Electroforesis de ácidos nucléicos en geles de poliacrilamida

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1 1 Electroforesis de ácidos nucléicos en geles de poliacrilamida Introducción La electroforesis en geles de poliacrilamida es utilizada para ver secuencias de ADN de bajo peso molecular, entre 80pb y 300pb. Ha sido ampliamente utilizada para el trabajo con microsatélites o SSR en la construcción de mapas de ligamiento, estudios poblacionales y en la selección asistida por marcadores moleculares (MAS). Adicionalmente es una herramienta útil para el aislamiento de pequeñas secuencias cuyo trabajo se dificulta en geles de menor resolución, geles de agarosa. La técnica consiste en la elaboración de una fina capa de gel de acrilamida adherida a una lámina de vidrio por la cual migra el ADN. Al igual que en un gel de agarosa, la migración responde a la carga negativa neta de la molécula de ADN y la concentración del gel. Las secuencias de ADN más pequeñas migran a mayor velocidad mientras que las grandes se quedan atrás. La técnica se lleva a cabo en cinco pasos: el montaje de la cámara de electroforesis, la preparación de la solución de poliacrilamida y el llenado de la cámara, la pre-corrida del gel, la corrida de las muestras y la tinción del gel. Los geles de poliacrilamida pueden ser desnaturalizantes o no. Los que los son, se utilizan para la corrida de microsatélites. Estos presentan altas concentraciones de urea (5M) y son corridos a elevadas temperaturas (50-55 o C), permitiendo que las hebras de ADN permanezcan separadas durante la electroforesis. Priori a la servida de este tipo de gel, los productos de PCR son desnaturalizados, a fin de incrementar la resolución de la separación, mediante calentamiento a 95 o C y tratamiento con formamida. La visualización de las bandas puede hacerse directamente por tinción con bromuro de etidio (geles de agarosa) o nitrato de plata, a través de autoradiografía utilizando iniciadores marcados con radioisótopos en la reacción de PCR o mediante fluorescencia cuando se utilizan geles de secuenciación. La detección mediante fluorescencia es el método analítico con mayor sensibilidad, mientras que la detección radioactiva y mediante tinción con AgNO 3 tienen sensibilidad equivalente (Comincini et al. 1995, Christensen et al. 1999, Creste et al. 2001). La detección en geles de poliacrilamida teñidos con nitrato de plata ofrece, según nuestra experiencia, la mejor relación costo-beneficio. Aunque laboriosa esta metodología ofrece una alta resolución, requiere de equipos poco sofisticados. La detección mediante fluorescencia, en contraste, es costosa pues requiere de equipos sofisticados, cuya adquisición sólo se justifica en aquellos laboratorios que manejan grandes volúmenes de muestras. La detección radiactiva requiere P 32, el cual es costoso. Adicionalmente, este radioisótopo representa riesgos para la salud por lo que su manejo en el laboratorio requiere de equipamiento de seguridad que aumentan los costos de la detección. Existen diversos protocolos para la tinción del ADN en geles de poliacrilamida con AgNO 3 (Beidler et al. 1982, Bassam et al. 1991, Sanguinetti et. al. 1994). En este protocolo se sigue el

2 2 método propuesto por Beidler et al. 1982, con pequeñas modificaciones. Estudios comparativos han demostrado que este método tiene una alta sensibilidad de detección y exhibe poco problemas de background en relación a otras metodologías (Creste et al. 2001). La tinción con AgNO 3 consta de varias etapas o pasos cuyos tiempos de incubación son críticos para la obtención de buenos resultados. La preparación de soluciones para la tinción requiere agua de excelente calidad (bidestilada y desionizada). Estas soluciones pueden ser reutilizadas un número limitado de veces. Los pasos de lavado de los geles también requieren de agua bidestilada. De especial cuidado con la metodología de tinción con AgNO 3 es todo lo relativo a la limpieza y manejo de las cámaras de electroforesis utilizadas. El manejo de estas cámaras requiere de un espacio de trabajo bien estructurado a fin de minimizar accidentes que podrían ocurrir durante la preparación y corrida de los geles, el lavado de los vidrios, o los distintos pasos del proceso de tinción. Aquí describimos el ensamblaje y preparación de dos modelos comerciales de cámaras de electroforesis. Sin embargo, los principios son aplicables a otros modelos. El tratamiento de desechos luego de los procesos de electroforesis y tinción son de vital importancia a fin de evitar la contaminación de los espacios de trabajo y del personal. La solución de AgNO 3 debe ser precipitada con sales y filtrada antes de ser descartada en el lavaplatos. Los restos de poliacrilamida, luego del desprendimiento de geles, al igual que todos aquellos desechables en contacto con ella (servilletas, guantes, puntas, etc.), deben ser depositados en bolsas plásticas aptas para incineración debidamente etiquetadas. 1. Montaje de la cámara de electroforesis preparación de la solución de poliacrilamida, llenado del gel y pre-corrida del gel En este segmento se explica el montaje de dos tipos de cámaras de electroforesis, una es de Bio- Rad modelo Sequi-Gen GT Systems, que a diferencia de la segunda tiene un compartimiento detrás del vidrio al que no se adhiere el gel, el cual va lleno del buffer de corrida TBE. Esto permite que la corriente circule a través del sistema y caliente el vidrio a una temperatura controlada y homogénea en toda su superficie. El segundo modelo es una cámara de secuenciación dual de CBF Scientific, esta es una cámara de electroforesis tradicional compuesta por dos vidrios que se unen mediante cinta adhesiva a los que se le ajusta una lámina de aluminio que permite el calentamiento controlado del gel. Ambas cámaras comparten el tratamiento de los vidrios pero se diferencian en el ensamblaje y corrida del gel. La preparación de las cámaras y geles debe hacerse utilizando siempre guantes ya que la acrilamida en una substancia neurotóxica que se absorbe por la piel. Lo ideal es trabajar en espacios separados, uno donde se trabaja el vidrio donde va adherido el gel un espacio diferente para trabajar el otro vidrio.

3 Materiales - Baldes de 8 L -Bandejas plásticas con tapa (70cm largo, 60cm ancho,10cm de profundidad) -Beakers (250 ml, 500mL, 1L, 2L, 4L) -Cinta adhesiva para cubrir las placas de PCR -Embudos -Frascos ámbar (4L) -Gafas de protección -Gaza -Gradillas -Guantes de látex -Guantes de nitrilo -Magnetos -Papel filtro Whatman 1 y 2 -Peines tiburón 68 pozos y 100 pozos -Probetas (10 ml, 100mL, 500mL, 1L, 2L) - -Soporte para pipetas -Tapas para placas flexibles -Termómetro -Toallas Kimwipe -Tubos de micro-centrifuga (1-2 ml) -Vidrios adicionales para cámaras de electroforesis vertical 1.2. Equipos -Balanza analítica -Balanza digital -Baño María -Bloque térmico -Bomba de vacío -Campana de extracción -Cámara de electroforesis vertical -Escáner -Congelador -20 C -Congelador -80 C -Nevera 4 C -Fuente de poder 3000 V -Horno microondas -Microcentrifuga -Máquina de hielo -Ph-metro digital -Pipetas ul, 1-10 ul, ul, ul -Pipeta multicanal (Hamilton) para servir muestras en el gel de acrilamida (1- -Placa de agitación -Termociclador

4 s -Acido acético glacial -Ácido bórico -Acetato de potasio -Acetato de sodio -Acrilamida -Agua deionizada, agua bidestilada -Azul de bromofenol -Bind silane -Bis-acrilamida -EDTA -Etanol grado molecular -Etanol técnico -Formaldehido (37%) -Formamida redestilada -Nitrato de plata -Persulfato de amonio -SIGMACOTE o Repel-silane -TBE 10X -TEMED -Tiosulfato de sodio -Trizma base -Urea -Xylene Cyanol 1.4 Preparación de Soluciones A) Soluciones de poliacrilamida Acrilamida 6%, 5 M de urea (1 L) Acrilamida 57 g Bis Acrilamida 3 g TBE 10X 50 ml Urea 300,3 g Acrilamida:bisacrilamida (19:1) al 4%, 5 M urea (1L) Aclilamida y bisacrilamida 40 g TBE 10X 50 ml Urea 300,3 g

5 5 Acrilamida:bisacrilamida (19:1) al 6%, 5 M urea (1 L) Aclilamida y bisacrilamida 60 g TBE 10X 50 ml Urea 300,3 g En todos los casos, disuelva la acrilamida en 500 ml de agua doblemente deionizada tibia y agregue el TBE, después agregue la urea y complete el volumen. Filtre la acrilamida con papel Whatman 2 Prepare la solución en la campana de extracción con máscara de protección y guantes. Evite exponer a la luz Almacene la solución a 4 C. B) Etanol-Ácido Acético (50 ml) Etanol grado molecular 95% Acido acético glacial 50 ml Agregue el ácido acético a la solución en la campana de extracción. Almacene la solución a temperatura ambiente. C) Persulfato de amonio 10% (50 ml) APS (NH 4 ) 2 S 2 O 8 H 2 O deionizada 5 g 50 ml Evite exponer la solución a la luz. Almacene a 4 C.

6 6 D) TBE 10X (1L) Trizma Base Ácido bórico EDTA 0.5M 108 g 55 g 40 ml Ajuste el volumen con agua destilada. Almacene la solución a temperatura ambiente. Cámara de electroforesis modelo Sequi-Gen GT System (Bio-Rad) Figura 1. Cámara de electroforesis modelo Sequi-Gen GT System (BioRad) I. LAVADO DE LA CÁMARA Lavado del vidrio 1. Lave el vidrio por ambos lados con gasa y jabón (detergente líquido diluido o ALCONOX). 2. Deje secar a temperatura ambiente. 3. Limpie la cara donde irá adherido el gel con etanol técnico al 96%, 2 veces con toallas comunes, 1 vez con toallas Kimwipe. Lavado de la cámara 1. Limpie con agua el vidrio de la cámara. 2. Deje secar el agua.

7 7 3. Limpie con etanol al 96%, 2 veces con toallas de papel comunes, 1 vez con toallas Kimwipe. Preparación del vidrio 1. Mezcle 1 ml de solución de etanol-ácido acético (etanol 95% y acido acético 0,5%) con 3 ul de Bind Silane (Pharmacia Biotech, código No ). 2. Distribuya la mezcla por la cara del vidrio en la que se adherirá el gel, utilizando una toalla Kimwipe. 3. Deje secar durante 5 min. Preparación de la cámara 1. Distribuya 100 ul de Sigmacote o, en su defecto, 300 ul de Repel Silane sobre el vidrio de la cámara, utilizando una toalla Kimwipe. 2. Deje secar durante 5 min. II. ENSAMBLAJE DE LA CÁMARA Sequi-Gen GT System (Bio-Rad) 1. Limpie los separadores con etanol al 96% y colóquelos en los bordes laterales del vidrio de la cámara. 2. Coloque el vidrio (cara tratada) sobre la cámara. 3. Coloque los brazos, cuidando que queden al mismo nivel de la base de la cámara y el vidrio. 4. Coloque la base. III. PREPARACION DEL GEL DE ACRILAMIDA 1. Mezcle (preferiblemente en la campana de extracción) : ml de solución de acrilamida (4% o 6%) ul de persulfato de amonio al 10% ul de TEMED (GibcoBRL, No. catálogo ) La mezcla debe hacerse rápidamente y con suavidad para evitar la formación de burbujas. 2. Llene la jeringa y elimine las burbujas 3. Conecte la manguera a la jeringa, e inyecte rápidamente la solución de acrilamida. 4. Introduzca el peine entre el vidrio y la cámara, y ajuste con ganchos metálicos. 5. Deje polimerizar por 1 hora. IV. PRE-CORRIDA DEL GEL 1. Retire la base de la cámara. 2. Lave el vidrio, a nivel del frente de corrida, con gasa o esponja de brillo. 3. Coloque la cámara sobre la cubeta y llénela con TBE 0,5X (prepare 2 L de TBE). 4. Retire el peine.

8 8 5. Conecte la cámara a la fuente de poder (110 W, 3000 V, 400 ma) y espere hasta alcanzar 45 ºC de temperatura. 6. Detenga la fuente de poder y limpie el frente de corrida de urea y restos de poliacrilamida. 7. Coloque el peine con los dientes hacia abajo para formar los pozos, y ajústelo con ganchos metálicos. 8. Limpie nuevamente el frente de corrida 9. Sirva entre 1 y 2 ul de solución Stop en varios de los pozos. 10. Realice pre-corrida (110 W, 3000 V, 400 ma) durante 20 min o hasta alcanzar 50 o C, observando el recorrido de la solución Stop. Cámara de secuenciación Dual de altura Ajustable (CBS Scientific). Figura 2. Cámara de electroforesis CBS Scientific I. LAVADO DE LA CÁMARA Lavado del vidrio sin pestaña 1. Lave el vidrio por ambos lados con gasa y jabón (Detergente líquido, diluido o ALCONOX). 2. Deje secar el vidrio. 3. Limpie la cara donde se adherirá el gel 3 veces con etanol al 96%. Lavado del vidrio con pestaña 1. Limpie con agua. 2. Deje secar el agua. 3. Limpie con etanol al 96%, tres veces. Preparación del vidrio sin pestaña 1. Mezcle 1 ml de solución de etanol-ácido acético (etanol 95% y acido acético 0,5%) con 3 ul de Bind Silane (Pharmacia Biotech, código No ).

9 9 2. Distribuya la mezcla por la cara del vidrio en la que se adherirá el gel, utilizando una toalla Kimwipe. 3. Deje secar durante 5 min. Preparación del vidrio con pestaña 1. Distribuya 100 ul de Sigmacote o, en su defecto, 300 ul de Repel Silane sobre el vidrio de la cámara, utilizando una toalla Kimwipe. 2. Deje secar durante 5 min. II. ENSAMBLAJE DE LA CÁMARA DE SECUENCIACIÓN DUAL DE ALTURA AJUSTABLE (CBS SCIENTIFIC) 1. Limpie los separadores con etanol al 96% y póngalos en los bordes laterales del vidrio con pestaña. 2. Coloque el vidrio sin pestaña (cara tratada) sobre el vidrio con pestaña. 3. Selle con cinta adhesiva los lados y el borde inferior de los vidrios. Hágalo con una sola tira de cinta, reforzando la parte inferior. 4. Presione los vidrios a los lados con los ganchos (3 a cada lado). III. PREPARACION DEL GEL DE ACRILAMIDA 1. Mezcle (preferiblemente en la campana de extracción) ml de solución de acrilamida (4% o 6%) ul de persulfato de amonio al 10% ul de TEMED (GibcoBRL, No. catálogo ) La mezcla debe hacerse rápidamente y con suavidad para evitar la formación de burbujas. 2. Acueste los vidrios sobre la mesa. 3. Presione los vidrios a los lados con los ganchos (3 de cada lado). 4. Recline los vidrios sobre el borde inferior derecho con una inclinación de 45 o y lentamente vierta la acrilamida entre los vidrios. 5. Introduzca el peine entre los vidrios, y presione con ganchos. IV. PRE-CORRIDA DEL GEL 1. Retire la cinta adhesiva de la base (borde inferior). 2. Lave los vidrios, a nivel del frente de corrida, con gasa o esponja de brillo. 3. Coloque la placa metálica sobre el vidrio con pestaña (antes de esto determine el nivel al que debe ir la placa). 4. Coloque los vidrios (+ placa) sobre la cubeta de buffer inferior y ajústelos a la cubeta superior con ganchos. 5. Llene las cubetas de TBE 0,5X (prepare 2 L de TBE).

10 10 6. Retire el peine. 7. Conecte el dispositivo a la fuente de poder (110 W, 3000 V, 400 ma) y espere hasta alcanzar 45ºC de temperatura. 8. Detenga la fuente de poder y limpie el frente de corrida de urea y restos de poliacrilamida. 9. Coloque el peine con los dientes hacia abajo para formar los pozos, y ajústelo con ganchos metálicos. 10. Limpie nuevamente el frente de corrida Realice pre-corrida (110 W, 3000 V, 400 ma) durante 20 min observando el recorrido de la solución Stop Preparación de soluciones 2. Corrida del gel (se aplica a los dos modelos de cámara) A) Solución Stop Solución Stop Concentración en Volumen para 200 ml solución de trabajo Formamida redestilada 95% 190 ml EDTA (0,5 M) 20 mm 8 ml Azul de bromofenol 0,05% 0,1 g Xylene Cyanol 0,05% 0,1 g H 2 O deionizada 2 ml 1. Utilice guantes. 2. Almacene la solución a 4 C Protocolo 1. Agregue 5 ul de solución Stop a cada uno de los productos de PCR (producto con un volumen final de 10 a 20uL). 2. Desnaturalice las muestras (productos PCR) a 95 ºC durante 2 min. 3. Colóquelas sobre hielo inmediatamente. 4. Detenga la pre-corrida. 5. Retire la urea que se ha acumulado en los pozos utilizando una jeringa (sin la punta metálica) llena de buffer. Inyecte rápidamente el buffer en los pozos teniendo en cuenta de no introducirles burbujas. 6. Coloque entre 2,5 a 3 ul de muestra por pozo. En caso dado de que los pozos se vuelvan a llenar de urea, límpielos individualmente utilizando una pipeta de 100uL. 7. Retire el peine, una vez que las muestras han recorrido 2 cm dentro del gel. 8. Corra las muestras (110 W, 3000 V, 400 ma) durante aproximadamente 2h.

11 11 1. Toda manipulación de acrilamida debe hacerse con guantes. 2. La solución de Stop también se trabaja con guantes pues contiene sustancias tóxicas. 3. Los PCR con solución Stop pueden ser almacenados a -4 C y reutilizados para otras - electroforesis en geles de acrilamida e incluso en geles de agarosa. 4. El calor daña los peines, por esto es importante retirarlos a tiempo del gel Soluciones de trabajo 3. Tinción de geles con Nitrato de plata A) Solución Fijadora y de Parada (cantidades para preparar 3,5 L) Ácido Acético Agua deionizada 350 ml 3,65 L Prepare la solución en la campana de extracción, Utilice guantes de látex. Almacene la solución a temperatura ambiente. B) Solución de tinción (cantidades para preparar 3,5 L) Nitrato de plata Formaldehído (37%) Agua deionizada 3,5 g 4,5 ml 3,5 L Evite exponer la solución de AgNO 3 a la luz. Prepare la solución en la campana de extracción. Utilice guantes de látex. Almacene la solución a temperatura ambiente.

12 12 C) Revelador (cantidades para preparar 3,5 L) Carbonato de sodio Formaldehido (37%) Tiosulfato de sodio Agua deionizada 105 g 4,5 ml 650 ul 3,5 L Evite exponer la solución a la luz. Agregue el formaldehído a la solución en la campana de extracción. Almacene a 4 C. D) Tiosulfato de sodio (10 ml) Tiosulfato de sodio H 2 O deionizada 0,1 g 10 ml Evite exponer la solución a la luz. Almacene a 4 C Protocolo La tinción del gel con nitrato de plata consiste de 7 pasos sucesivos: 1. Fijación: Sumerja el gel durante 20 min en solución fijadora (ácido acético 10%). Nota. En este punto el gel puede permanecer un poco más de tiempo, hasta una hora. 2. Lavado con dh 2 O: Espere a que escurra bien el gel del paso anterior y sumérjalo en agua bidestilada o deionizada y agítelo suavemente. Repita esto tres veces con cambio de agua entre lavado. Cada lavo tiene una duración de 2 minutos, si en el último lavado nota restos de ácido acético (manchas grasosas sobre el gel) repita una vez más el lavado. 3. Tinción: Escurra bien el agua del gel y sumérjalo en la solución de nitrato de plata durante 30 min. Es importante que el gel permanezca tapado durante este paso por que la luz oscurece el gel. 4. Lavado con dh 2 O: Escurra bien el gel, sin tardarse y sumérjalo en agua bidestilada o deionizada durante 10 segundos. Este es un paso crítico pues aquí se está retirando el

13 13 exceso de nitrato de plata, si no lo lava bien la tinción saldrá muy oscura, si lo lava mucho se pierde la nitidez de las bandas. 5. Revelado: Escurra un poco el gel y sumérjalo en la solución reveladora (Carbonato de sodio + formaldehído 37% + Tiosufato de sodio). Esta solución debe estar entre 18 y 20 C. Agite suavemente hasta que aparezcan las bandas de ADN (3 a 5 min). Este paso es crítico, el gel se va oscureciendo lentamente y se empiezan a ver las bandas de ADN, después se hace más rápida la tinción y se hace más difícil de frenar. 6. Fijación/Parada: Escurra el gel y sumérjalo en la solución de parada (ácido acético 10%). En este paso el gel puede permanecer un par de horas. 7. Lavado con dh 2 O: Escurra bien el gel y sumérjalo en agua bidestilada o deionizada durante 5 min, hasta eliminar los rastros del ácido acético. 1. Los distintos pasos de la tinción se realizan en bandejas plásticas con tapas plásticas o de madera. El nitrato de plata es sensible a la luz por esto las bandejas y las tapas deben ser opacas. 2. Las soluciones de fijación y tinción pueden usarse hasta 10 veces, mientras que la de revelado solo La solución de revelado debe almacenarse en frio, 4 C. Las otras soluciones se guardan a temperatura ambiente. 4. Esta técnica es muy sensible a los tiempos de incubación de cada paso y a la temperatura y calidad de la solución de revelado. 5. La tinción con plata involucra la manipulación de reactivos tóxicos como lo es el nitrato de plata, el formaldehido y el ácido acético, por ello se deben emplear guantes, mascarilla para la boca y gafas. También es una buena alternativa trabajar las soluciones peligrosas en cámara de extracción. 4. Desprendimiento de geles Los vidrios de las cámaras de electroforesis son reutilizables, por esto después de extraer los datos del gel (llenar planillas de microsatelites con datos de alelos por ejemplo y escanear el gel para tener un soporte gráfico), se desprenden los geles del vidrio utilizando una solución de NaOH altamente concentrada. Este proceso debe hacerse en cámara de extracción y con guantes pues los vapores del NaOH son peligrosos s -Hidróxido de sodio -Agua deionizada

14 Preparación de soluciones A) NaOH 5% (para 4 litros) NaOH H 2 O deionizada 200 g 4L Complete el volumen con agua destilada y esterilice en el autoclave. Almacene la solución a 4 C Protocolo 1. Sumerja el vidrio en NaOH al 5% durante un par de horas. 2. Remueva el gel pasando suavemente la mano por el vidrio. 3. Lavar el vidrio inmediatamente con abundante agua. Esto se puede hacer fuera de cámara. Nota: no olvide usa guantes y trabajar en cámara de extracción Precipitación de la solución de plata 5.2. Protocolo 5. Tratamiento de desechos 1. Agregue a la solución de plata 5 g de NaCl por litro de solución. 2. Incube durante 24 h. 3. Filtre con papel de filtro Whatman Descarte la solución acuosa en el lavaplatos y el precipitado en los desechos de poliacrilamida. Nota: El resto de las soluciones, ácidos y el revelador se pueden desechar en el lavaplatos. 6.1 Protocolo 6. Tratamiento de cámaras contaminadas 1. Cubra la zona contaminada con un pedazo de gasa empañado en NaOH al 10%. 2. Espere 20 min y lave la cámara con abundante agua. 3. Cubra el vidrio de la cámara con una fina capa del producto que esté utilizando para repeler el gel (Sigmacote, Repel u otro) un par de veces.

15 15 7. Anexos 7.1. Anexo1: Cuidado a tener con el manejo de la poliacrilamida Protección personal Todo el personal que ingrese al laboratorio debe tener bata y zapatos cerrados. La manipulación de soluciones y equipos del laboratorio (utensilios que estén en contacto con la poliacrilamida, cámaras de electroforesis, lavaplatos) se debe hacer con guantes de látex. Es recomendable utilizar guantes de nitrilo para la manipulación de la poliacrilamida y la solución de NaOH. La preparación de la solución de poliacrilamida se debe hacer en la campana de extracción con máscara y guantes de nitrilo. En caso de contaminación con poliacrilamida se deben hacer lavados con abundante agua. Notificar al responsable del laboratorio. Acudir al médico si se presenta malestar. Área de trabajo para la preparación de geles de poliacrilamida Debe estar separada del área de trabajo donde se hacen PCR, extracciones y preparan reactivos y debe estar identificada. Debe permanecer limpia. Se recomienda hacer jornadas de limpieza frecuentes, según el uso que se le de al laboratorio. No deben ponerse libros, cuadernos, etc., en las superficies donde se trabaje con poliacrilamida. Cuidados a tener con la solución de poliacrilamida. La solución de poliacrilamida debe almacenarse en una nevera a 4 C en botellones de vidrio opaco. El botellón debe etiquetarse con el tipo de solución (relación de acrilamida: bis-acrilamida, % de la solución, concentración de urea), la fecha de preparación y el responsable de la preparación. Desechos Los desechos de poliacrilamida y todo material desechable que esté en contacto con ella se descartan en bolsas plásticas, debidamente etiquetadas, que son selladas con cinta adhesiva y llevadas a incineración.

16 Anexo 2: organización del área de trabajo El área de trabajo debe contar con: -Dos mesones, uno para el tratamiento de las cámaras de electroforesis y otro para los vidrios. Esto con el fin de evitar la contaminación de las cámaras. Los mesones deben cubrirse preferiblemente con plástico para evitar la contaminación y facilitar la limpieza de los mismos. -Un lavaplatos, con dimensiones apropiadas para el lavado de los vidrios y cámaras de electroforesis. El desagüe debe estar provisto de una rejilla para evitar el paso de poliacrilamida sólida a la tubería. -Una campana de extracción para colocar permanentemente la bandeja con NaOH para el desprendimiento de geles; para manipular el SIGMACOTE, el TEMED (en la mezcla de reactivos para la polimerización del gel), el ácido acético glacial (preparación del etanol ác. acético y de las soluciones fijadora y de parada) y el formaldehído 37% (para la preparación del revelador). -Un agitador, con las dimensiones apropiadas para poner en agitación las bandejas de tinción (opcional). -Una plancha de calentamiento para la desnaturalización del ADN. -Una bomba de vacío para filtrar las soluciones de poliacrilamida. 8. Bibliografía Bassman BJ, Caetano-Anollés G, Gresshoff PM Fast and Sensitive Silver Staining of DNA in Polyacrylamide Gels. Anal. Biochem 196: Beidler JL,Hilliard PR, Rill RL, Ultrasensitive Staining of Nucleic Acids with Silver. Anal Biochem. 126: Christensen M, Sunde L, Bolund L, Orntoft TF Comparison of three methods of microsatellite detection. Scandinavian Journal Clinical and Laboratory Investigation 59: Comisine S, Leone P, Redaelli L, DeGiuli L, Zhang Y, Ferreti L Characterization of bopvine microsatellites by silver staining. Jornal of Animal Breeding and Genetics 112: Crest S, Tulman-Neto A, Figueira A Detection off single sequence repeat polymorphisms in denaturing polyacrilamide sequencing gels by silver staining.plant Molecular Biology Reporter 19: Duina Posso Duque, Thaura Ghneim Herrera Uso de Marcadores Microsatélites para la Estimación de Diversidad Genética en Plantas. Ediciones IVIC.

17 17 Sanguinetti CJ, Dias Neto E, Simpson AJG Rapid silver staining and recovery of PCR products separeted on polyacrylamide gels. Biotechniques 17: Como citar este protocolo: Duina Posso Duque y Thaura Ghneim. Electroforesis de ácidos nucléicos en geles de poliacrilamida. Protocolos de laboratorio UEG ( Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, Altos de Pipe- Venezuela.