INDUCCIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE INTERFERÓN GANMA (IFN- ) EN CULTIVOS DE LINFOCITOS T DE BOVINOS CON HIPODERMOSIS

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1 INDUCCIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE INTERFERÓN GANMA (IFN-γ) EN CULTIVOS DE LINFOCITOS T DE BOVINOS CON HIPODERMOSIS MODULATORY EFFECT OF THE HIPODERMIN A ON THE SECRETION OF GAMMA INTERFERON (IFN-γ) IN CULTURES OF LYMPHOCITES FROM CATTLE WITH HIPODERMOSIS DACAL V., PANADERO R., LÓPEZ C., VÁZQUEZ L., MORRONDO P., DÍEZ P. Parasitología y Enfermedades Parasitarias. Dpto. Patología Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad de Santiago de Compostela. 7. Lugo. ABSTRACT The effect of the antigen hipodermin A (HA) on the secretion of gamma interferon (IFN-γ) by lymphocytes of cattle infested and non infested by Hypoderma lineatum and its effect on the activity of the mitogens concanavalin A (Con A) and phytohemaglutinin (PHA) were studied. Cows that presented warbles on their back were used as positive animals and calves 6 months old as negative. The lymphocytes was isolated from those animals and they were cultivated for, 8 and 7h with µg of HA and different concentrations of both mitogens (Con A and PHA). The stimulation of lymphocytes with HA without mitogen, did not induce the secretion of INF-γ. The coincubation with Con A increased considerably the secretion of IFN-γ in the infested animals, with a maximum at 8 h. On the contrary, in cultures from negative animals the presence of HA diminished notably the effects of Con A. Something similar happened to PHA, so the negative animals showed basal levels. In cultures of positive animals incubated with µg/ml of PHA, IFN-γ levels raised when increasing the culture time. In conclusion, differences between negative and positive animals showed an inhibition on the secretion of IFN-γ in the first ones, which could be interpreted as an evasion strategy that would explain the survival of larvae in primo infected animals. INTRODUCCIÓN La hipodermosis es una miasis cutánea del ganado vacuno que guarda mucha relación con la edad y el estado inmunitario de los animales. Está comprobado, que el ganado vacuno desarrolla cierta resistencia tras repetidas exposiciones a las larvas de Hypoderma spp., como lo demuestra el hecho repetido de que los animales más jóvenes presenten, por lo general, un número de nódulos larvarios significativamente superior a los de más edad (GINGRICH, 98). Esta resistencia constituye un factor importante en el control de las poblaciones del parásito, comprobándose que es dependiente del número de exposiciones previas y del número de larvas que infesten al hospedador (COLWELL, 985). La respuesta humoral se ha estudiado ampliamente, permitiendo el desarrollo de técnicas de diagnóstico precoces, encaminadas a detectar anticuerpos y antígenos parasitarios (PANADERO y col., ; COLWELL y col., ). No obstante, es manifiesta la ausencia de relación directa entre los niveles de inmunoglobulinas séricas y el grado de resistencia alcanzado por los animales (PRUETT y BARRETT, 985; PANADERO, 996), por lo que se sospecha que la respuesta celular, que ha sido menos investigada hasta el momento, desempeña un papel muy importante en la respuesta protectora frente a esta parasitosis.

2 NELSON y WEINTRAUB (97) denunciaron que la respuesta celular estaba implicada en la inmunidad frente a Hypoderma, como lo demostraba la fuerte reacción celular producida tras la penetración de las larvas, en especial en los animales reinfestados. Tras esta primera aproximación, BARON y WEINTRAUB (986) estudiaron la respuesta linfoproliferativa en animales primo y reinfestados tras la activación con distintos mitógenos. Estos autores sugierieron que la resistencia adquirida frente a la hipodermosis era de base celular y en ella participaban células T y B. Sin embargo, todavía se desconoce el patrón exacto de secreción de distintas citoquinas por parte de los linfocitos activados, de modo que es importante conocer si la protección se debe al predominio de la respuesta linfocitaria tipo I (Th), y a la consiguiente liberación de citoquinas que tienen un efecto estimulador de la inmunidad celular, o bien se trata de la respuesta tipo II (Th), donde predomina la liberación de citoquinas cuyo efecto principal es la regulación de la producción de anticuerpos. Dentro de la respuesta celular Th destaca el IFN-γ, que es una citoquina producida por linfocitos T y células NK (ROMAGNANI, 997). A parte de su clara actividad antiviral y reguladora del crecimiento celular, sus propiedades inmunomoduladoras son con toda probabilidad las más importantes. El IFN-γ es el principal activador de la función de los macrófagos y también regula el proceso de diferenciación de las células mieloides (BOEHM y col., 997). Además, juega un papel importante en el crecimiento y diferenciación de los linfocitos citotóxicos, activa las células NK y actúa como un factor de maduración de los linfocitos B. Su papel exacto en el desarrollo de ciertas enfermedades y en la terapia todavía no está muy claro; se sabe que está implicado en la defensa frente a parásitos, patógenos intracelulares y posiblemente también ante células tumorales (STARK y col., 998). El presente trabajo se realizó con objeto de estudiar el efecto de la hipodermina A (HA), sobre la secreción de IFN-γ, por los linfocitos de bovinos infestados y no infestados por Hypoderma lineatum observando la acción moduladora de esta sobre la actividad de los mitógenos concanavalina A y fitohemaglutinina. MATERIAL Y MÉTODOS La obtención del antígeno de Hypoderma se llevó a cabo a partir de larvas de H. lineatum recogidas de la submucosa esofágica de bovinos sacrificados en matadero. Las L permanecieron congeladas a -ºC hasta el momento de obtener el antígeno. La hipodermina A (HA) se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico empleando DEAE (diethylaminoetil) ligado a celulosa (DEAE-celulosa, Whatman) como intercambiador aniónico. Posteriormente, se determinó la concentración proteica de esta mediante la técnica del BCA de Pierce. La concentración observada fue de, mg/ml. Para obtener sangre de animales infestados se emplearon como animales positivos vacas de a 8 años, las cuales presentaban nódulos larvarios de Hypoderma en el dorso durante el periodo de la toma de muestras. Ante la dificultad de encontrar ganado vacuno adulto que no hubiera estado nunca en contacto con las larvas parásitas (negativos), tomamos la sangre de terneros procedentes de una explotación de ganado vacuno de la provincia de Lugo. La edad de los terneros escogidos fue de aproximadamente 6 meses. Las muestras sanguíneas se tomaron por punción de la vena caudal en tubos de vidrio heparinizados. En ambos casos (infestados y no infestados), la sangre procedente de distintos animales se mezcló para evitar posibles variaciones individuales. Posteriormente

3 se aislaron los linfocitos depositando en tubos de vidrio 6 ml de una solución comercial (Biocoll δ,77) a la que se le añadió cuidadosamente ml de sangre heparinizada y a continuación se centrifugó a g durante minutos (Esquema ). Esquema : Protocolo de aislamiento linfocitario LINFOCITOS S Después del aislamiento se realizó un análisis de la viabilidad celular con azul tripán, y a continuación se ajustó la concentración a 5 x 6 linfocitos/ml usando para ello medio de cultivo completo que contenía RPMI-6, suero fetal bovino (SFB) descomplementado, UI/ml de penicilina, µg/ml de estreptomicina y µl/ml de anfotericina B. Posteriormente se añadieron los mitógenos concanavalina A (Con A, Biochrom) y fitohemaglutinina (PHA-L, Biochrom) a razón de 5, y µg/ml, dejando un pocillo sin estimular al que se le añadieron µl de PBS. Al mismo tiempo se sensibilizaron los linfocitos con µg de HA. De esta forma se cultivaron los linfocitos de los animales positivos y negativos a Hypoderma. Después de, 8 y 7 horas de incubación, a una temperatura de 7ºC, en una atmósfera de CO al 5% y con un 95 % de humedad, se recogió el sobrenadante de cada pocillo centrifugándolo a 8 g durante minutos y se congeló a -8ºC. La cuantificación del interferón-γ se llevó a cabo mediante el ensayo comercial IFN-γ-Bovine EASIA (BIOSOURCE). RESULTADOS Y DISCUSIÓN La estimulación de los linfocitos con la hipodermina A en ausencia de mitógenos, no induce la secreción de INF-γ. Estos resultados coinciden con los de MOIRÉ y col. (997) quienes demostraron que esta proteasa de la familia de las tripsinas degrada los marcadores de superficie implicados en la activación de los linfocitos, inhibiendo por tanto la secreción de determinadas citoquinas, entre las que se encuentra el INF-γ. De acuerdo con estos autores, el efecto de la HA sobre los linfocitos comenzaría en las fases tempranas de la estimulación y los efectos pueden revertirse retirando la HA. Esta actividad enzimática también podría estar implicada en la inhibición de la proliferación linfocitaria. FISHER y col. (99) y CHABAUDIE y BOULARD (99) fueron los primeros en sugerir el papel de esta enzima en la inmunosupresión observada en los animales infestados. Así, la HA actúa degradando el componente C del complemento implicado en la respuesta antígeno-

4 específica y en el control de la linfoproliferación (BOULARD, 989; BARON, 99; ERDEI y col., 99). Al cultivar en presencia del mitógeno concanavalina observamos el siguiente comportamiento: Abs (5 nm) Abs (5 nm) Abs (5 nm) Testigo (+) Testigo (-) Positivo Negativo h 8h 7h h 8h 7h h 8h 7h Horas de cultivo Fig.- Niveles de IFN-γ en linfocitos estimulados con HA y en presencia de 5 (A), (B) y µg/ml de Con A A B C En la figura A se aprecia que la co-incubación de la HA con 5 µg/ml de Con A produjo, en los cultivos de animales no infestados, una disminución de la respuesta al mitógeno. Así, la presencia de Con A provocó un aumento en los niveles de INF-γ que alcanzó niveles máximos (D.O.,7) tras 8h de incubación; mientras que la adición de HA disminuyó los niveles de esta citoquina. Por el contrario, en los cultivos de animales infestados la exposición a la HA no redujo la respuesta a la Con A, excepto en los incubados durante h. Al aumentar la concentración de mitógeno a µg/ml observamos de nuevo que en los cultivos procedentes de animales negativos la presencia de HA disminuyó notablemente los efectos de la Con A. En cambio, en los cultivos de animales infestados la secreción de INF-γ aumentó notablemente con respecto a sus testigos, con valores máximos (D.O..9) alcanzados tras 8h de cultivo. Finalmente, al añadir µg/ml de mitógeno vemos que el comportamiento de los linfocitos de terneros sin infestar fue similar a los casos anteriores. Los cultivos de vacas infestadas reprodujeron el mismo comportamiento que en casos anteriores, obteniéndose mayores diferencias con respecto a los testigos a las 8 h de cultivo (D.O.,6 vs,9). Es de destacar el hecho de que en los cultivos de animales negativos la HA ejerce un papel inmunosupresor que produce una disminución en los efectos del mitógeno y que se traduce en una disminución de la secreción de INF-γ. Estos resultados contrastan con los de CHABAUDIE y BOULARD (99) quienes no encontraron una actividad moduladora de

5 esta hipodermina sobre la actividad blastogénica de la concanavalina A, aunque sí al emplear la fitohemaglutinina. No obstante, tenemos que señalar que de acuerdo con varios estudios llevados a cabo con Fasciola hepatica no existe una relación entre los índices de estimulación (linfoproliferación) y los niveles de INF-γ (CLERY y col., 996; BOSSAERT y col., ) Por el contrario, en cultivos de animales infestados la presencia de HA estimula la secreción de esta citoquina. De acuerdo con BARON y WEINTRAUB (987) el ganado expuesto repetidamente a la infestación por Hypoderma presenta una cierta resistencia que se manifiesta por un menor número de barros en el dorso. Estos animales resistentes presentaron una mayor respuesta a los antígenos y a los mitógenos Con A y PWM. Al cultivar en presencia del mitógeno fitohemaglutinina observamos el siguiente comportamiento: Abs (5 nm) Abs (5 nm) Abs (5 nm) Testigo (+) Positivo Testigo (-) Negativo h 8h 7h h 8h 7h h 8h 7h Horas de cultivo Fig.- Niveles de IFN-γ en linfocitos B estimulados con HA y en presencia de 5 (A), (B) y µg/ml de PHA A B C Los linfocitos de animales negativos incubados con HA y 5 µg/ml de PHA mantuvieron niveles muy bajos de INF-γ, con excepción de los incubados durante 7h. Estos últimos, no incubados con HA, presentaron un ligero aumento en los niveles de esta citoquina. En los cultivos de vacas con hipodermosis el nivel máximo de INF-γ se alcanzó a las 8 h con un valor de D.O. de,99 que se mantuvo casi constante en los cultivos incubados durante 7 h. Al co-incubar con µg/ml de fitohemaglutinina observamos que en los cultivos de animales negativos los niveles de INF-γ fueron muy bajos en todo el estudio, manteniéndose en valores de D.O. inferiores a,7. En los cultivos de vacas infestadas observamos niveles máximos a las 8h con un valor de D.O. de,5 y no se observaron diferencias con respecto a los testigos, por lo que podemos deducir que la presencia de HA no modifica la respuesta a la PHA. Finalmente, con la concentración de µg/ml de PHA vemos, al igual que en los casos anteriores, que la presencia de este mitógeno en cultivos de animales negativos no provoca un aumento en los niveles de INF-γ y que la presencia del antígeno HA no modifica los patrones de secreción de esta citoquina. Por el contrario, en los cultivos

6 de linfocitos de vacas infestadas co-estimulados con el mitógeno y la HA, el nivel de INF-γ aumentó al incrementar el tiempo de cultivo hasta llegar a un valor de,6 (7h). Sus testigos, incubados en ausencia de antígeno, presentaron un máximo a las 8 h. En este apartado llama la atención la ausencia de respuesta a la PHA por parte de los linfocitos de terneros no infestados, tanto en presencia como en ausencia de la HA. Por el contrario, en los cultivos de animales positivos se observó una marcada respuesta dosisdependiente frente a este mitógeno; no obstante, no se observó ningún efecto de la HA sobre la respuesta inducida por la PHA, excepto en los cultivos incubados durante 8h. En estos, la presencia de la HA originó un descenso en la secreción de INF-γ por parte de los linfocitos. El efecto modulador de la HA sobre el mitógeno PHA ha sido ampliamente estudiado por diversos autores. CHABAUDIE (99) señaló que la acción moduladora se ejerce sobre los linfocitos y no sobre los mitógenos, de acuerdo con sus resultados la HA inhibe los linfocitos estimulados por la PHA. En este sentido, NICOLAS-GAULARD y col. (995) observaron un descenso en la producción de IL- por linfocitos estimulados por la PHA en presencia de la HA. Estas autoras relacionan la baja producción de esta citoquina con un aumento en la secreción de prostaglandinas (PGE), potentes moléculas antiproliferativas producidas por monocitos y macrófagos que inhiben la secreción de IL- y la síntesis de INF-γ por los linfocitos T en infecciones experimentales con parásitos tales como Leishmania o Trypanosoma cruzy (TARLETON, 988). CONCLUSIONES La fracción antigénica hipodermina A produce un efecto modulador sobre la actividad de los mitógenos fitohemaglutinina y concanavalina A, inhibiendo la secreción de INF-γ por los linfocitos de animales jóvenes no infestados. Por el contrario, en los cultivos correspondientes a animales infestados la respuesta fue más variable. Las diferencias encontradas entre los niveles de secreción de INF-γ por parte de los cultivos de animales negativos y positivos, ponen en evidencia un efecto inhibidor de la secreción de esta citoquina lo que se interpretaría como un mecanismo de evasión que explicaría la buena supervivencia de las larvas en animales primoinfestados. AGRADECIMIENTOS Este trabajo ha sido financiado por el Proyecto de Investigación AGL--87/GAN del MCYT y gracias a la concesión al autor principal del trabajo de una beca FPU (97- del MECD). REFERENCIAS BARON, R.W.; WEINTRAUB, J. (986). Immunization of cattle against hypodermatosis (Hypoderma lineatum (De Vill.) and H. bovis (L.) using H. lineatum antigens. Veterinary Parasitology, : -5. BARON, R.W.; WEINTRAUB, J. (987). Lymphocyte responsiveness in cattle previously infested and uninfested with Hypoderma lineatum (De Vill.) and Hypoderma bovis (L.) (Diptera: Oestridae). Veterinary Parasitology, : -5.

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