphe «Réalisation du test sur le BEP II»). Immédiatement après cette étape, placer la plaque ouverte, c est-à-dire non recouverte d une feuille adhésive, dans le BEP III. Si la plaque n est pas totalement utilisée, la compléter au moins pour moitié (6 barrettes) avec des barrettes remplies d eau. La suite du test est ensuite effectuée entièrement automatiquement (cf. Manuel d utilisation du BEP III). OUWE G13 C0541 (879) CS/R 21