RESUMEN CIENTÍFICO: LA CONSTRUCCIÓN DE HUESOS POR DESACTIVACIÓN DE GENES
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- Margarita Soler Calderón
- hace 7 años
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1 RESUMEN CIENTÍFICO: LA CONSTRUCCIÓN DE HUESOS POR DESACTIVACIÓN DE GENES Introducción La remodelación ósea es el proceso por el cual el hueso se renueva adaptándose a los cambios y manteniendo su homeostasis mineral, evitando así la acumulación de microdaños o fracturas en el tejido óseo. Se lleva a cabo mediante la coordinación de los mecanismos de resorción de hueso por los osteoclastos y la síntesis de hueso nuevo por las células denominadas osteoblastos. Este proceso se inicia con el reclutamiento y activación de los precursores monocíticos de los osteoclastos, procedente de la línea mieloide, que se encuentran en la circulación sanguínea. Estos precursores se unen a la matriz ósea mediante receptores de integrinas y otras moléculas sellando las zonas de resorción ósea. Por otra parte, las células osteoprogenitoras se diferencian en osteoblastos que sintetizan la nueva matriz ósea en las denominadas superficies formadoras de hueso. De estos últimos progenitores también se forman osteocitos que quedarán incorporados en la matriz ósea como función de soporte y de regulación de la remodelación. Por último, se encuentran las células de revestimiento que sirven de protección cubriendo la superficie del hueso. Todo este conjunto formarían las BMU (bone multicelular units) 1 Una pérdida de regulación del proceso mencionado puede desembocar en alteraciones metabólicas óseas, cuya principal representante es la osteoporosis. Éstas afectan a una gran parte de población, fundamentalmente femenina y de avanzada edad, ya que la deficiencia de estrógenos juega un importante papel. Debido al incremento de la esperanza de vida en países desarrollados cabe esperar una mayor incidencia de este tipo de enfermedades, por lo que se requerirá el desarrollo de tratamientos y terapias eficaces. 2 Estos desórdenes pueden deberse a diferencias en la producción de reguladores sistémicos y locales, cambios en los receptores, alteraciones en los mecanismos de transducción de señales, modificaciones en factores de transcripción nuclear y en las enzimas que interfieren en la producción e inactivación de los reguladores. Todo esto puede resultar en un aumento de la fragilidad del esqueleto provocado por un exceso de resorción ósea que conlleva a un deterioro de la microarquitectura y un descenso de la masa ósea; o por una insuficiente formación ósea en respuesta al exceso de resorción que se da por la remodelación, principalmente. 3
2 Hasta el momento, los tratamientos farmacológicos para la osteoporosis se han centrado principalmente en la inhibición o disminución de la resorción ósea, es decir, son anticatabólicos. Una de las primeras terapias se basaba en la administración de estrógenos que eran capaces de reducir la incidencia de fracturas óseas pero, que en ciertos pacientes, podría aumentar el riesgo de cáncer de mama y de enfermedades vasculares. Otro de los posibles tratamientos empleados consiste en la administración de bifosfonatos, sustancias que se unen a la superficies del hueso y son tomados por los osteoclastos conduciendo a su inactivación y su muerte celular. En varios estudios se observó que un uso prolongado puede causar una inhibición excesiva de la remodelación ósea, complicando la reparación de fracturas y microdaños, ya que se evita una mayor pérdida de hueso pero no se estimula la formación de nuevo tejido óseo 3. Por todo esto, se comenzó a emplear un tratamiento basado en la hormona paratiroidea que es capaz de estimular la formación de hueso nuevo pero, alterando la resorción. No obstante puede dar efectos secundarios como hipercalcemia e hipercalciuria, además del desarrollo de osteosarcomas si se administran dosis elevadas o largas duraciones 4-6. Por todo esto, se requieren nuevas terapias que puedan administrarse de forma dirigida, causando menos efectos adversos y que, además, estimulen la formación de hueso sin alterar la resorción. 6 Uno de los principales retos para la búsqueda y administración de nuevas terapias basadas en sustancias anabólicas que estimulen el desarrollo de hueso es la dificultad de su administración en el lugar donde debe actuar, es decir, en las BMU 4. Como se observa en la figura 1, estas zonas sería solamente accesibles a través de capilares. Figura 1. Apartados A-C: Imágenes histológicas de las BMUs. Se aprecian osteoclastos (OC) y osteoblastos (OB), entre otras células. El apartado D muestra un esquema de la estructura mencionada. Imagen extraída de 4
3 La mayoría de las células localizadas en las BMUs son el objetivo del estudio realizado por Zhang et al en el que se pretende incorporar un sirna capaz de silenciar el gen Plekho 1 en las células que se encuentran en las superficies de formación. Este gen, también llamado CKIP -1 codifica para la proteína casein kinase 2 interacting protein-1 (CKIP-1; figura 2) que contiene un dominio N-terminal con homología a pleckstrin, un motivo de cremallera de leucina en el extremo C-terminal y cinco motivos ricos en prolina a lo largo de la proteína que median interacciones con numerosas proteínas celulares entre las que nos interesa destacar smurf 1 7. CKIP-1 regula las modificaciones postranscripcionales de algunas proteínas para mediar la interacción entre enzima y sustrato facilitando su fosforilación y ubiquitinación. Se ha demostrado queckip-1 interactúa y promueve la actividad E3 ligasa de smurf 1 (Smad ubiquitylation regulatory factor 1) aumentando su afinidad por los sustratos. La formación de un complejo entre estas dos proteínas provoca un cambio conformacional que facilita la ubiquitinación y degradación en el proteasoma de ciertas proteínas osteoblasticas dificultando la formación de nuevo hueso 5, 7. Fundamentos experimentales. Actualmente, hay dos tipos de moléculas que se emplean en terapias dirigidas hueso: los bifosfonatos que sienten afinidad por superficies de formación y de resorción; y los oligopéptidos (como el Asp 8 ) que presentan una gran afinidad por las superficies de resorción 6. Puesto que la terapia que se busca está orientado exclusivamente a las superficies de formación de hueso, los autores del texto han desarrollado un sistema que consiste en DOTAP-based cationic liposome con 6 secuencias repetidas de AspSerSer que contiene el sirna de interés. Esta afinidad diferencial entre las distintas moléculas por las superficies óseas se debe a los diferentes patrones de los cristales de hidroxiapatita que se observan en la zona de resorción y de formación. 6 Figura 2. Representación esquemática de la terapia propuesta basada en un sirna que silencie el gen Plekho 1. Imagen tomada de 5.
4 Para comprobar la direccionalidad de las moléculas y su afinidad por las diferentes zonas del hueso se inyectó en ratas adultas xylenol orange (XO) que se une a la deposición de hueso nuevo en las superficies de formación dando una fluorescencia de color rojo. Tras esto, se inyectan a un grupo de ratas el oligopéptido Asp 8 unido a FITC y al otro grupo la molécula (AspSerSer) 6 también marcada con FITC. Como se muestra en la figura 3 puede observarse que las superficies de formación emitían una mayor fluorescencia de color verde (debida a FITC) en las ratas inyectadas con (AspSerSer) 6. Por el contrario, en las ratas que fueron inyectadas con Asp 8 se apreciaba mayor fluorescencia en las zonas de resorción. Por otra parte, se coinyectó una población de ratas con (AspSerSer)6-FITC y Asp8-rhodamine y se vio que había una colocalización muy débil. Estas mediciones de fluorescencia se realizaron en secciones de hueso descalcificado mediante microscopía láser confocal. Figura 3. Apartado A.: Sección de hueso descalcificado tratado con Asp 8 o (AspSerSer) 6 observado mediante microcopía láser confocal. Apartado B: Sección de hueso descalcificado de ratas coinyectadas con (AspSerSer)6-FITC y Asp8-rhodamine. Imagen tomada de 6
5 Un segundo experimento consistió en el examen in vivo de la distribución del sirna en algunos órganos como corazón, bazo, pulmones, riñones y hueso. Para ello se empleó tecnología de imagen biofotónica que ayudó a detectar la localización de sirna Plekho 1 marcado con el fluorocromo FAM. Esta molécula se inyectó de diferentes formas en distintos grupos de ratas hembras: de forma libre, contenido en un liposoma con (AspSerSer) 6, contenido en un liposoma sin el oligopéptido anterior o con in vivo jetpei como control positivo. A la vista de la figura 4, se dedujo que la intensidad de fluorescencia intraósea era mayor en el grupo al que se había inyectado el liposoma con (AspSerSer) 6. Sin embargo en hígado era menor que en as ratas tratadas con in vivo jetpei. Casi no se apreciaba fluorescencia en corazón, bazo, pulmos, riñones excepto una pequeña señal en riñones en las inyectadas con sirna libre Los datos cuantitativos de fluorescencia coincidían con las imágenes obtenidas. También se examinó la expresión de la proteína Plekho 1 mediante un westernblot y de su mrna por real-time PCR en hueso y en tejidos no esqueléticos. Figura 4. En el apartado A se muestra la localización del sirna marcado con FAM mediante el análisis de imagen biofotónica. Apartado C: westernblots de la expresión de Plekho 1 en distintos órganos. Imagen modificada de 6
6 La figura 5 muestra imágenes obtenidas por microtomografía computerizada de hueso trabecular procedente de la tibia proximal de distintas ratas hembras de 6 meses de edad sin la enfermedad tras la inyección del sirna de forma libre, contenido en un liposoma con (AspSerSer) 6 o contenido en un liposoma sin el oligopéptido anterior. Los datos indican que El grupo con (AspSerSer) 6 mostraba aumento en BMD (densidad de masa ósea), volumen óseo relativo, grosor trabecular, número de trabéculas y densidad de conectividad. Además se muestra una arquitectura mejor organizada 5, 6. Figura 5. Arquitectura tridimensional de hueso trabecular obtenido por microtomografía computerizada in vivo. Tomada de 6.
7 Conclusiones y opinión personal El desarrollo de nuevas terapias orientadas al tratamiento de la osteoporosis o incluso a la curación de fracturas o de otras enfermedades asociadas al sistema esquelético han sido mejoradas gracias a los estudios realizados por este y otros grupos de investigación. Este nuevo enfoque de tratamiento de las enfermedades óseas mediante la estimulación de formación de hueso permite una mejor solución a dichos problemas así como una disminución en los efectos secundarios producidos por la falta de un sistema que permita realizar una inserción de sirna dirigida a las zonas deseadas. Estos resultados suponen un gran avance en el campo clínico, ya que es posible activar selectivamente un solo aspecto de la unidad remodeladora sin influir en gran medida sobre los demás factores u órganos. No obstante, aún quedan una gran cantidad de ensayos que realizar para que estas terapias sean aplicables a personas de forma eficaz y segura. Referencias 1. Clarke, B. Normal bone anatomy and physiology. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 3 Suppl 3, S131-9 (2008). 2. Erviti, J. Drugs prescription for osteoporosis. An. Sist. Sanit. Navar. 26, (2003). 3. Raisz, L. G. Pathogenesis of osteoporosis: concepts, conflicts, and prospects. J. Clin. Invest. 115, (2005). 4. Khosla, S. Building bone to reverse osteoporosis and repair fractures. J. Clin. Invest. 118, (2008). 5. Clifford, J. R. Building bones by knocking down genes. Nat. Med. 18, (2012). 6. Zhang, G. e. a. A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy. Nat. Med. 18, (2012). 7. Nie, J. et al. CKIP-1: A scaffold protein and potential therapeutic target integrating multiple signaling pathways and physiological functions. Ageing Res. Rev. 12, (2012).
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