Enzygnost * Anti-HBs II

Transcripción

1 Enzygnost * Anti-HBs II Enzyme immunoassay for the qualitative and quantitative detection of antibodies to hepatitis B surface antigen (HBsAg) in serum and plasma Enzymimmunoassay zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis B surface Antigen (HBsAg) in Serum und Plasma Test immunoenzymatique qui permet la mise en évidence qualitative et quantitative des anticorps anti-antigène de surface de l hépatite B (AgHBs) dans le sérum ou le plasma Metodo immunoenzimatico per l identificazione qualitativa e la determinazione quantitativa degli anticorpi contro l antigene di superficie dell epatite B nel siero e nel plasma. Prueba inmunoenzimática para la determinación cualitativa y cuantitativa del anticuerpo contra el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) en suero y en plasma Determinação qualitativa e quantitativa de anticorpos contra _ o antigénio de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg) no soro e no plasma. English: Page 2 to 12 Deutsch: Seite 13 bis 22 Français: Pages 23 à 33 Italiano: Pagina 34 fino 44 Español Página 45 hasta 55 Português: Página 56 a 66 Summary of Test Procedure Page 12 Kurzanleitung Testdurchführung Seite 22 La technique en bref Page 33 Istruzioni in breve, esecuzione del Test Pagina 44 Resumen de la técnica Página 55 Resumo da técnica Página 66 Bibliography/Literatur/Littérature Bibliografia/Bibliografía/Bibliografia Page/Seite/Pagina/Página 67 OQNE G11 C0541 (906) H/R 1 Edition February 2004

2 Enzygnost * Anti-HBs II Intended Use Enzyme immunoassay for the qualitative and quantitative detection of antibodies to hepatitis B surface antigen (HBsAg) in serum and plasma. The enzyme immunoassay is processed using the BEP II, BEP III and BEP 2000 ELISA processors. The test was developed for testing individual samples, not for pooled samples. The product is for in vitro diagnostic use only. The product is for in vitro diagnostic use only. Summary and Explanation Like hepatitis B surface antigen (HBsAg), the anti-hbs antibody directed against the surface protein is an important parameter for the diagnosis of infection with hepatitis B virus (HBV) 1,2. During the incubation period and in the acute phase of HBV infection, antibodies to HBsAg are undetectable. In 90% of all cases these anti-hbs antibodies, which provide immunity, do not occur until late in convalescence approx. 3 to 4 months after the onset of the disease, when circulating HBsAg can no longer be detected 3, 4. This seroconversion, i.e. the transition from anti-hbs negative to positive, represents a very reliable parameter for diagnosing a past HBV infection, especially since approx. 10% of acutely infected patients in whom no HBsAg can be detected in the early phase later become positive for anti-hbs. The anti-hbs test is therefore also suitable for the diagnosis for subclinical HBV infections 3, 4. As a positive result for anti-hbs is indicative of past exposure to this antigen - either by HBV infection or by vaccination, the most important applications of the anti-hbs test are as follows: a) assessment of convalescence and, to a certain extent, also prognosis in patients infected with HBV (follow-up), b) serological investigations in the context of vaccination programmes (screening and immunization check-ups), c) epidemiological studies. Besides the qualitative detection of anti-hbs, the quantitative evaluation of anti-hbs has gained its own relevance with regard to the aspect of active immunization. According to a recommendation of the WHO, a person vaccinated with a hepatitis vaccine can be assumed to be protected against the infection if an anti-hbs concentration of > 10 IU/L can be detected in the serum or plasma. Booster vaccinations in time are recommended to guarantee that the values are not below this limit 5, 6, 7. Patients found to have anti-hbs values < 100 IU/L after the completion of basic immunization require booster vaccination within one year (Recommendations of the Standing Vaccination Comittee of the Robert Koch Institute in Germany, October 1995). The necessity of a quantitative assessment is furthermore underlined by the fact that the duration of immunity is proportional to the attained levels of anti-hbs. Principle of the Method Enzygnost * Anti-HBs II is a one-step assay based on the sandwich principle. The antigen used for the solid phase and conjugate is human HBsAg. Peroxidase-labelled HBsAg binds to the HBs-specific antibodies contained in the sample. These bind to the HBsAg bound to the surface of the microtitration plate (antigen sandwich). The unbound constituents are removed by washing and the bound enzyme activity of the conjugate is then determined. The enzymatic conversion of substrate and chromogen results in a blue colour. The reaction is terminated by the addition of Stopping Solution POD, producing a yellow colour. The intensity of the colour is proportional to the concentration of antibody in the sample. The results are quantified by calculation using the α-method or by comparison with a standard curve. OQNE G11 C0541 (906) H/R 2 Edition February 2004

3 Reagents Materials provided Enzygnost * Anti-HBs II 1 x x 96 Enzygnost * Anti-HBs II 1 test plate 10 test plates HBsAg/POD Conjugate (Anti-HBs II) 1 x 6 ml 10 x 6 ml Anti-HBs Serum x 1.5 ml 3 x 1.5 ml Anti-HBs Serum, negative 2 x 14 ml 5 x 14 ml Washing Solution POD (Concentrate)** 1 x 100 ml 2 x 100 ml Buffer/Substrate TMB** 1 x 30 ml 4 x 30 ml Chromogen TMB** 1 x 3 ml 4 x 3 ml Stopping Solution POD** 1 x 100 ml 2 x 100 ml Empty bottle for Working Chromogen Solution 1 pcs. 1 pcs. Adhesive foils 6 pcs. 24 pcs. PE bag 1 pcs. 1 pcs. Barcode table of values 1 pcs. 1 pcs. Instructions for use 1 pcs. 1 pcs. Further packs: 100 x 96 ** These components are also included in the Supplementary Reagents for Enzygnost* TMB kit (code no. OUVP). Composition Enzygnost * Anti-HBs II (test plate): Microtitration plate coated with inactivated HBsAg (subtypes ad and ay) isolated from human blood. HBsAg/POD Conjugate (anti-hbs II): Inactivated HBsAg, peroxidase (POD)-conjugated, isolated from human blood, Tris (approx. 100 g/l), NaCl (approx. 47 g/l) Preservative: phenol (max. 1 g/l) Anti-HBs Serum 100: Human anti-hbs serum (nominal concentration 100 ± 25 IU/L), calibrated against the WHO Reference Preparation, nominal absorbance: 0.7 Preservatives: amphotericin (approx. 5 mg/l), gentamicin (approx. 100 mg/l) Anti-HBs Serum, negative: Human serum, nominal absorbance: 0.12 Preservatives: amphotericin (approx. 5 mg/l), gentamicin (approx. 100 mg/l) Washing Solution POD (concentrate): Phosphate buffer solution (90 mmol/l) containing Tween. Preservative: phenol (max. 1 g/l) Buffer/Substrate TMB: Hydrogen peroxide (approx. 0.1 g/l) in acetate buffer solution (25 mmol/l) Preservative: n-butanol (approx. 10 ml/l) Chromogen TMB: Tetramethyl benzidinedihydrochloride (5 g/l) Stopping Solution POD: 0.5 N sulfuric acid OQNE G11 C0541 (906) H/R 3

4 Warnings and Precautions 1. For in vitro diagnostic use. 2. Each individual blood donation for use in manufacture of the controls of Enzygnost * Anti-HBs II is tested for HBsAg, anti-hcv, anti-hiv1 and anti-hiv2. Only donations with negative findings are used for manufacture. Nevertheless, since absence of infectious agents cannot be proven, all materials obtained from human blood should be handled with due care, observing the precautions recommended for biohazardous material The HBsAg used in the manufacture of the test plates and POD conjugate was isolated from HBsAg-positive human plasmas, which were found to be negative concerning Anti-HCV, Anti- HIV1 and Anti-HIV2, to a high degree of purity and subjected to a recognized inactivation process. 4. It is advisable to wear protective gloves throughout the entire test procedure. 5. For disposal, it is recommended that solid infectious materials should be autoclaved for at least one hour at +121 C. All aspirated liquids should be collected in two receptacles connected in series, which should both contain a disinfectant suitable for inactivating pathogenic human viruses. The concentrations and times specified by the manufacturer must be observed. Preparation of the Reagents Bring all the reagents and samples to +15 to +25 C before beginning the test (without removing the test plate from the container). Test strips not needed for the test must be removed from the holder and stored for later use (see Table 1) For each test plate, dilute 20 ml of Washing Solution POD to 400 ml with distilled or deionized water. For each test plate, dilute 1 ml of Chromogen TMB with 10 ml of Buffer/Substrate TMB in the empty bottle supplied with the kit (= Working Chromogen Solution) and store protected from light. After use rinse the bottle thoroughly with distilled water. For technical reasons (overage) it is not permissible to transfer the contents of the Chromogen TMB vial into the vial of Buffer/Substrate TMB. Prediluting the samples: For the quantitative test, samples expected to contain anti-hbs concentrations of 100 IU/L should be diluted as follows: up to 1000 IU/L: Dilute 1:10 (e.g. 20 µl sample µl Anti-HBs Serum, negative) up to 10,000 IU/L: Dilute 1:100 (e.g. 20 µl sample µl Anti-HBs Serum, negative; 20 µl thereof µl Anti-HBs Serum, negative) up to 100,000 IU/L: Dilute1:1000 (e.g. 20 µl sample µl Anti-HBs Serum, negative; 20 µl thereof µl Anti-HBs Serum, negative; 20 µl thereof µl Anti-HBs Serum, negative). If the quantitative evaluation of the test is performed using serial dilutions, the following dilutions of the Anti-HBs Serum 100 must be additionally prepared with the Anti-HBs Serum, negative (does not apply if evaluation is by the α-method): 50 IU/L: 1:2 dilution (e.g. 200 µl Anti-HBs Serum µl Anti-HBs Serum, negative) 25 IU/L: 1:4 dilution (e.g. 150 µl of the 50 IU/L Serum µl Anti-HBs Serum, negative) 10 IU/L: 1:10 dilution (e.g. 50 µl Anti-HBs Serum µl Anti-HBs Serum, negative) 5 IU/L: 1:20 dilution (e.g. 150 µl of the 10 IU/L Serum µl Anti-HBs Serum, negative) Storage and Stability Stored unopened at +2 to +8 C, all components of the Enzygnost * Anti-HBs II kit may be used up to the dates of expiry given on the labels. Once opened or diluted ready for use, the details given in Table 1 in the Appendix apply. OQNE G11 C0541 (906) H/R 4

5 Equipment required: BEP II: For automatic dispensing of reagent and washing BEP III: For automatic processing of the test after dispensing the samples as well as for evaluation BEP 2000: For fully automatic processing and evaluation of the test Pipettes: piston-type pipettes: 25, 100 and 1000 µl. Incubator: Covered water bath (+37 ± 1 C) or comparable incubation methods All the equipment used in the test must have been validated. Specimens Suitable specimens are individual samples (human sera or EDTA/ heparinized/citrated plasma) obtained by standard laboratory techniques. The samples should be stored for not more 3 days at 2-8 C. If the samples are to be stored for a longer period of time, they must be frozen. Procedure Procedure using the BEP II 1. Assay scheme: Ascertain the number of wells required (= number of test samples plus 6 wells for the controls). 2. Dispense samples: Qualitative Test/Quantitative Test (α - method): Into 4 wells (A1 to D1) pipette 100 µl/well of Anti-HBs Serum, negative, and into one well (E1) 100 µl of Anti-HBs Serum 100. Fill each of the subsequent wells with 100 µl/well of sample. At the end of the series/plate, fill one further well with 100 µl of Anti-HBs Serum 100. Perform the pipetting steps swiftly within 15 min per test plate. Important: It is T permitted to pipette the Anti-HBs Serum 100 into the assigned wells first and then to add the samples into the "gaps" between the wells. Quantitative Test (standard series): Pipette into 4 wells 100 µl/well of Anti-HBs Serum, negative, and then fill the 100, 50, 25, 10 and 5 IU/L dilutions of the Anti-HBs Serum into 2 wells each at 100 µl/well. Fill the following wells with 100 µl/well of sample (prediluted if required). Immediately after dispensing the samples continue by dispensing the conjugate. 3. Dispense conjugate: Pipette 25 µl of the HBsAg/POD Conjugate (Anti-HBs II) into each well. Then seal with foil and, immediately after completion of the conjugate dispensing step, place the plate into the incubator. 4. Incubate: Incubate at 37 ± 1 C for 60 ± 2 min. Then proceed immediately to the wash step. 5. Wash: Remove the foil, aspirate all the wells and wash 4 times with approx. 0.3 ml/well of washing solution. After completing the wash cycles proceed immediately to the substrate dispensing step in order to prevent drying out of the wells. 6. Dispense substrate: Pipette 100 µl of the Working Chromogen Solution into each well and seal the plate with fresh foil. 7. Incubate: Incubate protected from light at +15 to +25 C for 30 ± 2 min. 8. Stop reaction: Remove foil, and add 100 µl of Stopping Solution POD to each well, keeping to the same timing as in Step Read: Read at 450 nm within one hour. The recommended wavelength for the reference measurement is 650 nm (where appropriate, between 615 and 690 nm). OQNE G11 C0541 (906) H/R 5

6 Test procedure using the BEP III Before using the BEP III, prepare the test plates and sample dispensing steps (Section 1 and 2 at "Test procedure with the BEP II"). Immediately afterwards place the uncovered test plates (i.e. not covered with adhesive foil) into the BEP III. Note that partially filled test plates need to be made up to at least half plates (6 test strips) by adding "water-filled strips". The test is then processed fully automatically (see BEP III instruction manual). The settings for the incubation times in the BEP III software may differ from the times on the BEP II for technical reasons (system speed) but have been validated for Enzygnost * on the BEP III. Test procedure using the BEP 2000 The sample dispensing steps and subsequent processing of the test are performed fully automatically by the analyzer (see BEP 2000 instruction manual). Validation of the test The individual values of the absorbances of the control sera are used for calculating the mean values if: A neg A Anti-HBs Serum If one of the four absorbance values of the negative controls is outside the specification, this value can be neglected. Both absorbance values of the Anti-HBs Serum 100 must comply with the specification. If these conditions are not fulfilled, the test must be repeated. For the quantitative test the following validation criteria apply: If serial dilutions are used: A neg A standard 5 IU/L If the α - method is used: The individual absorbance readings for the Anti-HBs Serum 100 are used to calculate the mean, if: lower margin < A Anti-HBs Serum 100 < upper margin The values for the lower and upper margins are given in the enclosed table of values. Both absorbance values of the Anti-HBs Serum 100 must fulfil the specification. In addition, the individual values must not differ by more than 20% from the mean of these two values. If these conditions are not met, the test can only be evaluated qualitatively. Evaluation The evaluations are performed automatically if using the BEP 2000 and BEP III. Please consult the relevant instruction manuals. The following sections apply if the measurements are carried out without using a software. Qualitative test: Calculate the mean absorbance of the negative controls, then calculate the cut-off limit by adding 0.08: A neg = Cut-off The test samples are classed as follows based on the criteria of the test: 1. A sample < cut-off = Anti-HBs negative 2. A sample cut-off = Anti-HBs positive OQNE G11 C0541 (906) H/R 6

7 Quantitative test (α - method): A correction factor is calculated for each individual processed test plate and used to correct the absorbance reading of each sample (measurement correction). The corrected readings are then used to calculate the antibody activity (see "Calculation of the results"). Measurement correction The correction factor is calculated from the following formula: Nominal value Correction factor = Mean value of Anti-HBs Serum 100 The nominal value is given in the enclosed table of values. The absorbance readings of the test samples are multiplied by the correction factor. The corrected readings obtained are then used to calculate the results. If several test plates are run, the correction factor has to be determined for each plate separately and used to correct the readings for the appropriate plate. Calculation of the results To calculate the antibody activities the corrected readings of the samples are used in the following formula (α-method): log 10 miu/l = α.a β where α and β and are lot-dependent constants given in the enclosed table of values. The antibody activity result in "IU/L" relates to the WHO International HBV Reference Serum. Important: DO T use the following in the formula: - corrected readings < cut-off - uncorrected readings > 2.5 Calculation example Value given for α Value given for β Corrected reading of a test sample log 10 miu/l (from above formula) gives (see note 1) and the antilog (=miu/l) is (see note 2) and the antibody activity (IU/L) is (see note 3) note 1: If a pocket calculator is used: input 0.950, press x Y, input , press =, press x, input , and press = note 2: After calculating the number in the previous line, press either the 10 X key or the INV and log keys. note 3: To convert to IU/L the prior number must be divided by If the test sample was prediluted (e.g. 1:11) for the test, then the calculated antibody activity (not the signal reading) must be multiplied by 11. Quantitative test (standard series) For the quantitative evaluation, calculate the mean absorbances from each pair of wells in the standard series (5, 10, 25, 50 and 100 IU/L) and use these values to establish a reference curve on double logarithmic paper. Abscissa: Anti-HBs concentration 5 to 100 IU/L. Ordinate: Absorbance 0.05 to 2.0. The anti-hbs concentrations of the samples can then be read from the reference curve on the basis of their absorbances. If the samples were used in diluted form, the concentration read from the reference curve must be multiplied by the appropriate dilution factor. OQNE G11 C0541 (906) H/R 7

8 Limitations of the Procedure 1. Anticoagulants such as heparin, EDTA and citrate do not interfere with the test. 2. Samples that are lipaemic, haemolytic, icteric or contain rheumatoid factors do not impair the test results. 3. In the case of samples from pregnant women, no interference with the test result was observed. 4. Samples containing the following potential sources of interference were checked in the test: HBs antigen, ANA as well as antibodies to HCV, HAV, HBC, HBe, EBV and CMV. With the samples used, no interference was observed with the test result. 5. No interferences were observed with heat-treated samples (30 min, 56 C). 6. Serum from insufficiently coagulated blood, contain sodium azide or microbial contamination should not be used. Any particulate components in the sample (e.g. fibrin clots) should be removed before the test. 7. When using thawed samples, ensure good homogenization of the material prior to use. 8. The pack contains a matched set of reagents. Reagents must not be interchanged with other kits unless the reagents are from an identical lot (i.e. they must display the required 6-digit lot numbers printed on the pack and given in the enclosed barcode table). Washing Solution POD, Stopping Solution POD and Working Chromogen Solution are exceptions to this requirement. Note that the Working Chromogen Solution must first be prepared from matched components (do not use Chromogen TMB and Buffer/Substrat TMB from kits with a different number). 9. Buffer/Substrate TMB, the Working Chromogen Solution and the Stopping Solution POD must not be allowed to come into contact with heavy metal ions or oxidizing substances (do not use pipettes with metal parts in contact with the liquid!). Do not perform the substrate reaction in the proximity of disinfectants containing hypochlorite. If the Working Chromogen Solution has spontaneously developed a blue colour before transferral into the test plate, this indicates that the solution is contaminated; in such cases prepare a fresh solution in a clean container. Skin contact with the above-mentioned solutions is to be avoided. 10. The control sera have been prepared from native human sera. As a result, turbidity may occur but this has no effect on the test result. 11. The test plate should be protected from vibration during the incubation phase (e.g. placed on a secured floatation aid, or in a non-circulating water bath); the wells of the plate must be in contact with the thermostated water. If stabilizers are used to prevent microbial contamination of the water, care must be taken that neither the surface of the test plate nor the wells come into contact with these solutions since such contamination can lead to unspecific reactions. 12. With highly reactive samples the dye may precipitate during the stopping reaction. This does not interfere with the photometric evaluation. 13. Dade Behring has validated use of these reagents on various analyzers to optimize product performance and meet product specifications. User defined modifications are not supported by Dade Behring as they may affect performance of the system and assay results. It is the responsibility of the user to validate modifications to these instructions or use of the reagents on analyzers other than those included in Dade Behring Application Sheets or these instructions for use. 14. Results of this test should always be interpreted in conjunction with the patient s medical history, clinical presentation and other findings. OQNE G11 C0541 (906) H/R 8

9 Specific Performance Characteristics Sensitivity and Specificity The results of the sensitivity and specificity studies are shown in Tables (Appendix). The diagnostic sensitivity was established by investigating 515 anti-hbs-positive samples, and the sensitivity result was 100%. The reactivity of the test in respect to seroconversion samples / vaccination profiles was investigated using 41 profiles. Here it was found that, in detecting seroconversions/vaccination profiles, Enzygnost * Anti-HBs II exhibited a degree of sensitivity comparable with other tests. The analytical sensitivity of the test was established to be < 8 IU/L which was determined by quantitative evaluation (standard curve) using the WHO Reference Preparation. For establishing the specificity of the test, a total of 4736 anti-hbs-negative blood donor samples were investigated and the result was 99.5 to 99.7%. Different values may be obtained in relation to sample population, test procedure, and other factors. Reproducibility The results of the intra-/inter-assay reproducibility study are listed in Table 4 (in the Appendix). These are exemplary data. Differing values may be well obtained depending on various factors such as procedure, etc. * Enzygnost is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in Germany and other countries. BEP is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in the USA, in Germany and other countries. Dade Behring Marburg GmbH 0197 Emil-von-Behring-Str. 76 D Marburg USA Distributor: Dade Behring Inc. Newark, DE U.S.A. OQNE G11 C0541 (906) H/R 9

10 Tab. 1 Storage and Stability Material/reagent State Storage Stability Enzygnost * Anti-HBs II (Test plate) once opened +2 to +8 C 4 weeks in the bag with the desiccant HBsAg/POD Conjugate (anti-hbs II) once opened +2 to +8 C 4 weeks Anti-HBs Serum 100 once opened +2 to +8 C 4 weeks Anti-HBs Serum, negative < -20 C 3 months Chromogen TMB once opened +2 to +8 C expiry date Buffer/Substrate TMB once opened +2 to +8 C expiry date Working Chromogen Solution diluted +2 to +8 C 5 days to +25 C 8 hours in closed container protected from light Washing Solution POD (concentrate) once opened +2 to +8 C expiry date diluted 1:20 +2 to +8 C 1 week diluted 1: to +25 C 1 day Stopping Solution POD once opened +2 to +8 C expiry date use each component by the expiry date at the latest Tab. 2 Sensitivity The sensitivity studies, run at different sample panels, yielded the following data: Sample population Number Enzygnost * Anti-HBs II of samples reactive Anti-HBs positive (Germany) Anti-HBs positive (America) Follow-up samples Anti-HBs positive Different stages of HBV infection HBV vaccinees anti-hbs positive vaccination profiles 32 profiles Sensitivity equivalent seroconversion 9 profiles to that of comparable tests Tab. 3 Specificity The specificity studies, run with samples from different blood banks, yielded the following data: Sample population Number Enzygnost * Anti-HBs II of samples reactive Normal negative sera Normal negative plasmas Normal negative sera Normal negative plasmas OQNE G11 C0541 (906) H/R 10

11 Tab. 4 Reproducibility In the studies on intra-assay reproducibility the samples were tested in 8-fold replicates on each of 5 days at two independent centres (K, E). The CV were calculated by the variance component model. Enzygnost * Anti-HBs II Sample Mean ratio % CV (K) P P P P (E) F F F F F In the studies on inter-assay reproducibility the samples were tested in 8-fold replicates on each of 5 days at two independent centres (K, E). The CV were calculated by the variance component model. Enzygnost * Anti-HBs II Sample Mean ratio % CV (K) P P P P (E) F F F F F Ratio = Absorbance / cut-off OQNE G11 C0541 (906) H/R 11

12 Tab. 5 Test procedure and programming Test procedure (BEP II, BEP III, BEP 2000) BEP II Prepare reagents 4 x 100 µl Control Serum, negative 1 x 100 µl Control Serum, positive 100 µl per undiluted sample 1 x 100 µl Control Serum, positive BEP III 25 µl In the case of partially filled Conjugate plates: Add water-filled strips to make up to half a plate 60 min ± 2 min (37 ± 1 C) Wash 4x: BEP II 100 µl Working Automatic Chromogen Solution processing 30 min ± 2 min +15 C to +25 C protected from light 100 µl Stopping Solution after max. 1 h Evaluate at 450 nm (Referencewavelength: 650 nm) α-method Test result Enzygnost * Anti-HBs II BEP 2000 Menu programming for the BEP II MENU OPERATE 1 WASHINGS ASPIRATE SOAKTIME DISP VOL CHANNEL PHOT OPERATE 2 YES DISPENSE CONJUGATE WASHINGS 0 ASPIRATE SOAKTIME 0 DISP VOL 25 CHANNEL 1 PHOT OPERATE 3 YES WASH AND DISPENSE CHROMOGEN WASHINGS 4 ASPIRATE SOAKTIME 0 DISP VOL 100 CHANNEL 4 PHOT OPERATE 4 YES DISPENSE STOPPING SOLUTION WASHINGS 0 ASPIRATE SOAKTIME 0 DISP VOL 100 CHANNEL 5 PHOT YES MEAS WL 450 REF WL 650 BLK COR EVAL MODE 1 GEN CUT NEG CONT 4 MAX NEG MIN NEG - FACT NEG - MAX POS - THRESH 0.08 CUT OFF - OQNE G11 C0541 (906) H/R 12

13 Enzygnost * Anti-HBs II Anwendungsbereich Enzymimmunoassay zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis B surface Antigen (HBsAg) in Serum und Plasma. Die Abarbeitung des Enzymimmunoassays erfolgt mit den ELISA Prozessoren BEP II, BEP III und BEP Der Test wurde entwickelt für die Untersuchung von Einzelproben, nicht von gepoolten Proben. Das Produkt darf nur für in vitro diagnostische Zwecke angewendet werden. Diagnostische Bedeutung Ebenso wie das Hepatitis B surface Antigen (HBsAg) ist auch der gegen das Oberflächenprotein gerichtete Antikörper Anti-HBs ein wichtiger diagnostischer Parameter einer Infektion mit dem Hepatitis B Virus (HBV) 1, 2. Während der Inkubationszeit und der akuten Phase einer HBV-Infektion sind Antikörper gegen das HBsAg nicht nachweisbar. Die Immunität verleihenden Antikörper Anti-HBs erscheinen in 90 % aller Fälle erst in der späten Rekonvaleszenz ca. 3 bis 4 Monate nach Erkrankungsbeginn, wenn zirkulierendes HBsAg bereits nicht mehr nachweisbar ist 3, 4. Diese Serokonversion, d.h. der Übergang von Anti-HBs-negativ zu -positiv, stellt einen recht zuverlässigen Parameter für eine überstandene HBV-Infektion dar, zumal auch ca. 10 % von akut infizierten Patienten, bei denen in der Frühphase kein HBsAg nachweisbar ist, später Anti- HBs-positiv werden. Daher eignet sich der Anti-HBs-Nachweis auch zur Diagnose von inapparent verlaufenden HBV-Infektionen 3, 4. Da ein positiver Nachweis von Anti-HBs auf eine vorausgegangene Exposition mit diesem Antigen entweder durch eine HBV-Infektion oder in Form eines Impfstoffes hinweist, ergeben sich als wichtigste Anwendungen der Anti-HBs-Bestimmung die folgenden Untersuchungen: a) Beurteilung der Rekonvaleszenz und in gewissem Umfang auch Prognose bei HBV-infizierten Patienten (Verlaufskontrolle). b) Serologische Untersuchungen im Rahmen von Impfprogrammen (Screening und Immunisierungskontrolle). c) Epidemiologische Erhebungen. Neben dem qualitativen Anti-HBs-Nachweis hat die quantitative Ermittlung von Anti-HBs unter dem Gesichtspunkt der aktiven Immunisierung eine eigene Bedeutung erlangt. Gemäß einer Empfehlung der WHO kann von einem Infektionsschutz nach einer Schutzimpfung dann ausgegangen werden, wenn sich im Serum oder Plasma eine Anti-HBs-Konzentration von > 10 IU/l nachweisen läßt. Es werden rechtzeitige Auffrischungsimpfungen empfohlen, um sicherzustellen, daß dieser Grenzwert nicht unterschritten wird 5, 6, 7. Bei Anti-HBs Werten < 100 IU/l nach der Grundimmunisierung ist, gemäß den Impfempfehlungen der Ständigen Impfkommision des Robert-Koch-Institutes (Deutschland) (STIKO, Stand Oktober 1995), eine Auffrischimpfung innerhalb eines Jahres indiziert. Unterstrichen wird die Notwendigkeit einer Quantifizierung ferner durch die Tatsache, daß die Dauer des Impfschutzes proportional zur erreichten Anti-HBs-Konzentration nach Impfung ist. Prinzip der Methode Bei Enzygnost * Anti-HBs II handelt es sich um einen nach dem Sandwich-Prinzip aufgebauten Einschrittassay. Als Festphasen- und Konjugatantigen wird humanes HBsAg eingesetzt. Peroxidase-markiertes HBsAg bindet sich an die in der Probe enthaltenen HBs-spezifischen Antikörper. Diese binden sich an das an der Oberfläche der Mikrotitrationsplatte gebundene HBsAg (Antigen-Sandwich). Nach Entfernung der ungebundenen Bestandteile durch Waschen wird die gebundene Enzymaktivität des Konjugates bestimmt. Die enzymatische Umsetzung von Substrat und Chromogen (blaue Farbreaktion) wird durch Zusatz von Stopplösung POD unterbrochen (gelbe Farbreaktion). Die Farbintensität ist der in der Probe vorhandenen Antikörperkonzentration proportional. Die Quantifizierung erfolgt durch Berechnung nach der α-methode oder durch Vergleich mit einer Standardkurve. OQNE G11 C0541 (906) H/R 13 Ausgabe Februar 2004

14 Reagenzien Inhalt der Handelspackung Enzygnost * Anti-HBs II 1 x x 96 Enzygnost * Anti-HBs II 1 Testplatte 10 Testplatten HBsAg/POD-Konjugat (Anti-HBs II) 1 x 6 ml 10 x 6 ml Anti-HBs-Serum x 1,5 ml 3 x 1,5 ml Anti-HBs-Serum, negativ 2 x 14 ml 5 x 14 ml Waschlösung POD (Konzentrat)** 1 x 100 ml 2 x 100 ml Puffer/Substrat TMB** 1 x 30 ml 4 x 30 ml Chromogen TMB** 1 x 3 ml 4 x 3 ml Stopplösung POD** 1 x 100 ml 2 x 100 ml Leerflasche für Chromogen-Gebrauchslösung 1 Stück 1 Stück Abklebefolien 6 Stück 24 Stück PE-Beutel 1 Stück 1 Stück Barcodewertetabelle 1 Stück 1 Stück Packungsbeilage 1 Stück 1 Stück Weitere Handelspackung: 100 x 96 ** Diese Komponenten sind auch Bestandteile der Packung Zusatz-Reagenzien für Enzygnost* TMB (Bestell-Nr. OUVP). Zusammensetzung Enzygnost * Anti-HBs II (Testplatte): Mit inaktiviertem HBsAg (Subtypen ad und ay), das aus Human-Blut isoliert wurde, beschichtete Mikrotitrationsplatte. HBsAg/POD-Konjugat (Anti-HBs II): inaktiviertes HBsAg, Peroxidase (POD)-konjugiert aus Human-Blut, Tris (ca. 100 g/l), NaCl (ca. 47 g/l) Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l) Anti-HBs-Serum 100: Anti-HBs-Humanserum (nominell 100 ± 25 IU/l), bezogen auf das WHO- Referenz-Präparat, Extinktionsrichtwert: 0,7. Konservierungsmittel: Amphotericin (ca. 5 mg/l) Gentamicin (ca. 100 mg/l) Anti-HBs-Serum, negativ: Humanserum, Extinktionsrichtwert: 0,12 Konservierungsmittel: Amphotericin (ca. 5 mg/l) Gentamicin (ca. 100 mg/l) Waschlösung POD (Konzentrat): Tween-haltige Phosphat-Pufferlösung (90 mmol/l) Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l) Puffer/Substrat TMB: Wasserstoffperoxid (ca. 0,1 g/l) in Acetat-Pufferlösung (25 mmol/l) Konservierungsmittel: n-butanol (max. 10 ml/l) Chromogen TMB: Tetramethylbenzidin-dihydrochlorid (5 g/l) Stopplösung POD: 0,5 N Schwefelsäure Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen 1. Nur zur in vitro diagnostischen Anwendung. 2. Jede individuelle Blutspende, die zur Herstellung der Kontrollen von Enzygnost * Anti-HBs II vorgesehen war, wurde auf HBsAg, auf Anti-HCV, auf Anti-HIV1 und auf Anti-HIV2 untersucht. Für die Herstellung wurden nur Spenden mit negativem Befund verwendet. Unabhängig davon sollten alle aus menschlichem Blut gewonnenen Materialien wegen nie auszuschließender Gefährdung durch Krankheitserreger mit angemessener Sorgfalt unter Einhaltung der bei Biogefährdung empfohlenen Sicherheitsmaßnahmen gehandhabt werden 8. OQNE G11 C0541 (906) H/R 14

15 3. Das zur Herstellung der Testplatten und des POD-Konjugates verwendete HBsAg wurde aus HBsAg-positiven Human-Plasmen, die negativ hinsichtlich Anti-HCV, Anti-HIV1 und Anti- HIV2 befundet wurden, in hoher Reinheit isoliert und einem anerkannten Inaktivierungsverfahren unterworfen. 4. Das Tragen von Untersuchungshandschuhen während der gesamten Testdurchführung wird angeraten. 5. Für die Entsorgung fester infektiöser Materialien empfiehlt sich eine Autoklavierung von mindestens 1 Stunde bei +121 C. Alle abgesaugten Lösungen sind in zwei hintereinandergeschalteten Vorlagen zu sammeln. Die Vorlagen sollten ein Desinfektionsmittel enthalten, das geeignet ist, human-pathogene Viren zu inaktivieren. Die vom Hersteller angegebenen Konzentrationen und Einwirkungszeiten müssen beachtet werden. Vorbereitung der Reagenzien Alle Reagenzien und Proben vor Testbeginn auf +15 bis +25 C erwärmen. Dabei die Testplatte nicht dem Behältnis entnehmen. Für die Testdurchführung nicht benötigte Riegel dem Halterahmen entnehmen und für die spätere Verwendung lagern (siehe Tabelle 1). Je Testplatte 20 ml Waschlösung POD mit destilliertem oder entionisiertem Wasser auf 400 ml verdünnen. Je Testplatte 1 ml Chromogen TMB mit 10 ml Puffer/Substrat TMB in der mitgelieferten Leerflasche verdünnen (Chromogen-Gebrauchslösung) und verschlossen unter Lichtschutz aufbewahren. Flasche nach Gebrauch sorgfältig mit destilliertem Wasser spülen. Wegen technisch bedingter Überfüllung ist das Überführen des Flascheninhalts von Chromogen TMB in die Abfüllung Puffer/Substrat TMB nicht zulässig. Vorverdünnung der Proben: Für die quantitative Testdurchführung sollten die Proben bei zu erwartenden Anti-HBs-Konzentrationen von 100 IU/l wie folgt verdünnt werden: Bis 1000 IU/l Verdünnung 1:10 (z.b. 20 µl Probe µl Anti-HBs-Serum, negativ). Bis IU/l Verdünnung 1:100 (z.b. 20 µl Probe µl Anti-HBs-Serum, negativ; daraus 20 µl µl Anti-HBs-Serum, negativ). Bis IU/l Verdünnung1:1000 (z.b. 20 µl Probe µl Anti-HBs-Serum, negativ; daraus 20 µl µl Anti-HBs-Serum, negativ; daraus 20 µl µl Anti-HBs-Serum, negativ). Wenn die quantitative Testdurchführung mit einer Standardreihe durchgeführt wird, müssen von dem Anti-HBs-Serum 100 zusätzlich folgende Verdünnungen mit dem Anti-HBs-Serum, negativ hergestellt werden (gilt nicht für die Auswertung mit α-methode): 50 IU/l: Verdünnung 1:2 (z.b. 200 µl Anti-HBs-Serum µl Anti-HBs-Serum, negativ) 25 IU/l: Verdünnung 1:4 (z.b. 150 µl des 50 IU/l Serum µl Anti-HBs-Serum, negativ) 10 IU/l: Verdünnung 1:10 (z.b. 50 µl Anti-HBs-Serum µl Anti-HBs-Serum, negativ) 5 IU/l: Verdünnung 1:20 (z.b. 150 µl des 10 IU/l Serum µl Anti-HBs-Serum, negativ) Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen Ungeöffnet sind alle Bestandteile der Kombinationspackung Enzygnost * Anti-HBs II bei einer Lagertemperatur von +2 bis +8 C bis zu den auf den Etiketten angegebenen Daten verwendbar. Die Haltbarkeit und Lagerbedingungen der geöffneten bzw. gebrauchsverdünnten Reagenzien sind der Tabelle 1 in der Anlage zu entnehmen. Erforderliche Geräte BEP II: Zur automatischen Durchführung der Reagenzien-Dosierung und der Waschschritte BEP III: Zur automatischen Testabarbeitung nach der Probendosierung sowie Auswertung BEP 2000: Zur vollautomatischen Testabarbeitung sowie Auswertung Pipetten: Kolbenhubpipetten: 25, 100 und 1000 µl Inkubator: Bedecktes Wasserbad (+37 ± 1 C) oder vergleichbare Inkubationsmethoden Alle zur Testdurchführung eingesetzten Geräte müssen validiert sein. OQNE G11 C0541 (906) H/R 15

16 Untersuchungsmaterial Zur Untersuchung können Einzelproben (Human-Seren oder -EDTA/Heparin/Citrat-Plasmen) verwendet werden, welche nach Standard-Labortechniken entnommen wurden. Die Proben sollen maximal 3 Tage bei 2-8 C gelagert werden. Zur längeren Lagerung sind die Proben einzufrieren. Testdurchführung Testdurchführung mit BEP II 1. Ansatzschema: Benötigte Anzahl der Vertiefungen feststellen (= Anzahl der zu untersuchenden Proben plus 6 Vertiefungen für die Kontrollen). 2. Proben-Dosierung: Qualitativer Test/Quantitativer Test (α - Methode): In 4 Vertiefungen (A1 bis D1) je 100 µl Anti-HBs-Serum, negativ, in eine Vertiefung (E1) 100 µl Anti-HBs-Serum 100, in die folgenden Vertiefungen je 100 µl Probe und am Ende der Serie bzw. Testplatte noch einmal 100 µl Anti-HBs-Serum 100 einpipettieren. Die Pipettiervorgänge müssen zügig innerhalb von 15 min pro Testplatte durchgeführt werden. Wichtig: Es ist unzulässig, zunächst das Anti-HBs-Serum 100 in die beiden vorgesehenen Positionen zu pipettieren und anschließend die Proben "dazwischenzuschieben". Quantitativer Test (Standardreihe): In 4 Vertiefungen je 100 µl Anti-HBs-Serum, negativ und anschließend in jeweils 2 Vertiefungen je 100 µl des Anti-HBS-Serums entsprechend 100, 50, 25, 10 und 5 IU/l pipettieren. In die folgenden Vertiefungen je 100 µl Probe (evtl. nach Bedarf vorverdünnt) dosieren. Die Konjugat-Dosierung unmittelbar nach Beendigung der Proben-Dosierung anschließen. 3. Konjugat-Dosierung: In jede Vertiefung 25 µl des HBsAg/POD-Konjugates (Anti-HBs II) einfüllen. Anschließend mit Folie abkleben und die Platte unmittelbar nach Beendigung der Konjugat-Dosierung in den Inkubator stellen. 4. Inkubation: 60 ± 2 min bei 37 ± 1 C inkubieren, Waschvorgang unmittelbar anschließen. 5. Waschen: Folie abziehen, alle Vertiefungen aussaugen und mit je ca. 0,3 ml Waschlösung 4mal waschen. Nach Abschluß der Waschschritte die Substrat-Dosierung sofort anschließen, um ein Eintrocknen zu vermeiden. 6. Substrat-Dosierung: In jede Vertiefung 100 µl der Chromogen-Gebrauchslösung einfüllen, Platte mit neuer Folie abkleben. 7. Substrat-Inkubation: 30 ± 2 min bei +15 bis +25 C lichtgeschützt inkubieren. 8. Stoppreaktion: Die Folie entfernen. Je Vertiefung 100 µl Stopplösung POD zugeben, dabei den gleichen Zeittakt wie bei Punkt 6. einhalten. 9. Messung: Innerhalb einer Stunde bei 450 nm photometrieren. Als Wellenlänge der Referenzmessung wird 650 nm (ggf. zwischen 615 und 690 nm) empfohlen. Testdurchführung mit BEP III Bei der Abarbeitung mit BEP III müssen die Testplatten einschließlich der Probendosierung (Punkt 1 und 2 der "Testduchführung BEP II") vorbereitet werden. Unmittelbar im Anschluss daran werden die Testplatten offen, d. h. nicht mit Folie abgeklebt, in den BEP III eingegeben. Dabei ist zu beachten, dass teilbestückte Testplatten mit "Wasserriegeln" auf mindestens halbe Testplatten (6 Testriegel) zu ergänzen sind.die anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch (siehe BEP III-Bedienungsanleitung). Die in der BEP III Software eingestellten Inkubationszeiten können auf Grund der technischen Rahmenbedingungen (Gerätetaktung) von denen der BEP II Prozessierung abweichen, sind jedoch in der Kombination BEP III/Enzygnost * validiert worden. Testdurchführung mit BEP 2000 Die Probendosierung und anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch im Gerät (siehe BEP 2000-Bedienungsanleitung). OQNE G11 C0541 (906) H/R 16

17 Testvalidierung Die Einzelwerte der Extinktionen für die Kontroll-Sera werden zur Berechnung der Mittelwerte eingesetzt, wenn: -0,010 E neg. 0,120 E Anti-HBs-Serum 100 0,7 Von den Extinktionswerten der negativen Kontrollen kann ein außerhalb der Spezifikation liegender Wert vernachlässigt werden. Die Extinktionswerte des Anti-HBs-Serum 100 müssen beide die Spezifikation erfüllen. Werden diese Bedingungen nicht erfüllt, ist der Test zu wiederholen. Für den quantitativen Test gelten folgende Validierungskriterien: Bei Verwendung der Standardreihe: E neg. E Standard 5 IU/l Bei Verwendung der α - Methode: Die Einzelwerte der Extinktionen für das Anti-HBs-Serum 100 werden zur Berechnung des Mittelwertes eingesetzt wenn: untere Toleranzgrenze < E Anti-HBs-Serum 100 < obere Toleranzgrenze Die Werte für die untere und obere Toleranzgrenze sind in der beiliegenden Wertetabelle angegeben. Beide Extinktionswerte des Anti-HBs-Serum 100 müssen die Spezifikation erfüllen. Zusätzlich dürfen die Einzelwerte maximal 20 % vom Mittelwert dieser beiden Bestimmungen abweichen. Werden diese Bedingungen nicht erfüllt, ist der Test nur qualitativ auswertbar. Testauswertung Die Auswertungen erfolgen mit BEP 2000 und BEP III automatisch. Bitte dazu die Bedienungsanleitungen heranziehen. Die nachfolgenden Kapitel sind bei Auswertung ohne Softwareunterstützung zu beachten. Qualitativer Test: Aus den Extinktionswerten der negativen Kontrollen wird der Mittelwert gebildet. Zur Grenzwertberechnung wird zum Extinktionsmittelwert der negativen Kontrollen ein Wert von 0,08 addiert: E neg. + 0,08 = Grenzwert (cut off) Nach den Kriterien des Tests werden die Untersuchungsproben wie folgt klassifiziert: 1. E Probe < cut off = Anti-HBs-negativ 2. E Probe cut off = Anti-HBs-positiv Quantitativer Test (α - Methode): Für jeden einzelnen Testplattenansatz wird ein Korrekturfaktor ermittelt, mit dem der gemessene Extinktionswert jeder Probe korrigiert wird (Meßwertkorrektur). Die korrigierten Meßwerte werden anschließend zur Berechnung der Antikörperaktivität eingesetzt (Ergebnisberechnung). Meßwertkorrektur Der Korrekturfaktor wird nach folgender Formel ermittelt: Nominalwert Korrekturfaktor = Mittelwert Anti-HBs-Serum 100 Der Nominalwert ist in der beiliegenden Wertetabelle angegeben. Die Extinktionswerte der Untersuchungsproben werden mit dem Korrekturfaktor multipliziert. Die erhaltenen korrigierten Meßwerte werden dann zur Ergebnisberechnung eingesetzt. OQNE G11 C0541 (906) H/R 17

18 Bei mehreren Testplatten ist der Korrekturfaktor für jede Platte neu zu ermitteln und für die entsprechende Korrekturrechnung einzusetzen. Ergebnisberechnung Die korrigierten Meßwerte der Untersuchungsproben werden zur Berechnung der Antikörperaktivität in die nachfolgende Formel eingesetzt (α - Methode): log 10 miu/l = α. E β Die chargenabhängigen Konstanten α und β sind hierfür der beigepackten Wertetabelle zu entnehmen. Die Angabe der Antikörperaktivität in IU/l bezieht sich auf das internationale HBV- Referenzserum der WHO. Achtung: Zur Berechnung werden nicht eingesetzt: - Meßwerte korrigiert < cut off - Meßwerte unkorrigiert > 2,5 Rechenbeispiel Rechenwert für α 4,8239 Rechenwert für β 0,1054 korrigierter Meßwert einer Untersuchungsprobe 0,950 log 10 miu/l (nach obiger Formel) 4,7979 (siehe Anm. 1) davon der Numerus (in miu/l) (siehe Anm. 2) bzw. die Antikörperaktivität (IU/l) 62,79 (siehe Anm. 3) Anm. 1:Taschenrechnereingaben: 0,950 Taste x y, Eingabe 0,1054, Taste =, Taste x, Eingabe 4,8239, Taste = Anm. 2:nach der vorstehend ermittelten Zahl dann entweder Taste 10 x oder Tasten INV und log betätigen. Anm. 3:zur Umrechnung in die Einheit IU/l muß die vorstehende Zahl durch geteilt werden. Wurde die Untersuchungsprobe zur Bewertung vorverdünnt (z. B. 1:11), so ist die errechnete Antikörperaktivität (nicht das Meßsignal) mit 11 zu multiplizieren. Quantitativer Test (Standardreihe): Zur quantitativen Auswertung werden die Extinktionsmittelwerte aus den Doppelbestimmungen für die Standardreihe mit 5, 10, 25, 50 und 100 IU/l gebildet, und auf doppellogarithmischem Papier wird eine Bezugskurve erstellt. Abszisse: Anti-HBs Konzentration 5 bis 100 IU/l. Ordinate: Extinktion 0,05 bis 2,0. Aus der Bezugskurve werden anhand der einzelnen Extinktionen die Anti-HBs Konzentrationen der Proben abgelesen. Wurden die Proben verdünnt eingesetzt, so muß die auf der Bezugskurve abgelesene Konzentration mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert werden. Einschränkungen der Testdurchführung 1. Antikoagulantien wie Heparin, EDTA und Citrat beeinflussen das Testergebnis nicht. 2. Lipämische, rheumafaktorhaltige, hämolytische oder ikterische Proben führen zu keiner Testbeeinträchtigung. 3. Mit Proben von Schwangeren wurde keine Beeinflussung des Testergebnisses beobachtet. 4. Proben mit folgenden potentiell störenden Substanzen wurden mit dem Test überprüft: HBs- Antigen, ANA sowie Antikörper gegen HCV, HAV, HBC, HBe, EBV und CMV. Mit den eingesetzten Proben wurde keine Beeinflussung des Testergebnisses beobachtet. 5. Bei hitzebehandelten Proben (30 min, 56 C) wurden keine Störungen beobachtet. 6. Ungenügend geronnene Seren, natriumazidhaltiges Probenmaterial und mikrobiell kontaminierte Untersuchungsproben sollten nicht eingesetzt werden. Eventuell vorhandene partikuläre Komponenten (z. B. Fibrin-Gerinnsel) sollten vor der Testdurchführung entfernt werden. 7. Bei aufgetauten Proben ist auf eine gute Homogenisierung des Materials zu achten. OQNE G11 C0541 (906) H/R 18

19 8. Die Reagenzien (ausgenommen Waschlösung POD, Stopplösung POD und die aus den chargengebundenen Reagenzien Chromogen TMB und Puffer/Substrat TMB hergestellte Chromogen-Gebrauchslösung) sind nur chargengebunden zu verwenden, d.h. nur in der Kombination der einzelnen 6-ziffrigen Chargen-Bezeichnungen, die auf der Packung aufgedruckt bzw. der separat beigepackten Barcode-Tabelle zu entnehmen sind. 9. Puffer/Substrat TMB, Chromogen-Gebrauchslösung und Stopplösung POD dürfen nicht in Kontakt mit Schwermetallionen oder oxidierenden Substanzen kommen (keine Pipetten mit flüssigkeitsführenden Metallteilen verwenden). Die Substratreaktionen nicht in der Nähe von Hypochlorit-haltigen Desinfektionsmitteln durchführen. Eine spontane Blaufärbung der Chromogen-Gebrauchslösung vor der Übertragung in die Testplatte deutet auf Kontamination hin; eine frische Lösung ist in einem sauberen Gefäß anzusetzen. Hautkontakt mit den vorgenannten Lösungen ist zu vermeiden. 10. Die Kontrollsera sind unter Verwendung nativer Humansera hergestellt. Daher können Trübungen auftreten, die das Testergebnis jedoch nicht beeinflussen. 11. Die Testplatte soll während der Inkubation ruhig liegen (z.b. auf fixierter Schwimmhilfe oder im nicht zirkulierenden Wasserbad); die Kavitäten sind dabei in Kontakt mit dem temperierten Wasser. Werden Stabilisatoren zur Verhinderung der Verkeimung des Wassers verwendet, so ist sorgfältig darauf zu achten, daß weder die Testplattenoberfläche noch die Näpfchen mit diesen Lösungen in Kontakt kommen, da dadurch unspezifische Reaktionen hervorgerufen werden könnten. 12. Bei stark reaktiven Proben kann bei der Stoppreaktion der Farbstoff ausfallen. Die photometrische Auswertung wird dadurch nicht beeinflußt. 13. Dade Behring hat den Einsatz dieser Reagenzien auf verschiedenen Analysengeräten auf optimale Produktleistung und Einhaltung der Produktspezifikationen überprüft. Vom Benutzer vorgenommene Änderungen werden von Dade Behring nicht unterstützt, da sie die Leistung des Systems und die Testergebnisse beeinflussen können. Es liegt in der Verantwortung des Benutzers, Änderungen an diesen Anleitungen oder die Verwendung dieser Reagenzien auf anderen als in den Applikationsvorschriften von Dade Behring oder diesen Gebrauchsanweisungen genannten Analysengeräten zu validieren. 14. Resultate dieses Tests sollten stets in Verbindung mit der Vorgeschichte des Patienten, dem klinischen Bild und anderen Untersuchungsergebnissen interpretiert werden. Leistungsmerkmale des Tests Sensitivität und Spezifität Die Ergebnisse zur Prüfung der Sensitivität und Spezifität sind in den Tabellen (im Anhang) zusammengefaßt. Bei der Ermittlung der diagnostischen Sensitivität wurden insgesamt 515 Anti-HBs-positive Proben untersucht und eine Sensitivität von 100 % ermittelt. Die Reaktivität des Testes bei Serokonversionsproben/Impfverläufen wurde anhand von 41 Verläufen untersucht. Dabei zeigte sich, daß Enzygnost * Anti-HBs II eine Sensitivität bezüglich der Erkennung von Serokonversionen/ Impfverläufen aufweist, die der Empfindlichkeit vergleichbarer Teste entspricht. Die analytische Sensitivität wurde bei quantitativer Auswertung (Standardkurve) am WHO-Referenz-Präparat mit < 8 IU/l ermittelt. Bei der Ermittlung der Spezifität wurden insgesamt 4736 Anti-HBs-negative Blutspendeproben untersucht und eine Spezifität von 99,5 bis 99,7 % ermittelt. Bedingt durch das Untersuchungskollektiv, die Testdurchführung u.a. sind abweichende Werte möglich. Reproduzierbarkeit Die Ergebnisse zur Intra/Inter-assay-Reproduzierbarkeit sind in der Tabelle 4 (im Anhang) zusammengefaßt. Es handelt sich hierbei um beispielhaft ermittelte Daten. Abhängig von der Testdurchführung u.a. sind durchaus abweichende Werte möglich. * Enzygnost ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in Deutschland und anderen Ländern. BEP ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in den USA, Deutschland und anderen Ländern. Dade Behring Marburg GmbH 0197 Emil-von-Behring-Str. 76 D Marburg OQNE G11 C0541 (906) H/R 19

20 Tab. 1 Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen Material/Reagenz Zustand Lagerung Stabilität Enzygnost * Anti-HBs II (Testplatte) nach Öffnen +2 bis +8 C 4 Wochen im Beutel mit Trockenkapseln HBsAg/POD-Konjugat (Anti-HBsII) nach Öffnen +2 bis +8 C 4 Wochen Anti-HBs-Serum 100 nach Öffnen +2 bis +8 C 4 Wochen Anti-HBs-Serum, negativ < -20 C 3 Monate Chromogen TMB nach Öffnen +2 bis +8 C bis Verfallsdatum Puffer/Substrat TMB nach Öffnen +2 bis +8 C bis Verfallsdatum Chromogen-Gebrauchslösung verdünnt +2 bis +8 C 5 Tage bis +25 C 8 Stunden geschlossenes Gefäß lichtgeschützt Waschlösung POD (Konzentrat) nach Öffnen +2 bis +8 C bis Verfallsdatum verdünnt 1:20 +2 bis +8 C 1 Woche verdünnt 1: bis +25 C 1 Tag Stopplösung POD nach Öffnen +2 bis +8 C bis Verfallsdatum in keinem Fall länger als bis zum Verfallsdatum Tab. 2 Sensitivität Bei den Untersuchungen zur Sensitivität wurden anhand von unterschiedlichen Probenkollektiven folgende Daten ermittelt: Enzygnost * Anti-HBs II Probenkollektiv Probenanzahl reaktiv Anti-HBs positiv (Deutschland) Anti-HBs positiv (Amerika) Verlaufskontrollproben Anti-HBs positiv verschiedene Stadien einer HBV-Infektion HBV-Geimfte Anti-HBs-positiv Impfverläufe 32 Verläufe Sensitivität entspricht Serokonversion 9 Verläufe der Empfindlichkeit vergleichbarer Teste Tab. 3 Spezifität Bei den Untersuchungen zur Spezifität wurden anhand von Proben unterschiedlicher Blutbanken folgende Daten ermittelt: Enzygnost * Anti-HBs II Probenkollektiv Probenanzahl reaktiv normal negative Seren normal negative Plasmen normal negative Seren normal negative Plasmen OQNE G11 C0541 (906) H/R 20