Manejo del hongo en el laboratorio

Transcripción

1 Guía Práctica 7 Rhizoctonia solani Enfermedad: Pudrición radical por Rizoctonia Manejo del hongo en el laboratorio Guillermo Castellanos, Experto en Investigación 2 Carlos Jara, Ing. Agr. M.Sc., Asociado en Investigación Gloria Mosquera, Fitopatóloga, Ph.D., Líder de Proyecto Fitopatología de Frijol Contenido Generalidades 7-2 Procedimientos 7-3 A. Recolección y transporte de las muestras 7-3 B. Preparación del medio de cultivo PDA 7-5 C. Aislamientos de R. solani En el medio de cultivo PDA Aislamiento monomicelial 7-9 D. Incremento del inóculo Suelo + papa Suelo + harina de frijol 7-12 E. Inoculación de plantas en el invernadero Con inóculo incrementado a partir de suelo + papa Con inóculo incrementado a partir de suelo + harina de frijol 7-15 F. Conservación de R. solani para almacenamiento Conservación en papel filtro a 20 C Conservación como suspensión en solución de peptona-sucrosa, en papel filtro a 20 C 7-19 G. Prueba de almacenamiento 7-21 H. Recuperación del hongo almacenado Conservado en papel filtro a 20 C Conservado a 20 C en papel filtro de suspensión en peptona-sucrosa 7-23

2 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Generalidades La pudrición radical causada por Rhizoctonia solani Kuhn es una de las pudriciones radicales más comunes del frijol. La enfermedad, como indica su nombre, ataca principalmente las raíces del frijol y se desarrolla cuando la temperatura del ambiente va de moderada a baja y la humedad del suelo de moderada a alta. Se ha reportado que la temperatura ideal para el desarrollo de la enfermedad es de 18 C. Foto 1 Los síntomas, conocidos como chancros, son lesiones cóncavas de color pardo rojizo que aparecen en el tallo (Foto 1) y en la raíz principal. El patógeno puede causar, finalmente, el volcamiento de la planta (Foto 2), una manifestación del síndrome conocido como damping off. Las plantas susceptibles sufren graves daños en las 2 primeras semanas después de la siembra. Los suelos muy húmedos favorecen el desarrollo del hongo. Foto 2 7-2

3 Guía Práctica 7: Rhizoctonia solani Enfermedad: Pudrición radical por Rizoctonia Procedimientos A. Recolección y transporte de las muestras El hongo Rhizoctonia solani se aísla del tejido vegetal enfermo que presente síntomas típicos de la enfermedad. Con la ayuda de una espátula o paleta delgada se extrae del suelo la raíz, tan completa como sea posible, de una planta afectada por el patógeno. El suelo adherido a la raíz se lava con agua y la planta se coloca sobre una toalla de papel hasta que la raíz esté seca. Materiales Toallas de papel Bolsas de papel Rótulos para identificar el material Toallas de papel. La muestra de tejido de frijol infectado (de raíces o de tallos) que se colecta se envuelve en una toalla de papel que sirve, además, para absorber su humedad. Si no hay toallas, pueden usarse materiales similares como servilletas, papel higiénico, pañuelos faciales y, en último caso, papel periódico. 7-3

4 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Bolsas de papel. Las muestras de tejido infectado envueltas en algún papel absorbente se colocan en bolsas o sobres de papel. No se deben usar bolsas plásticas porque no son porosas y contribuyen, por ello, a la acumulación de humedad en su interior; esta humedad favorece el crecimiento de microorganismos saprofitos, los cuales dificultarán el aislamiento del patógeno que se hace a partir del tejido de frijol. Rótulos para marcar las muestras. Es muy importante identificar claramente la muestra con la siguiente información: variedad (o genotipo) de frijol, tamaño y color de sus granos, lugar donde se toma la muestra (localidad, provincia, departamento, país), fecha de recolección de la muestra, nombre del recolector y, en lo posible, latitud y longitud (aproximadas) del lugar en que se hizo la recolección. El rótulo debe quedar bien adherido en cada muestra. Recomendaciones Indicar en el rótulo si la recolección se hizo en el campo de un agricultor o en una estación experimental. Cuando no haya suficientes rótulos para todas las muestras, marcar las bolsas con un código y registrar la información completa en una libreta de campo. No recolectar material vegetal húmedo; si está en esas condiciones, secarlo con toallas de papel antes de ser transportado. Una vez en el laboratorio, y si no se procesa inmediatamente, dejarlo sobre toallas de papel al aire libre para que termine de secarse. 7-4

5 Guía Práctica 7: Rhizoctonia solani Enfermedad: Pudrición radical por Rizoctonia Tomar muestras de una raíz que presente los síntomas de la enfermedad. Envolver cada muestra en una toalla de papel, colocarla en una bolsa o sobre de papel y adherir a ésta el rótulo que corresponda. Paso 3 Enviar la muestra, tan pronto como sea posible, al sitio o laboratorio donde se hará el aislamiento del hongo patógeno. Nunca envíe las muestras dentro de bolsas plásticas o envueltas en papel aluminio. B. Preparación del medio de cultivo PDA Las siglas PDA corresponden a los componentes del medio: papa, dextrosa y agar. Este medio se usa para aislar el patógeno. Materiales PDA deshidratado 39 g/litro Agua destilada 1 litro Frascos erlenmeyer de 1000 ml 2 7-5

6 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Preparación Foto 3 Se pesan los ingredientes (Foto 3), se colocan en un recipiente grande, que puede ser un vaso de precipitado, y se les agrega el agua; esta solución se envasa en dos frascos erlenmeyer (500 ml en cada uno). Los frascos erlenmeyer con el medio de cultivo PDA se esterilizan en el autoclave. Esta máquina, con una presión de 20 libras y una temperatura de 121 C, realiza el proceso total de esterilización en 40 minutos. El medio esterilizado se deja enfriar hasta que pueda manipularse (Foto 4) y se vierte luego en cajas petri, a razón de 25 ml por caja (Foto 5). C. Aislamientos de R. solani 1. En el medio de cultivo PDA Foto 4 El protocolo de aislamiento de R. solani es sencillo, ya que 2 días después de hacer la siembra de la muestra del patógeno en el medio de cultivo PDA, se observa un crecimiento rápido del hongo; después de varios días, el aislamiento adquiere un color café que cubre totalmente el medio de cultivo en la caja petri. Materiales Foto 5 Cámara de flujo laminar Tijeras Cajas petri de 100 y 60 mm Agua destilada estéril 7-6

7 Guía Práctica 7: Rhizoctonia solani Enfermedad: Pudrición radical por Rizoctonia Hipoclorito de sodio al 2% Toallas de papel Mechero Marcador Incubadora Pinzas Medio PDA Muestra (tejido con síntomas) Nota: Todos los procedimientos se deben ejecutar dentro de la cámara de flujo laminar; además, deben cumplirse todas las condiciones de asepsia y esterilidad que se exigen en un laboratorio. En otras palabras, se aplican siempre las buenas prácticas microbiológicas (BPM). Cortar varios trozos del tejido infectado de la muestra utilizando una tijera estéril (Foto 6). Foto 6 Desinfectar los trozos de muestra en una caja petri de 60 mm que contenga una solución de hipoclorito de sodio al 2.5%, durante 3 minutos (Foto 7). Paso 3 Lavar tres veces con agua destilada estéril los trozos desinfectados. Foto 7 7-7

8 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Paso 4 Colocar los trozos lavados sobre toallas de papel estériles durante 10 minutos para que se sequen (Foto 8). Foto 8 Foto 9 Paso 5 Cuando las muestras estén secas, tomar los pedazos de tejido con una pinza estéril y sembrarlos en una caja petri que contenga el medio de cultivo PDA; colocar tres pedazos por caja. Repetir el procedimiento para todas las muestras (Foto 9). Incubar las cajas a 24 C durante 10 días, tiempo en que el hongo producirá micelio y esclerocios. Estos últimos se observan como puntos de color café (Foto 10). Diez días más tarde, el aislamiento estará listo y podrá purificarse mediante un aislamiento monomicelial. Nota: El cultivo del hongo es blanquecino en sus primeras etapas de crecimiento. Foto

9 Guía Práctica 7: Rhizoctonia solani Enfermedad: Pudrición radical por Rizoctonia 2. Aislamiento monomicelial El objetivo de este procedimiento es obtener una cepa del hongo genéticamente pura. Si el hongo se aísla de un tejido vegetal que presenta síntomas, éstos pueden ser producidos por varias cepas de un mismo hongo. Por eso es necesario purificar el hongo obtenido en el primer paso del aislamiento. Si el hongo no produce esporas en el medio de cultivo, se utilizan puntas de hifas. El procedimiento comprende los pasos siguientes: Tomar un cuadrado de aproximadamente 0.5 cm (de lado) del medio de cultivo PDA donde se observe que el hongo crece (ver C., 1. En el medio, Paso 5). Transferir el cuadrado al centro de una caja petri que tenga medio de cultivo PDA fresco. Incubar a 24 C durante 24 horas. Observar al día siguiente, bajo el estereoscopio y en la cámara de flujo laminar, el micelio del hongo en crecimiento, y enfocar los bordes de la colonia para identificar las puntas de las hifas en crecimiento. Paso 3 Con un alfiler flameado, cortar un pedacito de agar que contenga la punta de una sola hifa, ejecutando las siguientes operaciones: Tener la precaución de no tocar otras hifas alrededor de la que se está aislando. 7-9

10 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Transferir el pedacito de agar con la hifa a una nueva caja petri que contenga medio de cultivo PDA fresco; colocar solo una hifa en cada caja. Incubar esa caja con la punta de hifa a 24 C durante 10 días. Pasado este tiempo de incubación se obtendrá un cultivo similar al del Paso 5, excepto que es genéticamente puro. A partir de aquí se harán los incrementos del hongo con el fin de producir inóculo suficiente para las pruebas que se harán en el invernadero o en el campo. D. Incremento del inóculo El incremento de Rhizoctonia para realizar inoculaciones en invernadero puede hacerse de dos formas: una es con mezcla de suelo + papa, y la otra es suelo + harina de frijol. 1. Suelo + papa Foto 11 Materiales Suelo estéril Arena Papa (200 g) Frasco erlenmeyer de 1000 ml Aislamiento monomicelial de R. solani 7-10

11 Guía Práctica 7: Rhizoctonia solani Enfermedad: Pudrición radical por Rizoctonia Mezclar en una bandeja cuatro partes de suelo por una de arena. Picar la papa en pequeños trozos (Foto 11) y combinarla con la mezcla del paso anterior en la siguiente relación: 100 g de papa picada x 1600 g de mezcla de suelo-arena (Foto 12). Foto 12 Paso 3 Introducir esta nueva mezcla en el frasco erlenmeyer de 1000 ml hasta completar 400 ml (Foto 13). Esterilizar dos veces la mezcla en un autoclave (ver B. Preparación del...). Paso 4 Tomar una caja petri donde el hongo R. solani haya sido incrementado como cultivo monomicelial (Paso 5 anterior) y extraer, con un sacabocado de 1 cm de diámetro, 10 discos del medio en que esté el hongo incrementado. Todo el procedimiento debe hacerse bajo condiciones asépticas de laboratorio. Foto 13 Paso 5 Agregar 10 discos del paso anterior (medio de cultivo con hongo) al frasco erlenmeyer del Paso 3 (Foto 14). Agitar manualmente hasta que los discos se distribuyan por toda la mezcla de suelo y papa picada. Foto

12 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Paso 6 Incubar el frasco erlenmeyer del paso anterior a 24 C durante 12 días. Pasado este tiempo, el hongo habrá colonizado la mezcla de suelo y papa, y el inóculo estará listo para los ensayos que se harán en el invernadero. 2. Suelo + harina de frijol Materiales Suelo estéril 1 kg Harina de frijol 10 g Agua destilada 50 ml Aislamiento monomicelial de R. solani 2 cajas Sacabocado de 1 cm de diámetro Papel aluminio Papel kraft Foto 15 En un recipiente que pueda ser autoclavado depositar 1 kg de suelo y adicionarle 10 g de frijol (Foto 15), homogenizar la mezcla y distribuirla de tal manera que la profundidad no sea superior a 3 cm. 7-12

13 Guía Práctica 7: Rhizoctonia solani Enfermedad: Pudrición radical por Rizoctonia Adicionar a esta mezcla 50 ml de agua destilada para darle cierta humedad al suelo. Paso 3 Cubrir el recipiente con papel aluminio y encima con papel kraft, y llevar al autoclave (Fotos 16 y 17). Paso 4 Una vez retirado el suelo del autoclave dejarlo enfriar, destapar el recipiente y colocar los 25 discos de 1 cm de diámetro del aislamiento monomicelial (Foto 18) por kilogramo de suelo a incrementar (Foto 19). Foto 16 Foto 17 Foto 18 Paso 5 Tapar nuevamente con el mismo papel con que fue llevado al autoclave y dejarlo a temperatura ambiente (22 C) durante 15 días, tiempo en el cual los discos habrán producido micelio y colonizado el suelo (Foto 20). Foto 19 Foto

14 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol E. Inoculación de plantas en el invernadero 1. Con inóculo incrementado a partir de suelo + papa Foto 21 Foto 22 Foto 23 Foto 24 Agregar el inóculo producido en el incremento suelo + papa, en una relación de 2%, al suelo que será utilizado para la inoculación (Fotos 21 y 22). Colocar el suelo y el inóculo en una bolsa plástica para mezclarlos, y agitar la bolsa varias veces para que la mezcla de ambos sea lo más homogénea posible (Foto 23). Paso 3 Llenar una bandeja (o unos potes) con suelo normal y abrir en él surcos para siembra. Colocar luego en los surcos las semillas de los genotipos de frijol que se inocularán (Foto 24) y cubrirlas con 100 g de la mezcla de suelo más inóculo obtenida en el Paso 2 (Foto 25). Regar luego la bandeja con agua corriente. Foto

15 Guía Práctica 7: Rhizoctonia solani Enfermedad: Pudrición radical por Rizoctonia Paso 4 Evaluar los genotipos sembrados a los 14 días después de la inoculación, según la escala estándar del CIAT, cuyas categorías van del 1 al 9 y se distribuyen así: de 1 a 3: planta resistente de 4 a 6: planta de reacción intermedia de 7 a 9: planta susceptible Evaluar, adicionalmente, la incidencia de la enfermedad en cada genotipo. Para hacerlo, observar la relación proporcional de las plantas afectadas (cualquier grado de severidad) respecto al total de semillas sembradas. Asegurarse de que no entren en esa relación las semillas que no germinaron por causas diferentes al patógeno inoculado. 2. Con inóculo incrementado a partir de suelo + harina de frijol Foto 26 Agregar el inóculo producido en el incremento suelo + harina de frijol, en una relación de 2%, al suelo que será utilizado para la inoculación. Si se prepara el inóculo en 1 kg de suelo + harina de frijol, mezclar éste con 50 kg de suelo a utilizar en la siembra (Foto 26). 7-15

16 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Utilizar la mezcladora (Foto 27) cuando los volúmenes a mezclar sean grandes. Foto 27 Paso 3 Llenar potes de 2 kg de la mezcla anterior y realizar la siembra (Foto 28). La mezcla de 1 kg de suelo + harina con inóculo alcanza para 25 potes de 2 kg. Foto 28 Paso 4 Evaluar los genotipos sembrados a los 14 días después de la inoculación (Foto 29), empleando la escala estándar del CIAT (ver E., 1. Con inóculo..., Paso 4). F. Conservación de R. solani para almacenamiento Para almacenar el hongo R. solani se emplean dos métodos: la conservación en papel filtro y la conservación en suspensión de sucrosa y peptona. 1. Conservación en papel filtro a 20 o C Foto 29 Este método permite conservar microorganismos durante períodos largos de tiempo. 7-16

17 Guía Práctica 7: Rhizoctonia solani Enfermedad: Pudrición radical por Rizoctonia Materiales Papel filtro estéril, cortado en trozos pequeños ( 50) de 1 cm 2 Pinzas Cajas petri estériles Agua destilada estéril Pipeta Sobres de papel mantequilla Cortar cuadritos (60-80) de papel filtro de 1 cm 2, colocarlos dentro de una caja petri o de un contenedor cerrado y esterilizarlos en autoclave. Colocar 10 cuadritos de papel filtro esterilizado sobre el medio de cultivo PDA en cada caja petri. Paso 3 Preparar una suspensión de micelio de un aislamiento del hongo, de la siguiente manera: Agregar agua destilada estéril a la caja petri que contiene el hongo incrementado sobre el medio de cultivo PDA. Raspar luego la superficie de ese aislamiento con la punta de la pipeta para formar una suspensión. 7-17

18 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Tomar un poco de esa suspensión con la pipeta y colocar una gota en cada cuadrito de papel filtro esterilizado (en las cajas petri del Paso 2). Paso 4 Incubar las cajas a 24 C durante 12 días. Paso 5 Pasados los 12 días de incubación, retirar los cuadritos de papel filtro del medio de cultivo junto con el hongo que creció en ellos, usando una pinza estéril; cumpliendo con todas las condiciones de asepsia, depositarlos en una caja petri estéril vacía. Colocarlos invertidos (la cara en que está el hongo hacia abajo) para que no se enrollen al secarse. Secar los cuadritos de papel filtro durante 7 días a 24 C. Paso 6 Pasar los cuadritos secos (con una pinza estéril) a bolsitas de papel mantequilla estéril, las cuales se introducen, a su vez, en otra bolsa más grande del mismo material. Colocar en las bolsitas toda la información referente al hongo, como la fecha de almacenamiento, el nombre de la cepa, etc. El hongo R. solani se debe almacenar a 20 C. 7-18

19 Guía Práctica 7: Rhizoctonia solani Enfermedad: Pudrición radical por Rizoctonia 2. Conservación como suspensión en solución de peptona-sucrosa, en papel filtro a 20 o C La conservación de un patógeno suspendido en solución de peptona-sucrosa que se deposita luego en papel filtro, es uno de los métodos más efectivos para almacenarlo. Materiales Peptona al 10% Sucrosa al 20% Cajas petri con el hongo de 10 días de crecimiento Espátula y papel filtro cortado en cuadros de 0.5 cm 2 Cajas petri vacías Preparación de las soluciones de peptona y de sucrosa Se toman 10 g de peptona y se disuelven en 100 ml de agua destilada. Se prepara de igual modo una solución de sucrosa al 20%, disolviendo 20 g de este producto en 100 ml de agua destilada. Las dos soluciones, que se preparan por separado, se llevan al autoclave. Una vez esterilizadas, se mezclan partes iguales de cada una en un recipiente estéril para hacer una solución homogénea de peptona-sucrosa. 7-19

20 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Foto 30 Tomar una caja petri que contenga el hongo purificado e incrementado (ver C., 2. Aislamiento monomicelial) y agregar 2 ml de la solución de peptona-sucrosa (Foto 30). Raspar con una espátula estéril la caja petri (Foto 31) para desprender el micelio o los esclerocios del hongo (o ambas estructuras). Dejar la suspensión en la misma caja petri. Foto 31 Foto 32 Paso 3 Tomar los cuadritos de papel filtro estériles con una pinza (ver F., 1. Conservación en ), colocarlos en la suspensión del hongo y asegurarse de que queden bien impregnados (Fotos 32). Paso 4 Retirar los cuadritos de papel filtro de la caja petri y colocarlos en una caja petri estéril con papel filtro en el fondo para que se sequen durante 7 días a 24 C (Foto 33). Foto

21 Guía Práctica 7: Rhizoctonia solani Enfermedad: Pudrición radical por Rizoctonia Paso 5 Transcurrido ese tiempo, guardar los cuadritos en sobres estériles de papel mantequilla (Foto 34) para almacenarlos a 20 C. Colocar luego en ellos la información referente al hongo, o sea, la fecha de almacenamiento, el nombre de la cepa, etc. (Foto 35). G. Prueba de almacenamiento Esta prueba es la forma clara, práctica y confiable de garantizar que el hongo secado por 7 días está libre de contaminantes y que puede ser almacenado. Foto 34 Tomar uno de los cuadritos de papel filtro que había sido impregnado con la suspensión de R. solani y que fue secado por 7 días a 24 C (ver Paso 4 anterior). Sembrar el cuadrito en un nuevo medio de cultivo PDA. Después de 5 días, el patógeno almacenado debe haber crecido en este medio de cultivo. Foto

22 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Paso 3 Observar el crecimiento del hongo en el estereoscopio. Si presenta agentes contaminantes, como otros hongos o bacterias, tanto la muestra observada como los demás cuadritos de papel filtro deberán desecharse, y se repetirá entonces el proceso de conservación. H. Recuperación del hongo almacenado 1. Conservado en papel filtro a 20 o C Foto 36 Trasladar, con una pinza estéril, uno de los cuadritos de papel filtro que portan el hongo que habían sido almacenados en bolsitas (ver F., 1. Conservación en, Paso 6) a una caja petri (Foto 36) que contenga el medio de cultivo PDA. Incubar a 24 ºC. Pasados 3 días después de la incubación, el hongo reiniciará su crecimiento y a los 8 días estará listo para ser incrementado. 7-22

23 Guía Práctica 7: Rhizoctonia solani Enfermedad: Pudrición radical por Rizoctonia 2. Conservado a 20 o C en papel filtro de suspensión en peptona-sucrosa Sacar de los sobres de papel mantequilla 1 o 2 cuadraditos de papel filtro que llevan el hongo y que fueron almacenados a 20 C (ver F., 2. Conservación como, Paso 5) y sembrarlos en una caja petri que contenga el medio de cultivo PDA (Foto 37). Repetir la misma operación con los diferentes aislamientos. Incubar las cajas a 24 C durante 12 días. Después de 3 o 4 días se observará que una colonia del hongo cubre el medio en la caja. Después de 12 días, el hongo estará listo para nuevos ensayos o pruebas. Foto