Encuentro de Investigación en IE, de Marzo, 2007

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1 140 Implementación de un Sistema de Visión Artificial para el Conteo de Colonias Bacterianas como Apoyo al Análisis del Grado de Contaminación de Alimentos. Alejandro Calderón Aguirre 1, Manuel Ornelas Rodríguez 1, Francisco J. Ornelas Rodríguez 2, Carlos Manuel Bucio Villalobos 3, Martha A. Rocha 1. 1 Instituto Tecnológico de León, Av. Tecnológico s/n, Fracc. Julián de Obregón, León Gto., 37290, México. correo-e: 2 CIATEC, Omega 201, Fracc. Delta, León Gto., 37545, México. 3 Instituto de Ciencia Agrícolas de la Universidad de Guanajuato, Carr. Irapuato-Silao Km. 9, Irapuato Gto., 36500, México. Resumen Este documento presenta un método, basada en el procesamiento digital de imágenes, enfocado a la automatización del conteo de colonias bacterianas (conteo en placa). La técnica está basada en la aplicación de la Morfología Matemática, principalmente de la erosión sobre imágenes digitales binarizadas con dos niveles de umbralización. Se describen los resultados obtenidos sobre imágenes de cultivos de muestras de harina de maíz y una bacteria purificada (serratia). Abstract this document presents a method, based on digital image processing, focused to the automatization of the bacterial colonies counting (counting in plate). The technique is based on the application of the Mathematical Morphology, mainly on the erosion of binarized digital images with two levels of thresholding. We describe the obtained results on images of maize flour samples and a purified bacterium (serratia). Descriptores Procesamiento digital de imágenes, morfología matemática, conteo de colonias. E I. INTRODUCCIÓN n los últimos años las tecnologías basadas en procesamiento digital de imágenes han tenido buenos resultados en infinidad de aplicaciones. Áreas de investigación como la medicina y la biología en alimentos se han visto beneficiadas con aplicaciones utilizadas al diagnóstico y detección de enfermedades, al control de calidad [1]. En el área de la microbiología se recurre constantemente a la técnica de conteo en placa (conteo de colonias bacterianas) para determinar el comportamiento de determinados microorganismos presentes en una muestra de alguna sustancia de interés (alimento, agua, orina, etc.). En la mayoría de los casos, el conteo es realizado manualmente por una persona especialista en la técnica, sin embargo, cuando se requiere del análisis de un gran número de muestras, se llega a cometer errores [2]. Con el objetivo de realizar un conteo automático de colonias bacterianas, se presenta a continuación una metodología de procesamiento digital de imágenes, basada principalmente en la aplicación de la erosión a imágenes digitales binarizadas con diferentes niveles de umbralización. Esta metodología se aplicó sobre imágenes, en escala de grises, obtenidas de cultivos en cajas de petri.

2 141 II. MATERIALES Y EQUIPO UTILIZADOS. Las imágenes empleadas fueron adquiridas de cajas de petri con cultivo bacteriano de muestras provenientes de harina de maíz. Otras muestras fueron provenientes de una bacteria previamente purificada (Serratia). Los medios de cultivo empleados son materiales traslúcidos. Para la adquisición de las imágenes se empleó el arreglo óptico experimental mostrado en la figura 1. Figura 2.Diagrama de bloques para la metodología propuesta. Figura 1. Configuración del arreglo óptico experimental para la adquisición de imágenes. El dispositivo empleado para la captura de imágenes fue una Cámara CCD Monocromática Marca Sony, Modelo XC-ST70. Se utilizó una lente zoom marca Computar, con distancia focal mm. Se realizó una retro-iluminación de la escena con una lámpara de luz blanca, y una placa difusora para tener una iluminación más uniforme. Para el procesamiento de las imágenes se implementó un programa bajo la plataforma.net de Microsoft en el lenguaje Visual Basic versión 2003, en una computadora con un procesador a 1.6 GHz de velocidad y con 512 Mb de memoria RAM. Primeramente, para poder realizar una mejor manipulación de los datos, se optó por trabajar con el negativo de las imágenes originales (figura 3).Sin embargo, las imágenes adquiridas tuvieron un contraste deficiente como se puede apreciar en la figura 4. Figura 3. a) Imagen original adquirida, b) negativo de la misma imagen. III. METODOLOGÍA Una vez adquiridas las imágenes, la metodología propuesta para la automatización del conteo de las colonias se describe en el diagrama de la figura 2.

3 142 operación requerida es la erosión, que se encuentra definida por la expresión: 2 { d E : d + b X. para. cada b B} XΘ B =. (ec. 1) Donde X es la imagen a tratar y B es un elemento estructural. En otras palabras, la erosión es el conjunto de puntos d para los cuales todos los posibles d + b están en la imagen X [3]. Figura 4. a) Aumento de una región del negativo de la imagen original a analizar, b) Histograma de la imagen. Para obtener un mejoramiento en el contraste se recurrió a una expansión lineal del histograma, lo cual nos dio una mejor apreciación de la imagen además de que nos permitió trabajar dentro de todo el rango dinámico de niveles de gris (figura 5). Previo a la aplicación de la erosión, la imagen contrastada fue binarizada usando dos niveles de umbralización. La binarización con un umbral alto permitió separar los centros de las colonias que se encuentran agrupadas en clusther s, sin embargo, en este proceso se pierden aquellas colonias cuyos niveles de gris están por debajo de dicho umbral (figura 6a). Para solucionar este problema, el umbral bajo nos proporcionó otra imagen binaria que contiene el mayor número de colonias presentes en el cultivo, con la desventaja de que los clusther s aparecen como una mancha continua (figura 6b). Estas dos imágenes fueron a las que se les aplicó la operación de erosión. Figura 6. Imágenes resultado de la binarización con: a) un nivel de umbral alto, b) un nivel de umbral bajo. Figura 5. a) Aumento de una región de la imagen original posterior a la expansión de su histograma, b) histograma resultante de la expansión lineal. Ahora bien, las operaciones morfológicas simplifican las imágenes y preservan las formas principales de los objetos. Entre los operadores morfológicos que conforman a estas transformaciones se encuentran la dilatación, la erosión, el cierre, etc. En nuestro caso la Para realizar la erosión se debe contar con el o los Elementos Estructurales adecuados. Existen infinidad de configuraciones para tales elementos. En nuestro caso, para elegir los elementos más apropiados, se realizaron pruebas con varias configuraciones en las que se variaba la relación del punto representativo a uno o varios vecindarios. De acuerdo a las pruebas realizadas, los mejores resultados al aplicar la operación de erosión a una imagen binaria, se obtuvieron combinando varios de estos elementos. La combinación más adecuada fue en la que se

4 143 involucraron a 1 y 3 vecindarios, como se muestra en la figura *1 0 [ *1] 1 0 c) 0 *1 Figura 7. Elementos estructurales usados para la erosión. a) el punto representativo, marcado por el carácter *, en relación a un vecindario, b) y c) punto representativo en relación a 3 vecindario. El resultado obtenido al aplicar el proceso de erosión a las dos imágenes de la figura 6, fue la reducción del área de las colonias a un solo píxel, como se muestra en la figura 8. Para poder discriminar píxeles pertenecientes a una misma colonia, se determinó una separación promedio, de tal forma que para dos píxeles dentro de esta distancia solo se dejó uno. La figura 10 muestra el resultado de esta discriminación. Finalmente, cada píxel resultante correspondió a una de las colonias de bacterias de la imagen original, por lo que mediante una contabilización de ellos se obtuvo el número de colonias en la imagen. Figura 10. Resultado de discriminación de píxeles. Figura 8. Imágenes resultado de la erosión sobre la imagen binarizada a) con un umbral alto, b) con un umbral bajo. Posteriormente se realizó la suma de las imágenes de la figura 8, obteniendo como resultado la imagen mostrada en la figura 9. En esta imagen se muestra la suma de los píxeles resultantes de las erosiones, superpuestos sobre una imagen auxiliar que nos indica la posición original de cada colonia. Figura 9.Imagen resultante de la suma de las imágenes de la figura 8. Como puede observarse en la figura 9, como resultado de la suma, para algunas colonias se generaron 2 o más píxeles cercanos, por lo que fue necesario realizar una discriminación de los mismos. IV. RESULTADOS Y CONCLUSIONES. De las muestras analizadas se presenta a continuación la tabla 1, en la que se indica el resultado del conteo realizado mediante esta metodología, comparado con el conteo realizado manualmente. TABLA I. RESULTADOS DEL CONTEO DE COLONIAS BACTERIANAS, EN ALGUNAS IMÁGENES ANALIZADAS Conteo % de Prueba Automático Manual Aprox En esta tabla, se observa una diferencia entre los resultados del conteo automático y del conteo realizado manualmente. Esta discrepancia se debió a que mediante esta metodología no siempre fue posible separar todos los centros de las colonias que forman algunos clusther s. La separación de estas colonias

5 144 depende principalmente del grado de solapamiento que presentan las mismas. AGRADECIMIENTOS Se agradece a CONACyT y CONCyTEG el apoyo económico brindado para la realización de esta investigación. REFERENCIAS [1] Tadeo Fernando, González Susana, Álvarez Mª Teresa, Clasificación de Microorganismos, Mediante Procesado de Imagen, Dpto. Ingeniería de Sistemas y Automática, Universidad de Valladolid, y Empresa Depuradora de Aguas Residuales, Ávila, España, (2001). documentos/b_01_va.pdf. [2] Corkidi G., Diaz-Uribe R., Folch-Mallol J. L. y Nieto- Sotelo J., COVASIAM: an Image Analysis Method That Allows Detection of Confluent Microbial Colonies and Colonies of various Sizes for Automated Counting., APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Vol. 64, No. 4, , (1998). [3] Gonzalo Pajares, Jesús M. de la Cruz, Visión por computador: Imágenes digitales y aplicaciones, Editorial Alfaomega, , (2002). [4] Qi Pei, Wang Yang, Counting Cell Using Digital Image Processing Technique, ECE 533 Digital Image Processing, Electrical & Computer Engineering University of Wisconsin-Madison, (2005).

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