Plantas y cultivos transgénicos 1. Plantas y cultivos transgénicos. Cristina Rivas Wagner

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1 Plantas y cultivos transgénicos 1 Plantas y cultivos transgénicos Cristina Rivas Wagner

2 2 Cristina Rivas Wagner INDICE Introducción Qué son las plantas transgénicas 05 Ejemplos de tecnología MG que podrían beneficiar a la agricultura 05 Resistencia a las plagas. 06 Mejora del rendimiento.. 07 Tolerancia al estrés biótico y abiótico. 07 Uso de tierras marginales.. 08 Beneficios en cuanto a nutrición 08 Menor impacto ambiental 09 Otros beneficios de las plantas transgénicas 09 Fármacos y vacunas procedentes de plantas transgénicas.. 09 Obtención de vectores para transformación directa.. 11 Métodos de transformación 11 Electroporación de protoplastos 12 Biobalística 13 Transformación mediante infección con Agrobacterium 14 Plantas resistentes a los insectos: La toxina de Bacilus Thuringiensis 21 Plantas resistentes a herbicidas. 24

3 Plantas y cultivos transgénicos 3 Plantas resistentes a Virus: Estrategias para la protección de plantas mediante ingeniería.. 26 Expresión de proteínas de la cubierta y resistencia en plantas transgénicas 27 Uso de RNAs satélites 28 Uso de RNA antisentido 29 Producción de vacunas y compuestos farmacéuticos en plantas transgénicas 31 Anticuerpos en plantas transgénicas 32 Vacunas comestibles. 33 Productos transgénicos del futuro.. 36 Conclusión. 42 Anexos. 43 Bibliografía 47

4 4 Cristina Rivas Wagner INTRODUCCIÓN 1 Es imprescindible que mejoremos la producción y distribución de los alimentos, si es que queremos alimentar y librar del hambre a la creciente población mundial, al mismo tiempo que reducimos los impactos ambientales y generamos empleos productivos en las regiones de bajos ingresos. Para lograrlo, será necesario hacer un uso adecuado y responsable de los descubrimientos científicos y las nuevas tecnologías. Los creadores y supervisores de la tecnología MG aplicada a las plantas y los microorganismos, debieran cerciorarse de que sus esfuerzos atiendan esas necesidades. Mediante el uso de la tecnología MG es factible producir alimentos más nutritivos, estables en almacenamiento y, en principio, promotores de la salud (trayendo beneficios por igual a los consumidores de los países industrializados y en vías de desarrollo). Se requieren nuevos esfuerzos, por parte del sector público, para crear cultivos transgénicos que beneficien a los agricultores de escasos recursos de los países en vías de desarrollo y faciliten el acceso de éstos a los alimentos mediante la producción, con mano de obra intensiva, de cultivos básicos como maíz, arroz, trigo, yuca (mandioca), camote (ñame), sorgo, plátano macho (cambur) y batata (boniato). Se necesita el esfuerzo cooperativo de los sectores público y privado para desarrollar nuevos cultivos transgénicos que beneficien a los consumidores, sobre todo a los del mundo en vías de desarrollo. Deben hacerse esfuerzos concertados y organizados para investigar los posibles efectos ambientales (tanto positivos como negativos) de las tecnologías MG en cada una de sus aplicaciones específicas. Dicho efectos deben ser evaluados comparándolos con los causados por las tecnologías agrícolas ordinarias en uso actual. Es necesario implantar sistemas reguladores de salud pública en cada país, para identificar y hacer un seguimiento de cualquier efecto potencial adverso de las plantas transgénicas contra la salud humana, como se hace para cualquier otra nueva variedad vegetal. Las corporaciones privadas e instituciones de investigación deberían establecer acuerdos para compartir la tecnología MG (que está controlada actualmente por medio de patentes y acuerdos de licencia sumamente estrictos) con científicos responsables, que la utilicen para aliviar el hambre y promover la seguridad alimenticia de los países en vías de desarrollo. Además, conviene que los agricultores de escasos recursos del mundo entero cuenten con exenciones especiales para protegerlos de las restricciones inadecuadas en cuanto a la propagación de sus cultivos.

5 Plantas y cultivos transgénicos 5 QUÉ SON LAS PLANTAS TRANSGÉNICAS? 2 La planta transgénica contiene uno o más genes que han sido insertados en forma artificial en lugar de que la planta los adquiera mediante la polinización. La secuencia génica insertada (llamada el transgen) puede provenir de otra planta no emparentada o de una especie por completo diferente: por ejemplo, el maíz Bt, que produce su propio insecticida, contiene un gen de una bacteria. Las plantas que tienen transgenes a menudo son llamadas genéticamente modificadas o cultivos GM, si bien en realidad todos los cultivos han sido genéticamente modificados con respecto a su estado silvestre original mediante la domesticación, la selección y el mejoramiento controlado a través de períodos prolongados. EJEMPLOS DE TECNOLOGÍA MG QUE PODRÍAN BENEFICIAR A LA AGRICULTURA 3 Hasta la fecha, la tecnología MG ha servido, más que nada, para producir varios cultivos agrícolas con características "dictadas por el mercado", algunas de las cuales han alcanzado el éxito comercial. El desarrollo de variedades producidas comercialmente en países como Estados Unidos y Canadá, se ha enfocado en aumentar la vida en anaquel de las frutas y verduras, conferir resistencia contra virus o insectos y conferir tolerancia a herbicidas específicos. Aunque estas características han resultado benéficas para los agricultores, ha sido difícil lograr que los consumidores vean algún beneficio como no sea, en casos limitados, un mejor precio debido al abatimiento de los costos y la mayor facilidad de producción (Nelson y cols. 1999; Falck-Zepeda y cols. 1999). Una posible excepción es el desarrollo de tecnología MG para retrasar la maduración de las frutas y verduras, lo que permite tenerlas almacenadas por más tiempo. Los agricultores se beneficiarían con este avance al disponer de mayor flexibilidad en cuanto a producción y cosecha. Los consumidores también se beneficiarían al poder adquirir frutas y verduras, como los jitomates transgénicos modificados para que se ablanden más

6 6 Cristina Rivas Wagner lentamente que las variedades tradicionales, lo que significa mayor duración en almacenamiento, menor costo de producción, más calidad y menos precio. Existe la posibilidad de que los agricultores de los países en vías de desarrollo se beneficien considerablemente con los cultivos que maduran o se ablandan lentamente, pues eso podría darles mayor flexibilidad para la distribución de la que disponen actualmente. En muchos casos, los agricultores en pequeño sufren graves pérdidas debido a la maduración o reblandecimiento excesivos o descontrolados de sus frutas o verduras. El verdadero potencial de la tecnología MG para ayudar a resolver algunos de los problemas más graves de la agricultura mundial acaba de empezar a ser explorado. Los siguientes ejemplos nos mostrarán cómo puede aplicarse la tecnología MG en algunos problemas agrícolas específicos en los que indicamos los beneficios potenciales. Resistencia a las plagas 3.1 Obviamente, los agricultores se beneficiarían si se desarrollan plantas transgénicas resistentes a plagas específicas. Por ejemplo, en Hawai se han estado vendiendo y plantando, desde 1996, papayos resistentes a la mancha anular viral de la papaya (Gonsalves 1998). Por otra parte, el ambiente también se beneficiaría al aminorar el uso de plaguicidas. Los cultivos transgénicos que contienen genes de resistencia a los insectos, procedentes de Bacillus thuringiensis, han hecho posible reducir considerablemente la cantidad de insecticida que se le aplica al algodón en Estados Unidos. En un análisis, por ejemplo, se demostró que hubo una reducción de dos millones de hectáreas tratadas en 1999, es decir, un millón de kilogramos de insecticidas químicos, en comparación con 1998 (U.S. National Research Council 2000). Sin embargo, las poblaciones de plagas y organismos fitopatógenos se adaptan rápidamente y se vuelven resistentes a los plaguicidas, y no existen razones para suponer que no ocurrirá lo mismo, y con la misma rapidez, en el caso de las plantas transgénicas. Además, los biotipos de las plagas varían de una región a otra. Por ejemplo, es probable que los cultivos resistentes a insectos diseñados para Estados Unidos y Canadá tengan resistencia a plagas que no ocasionan problemas en los países en vías de desarrollo, y esto ocurre por igual en las plantas transgénicas y en las desarrolladas por medio de técnicas de cruzamiento ordinarias. Incluso en el caso de que los mismos genes de resistencia a los insectos o los herbicidas sean útiles en varias regiones, normalmente es necesario introducirlos en cultivares adaptados a las condiciones locales. Por lo tanto, se requieren más investigaciones sobre las plantas transgénicas que se han vuelto resistentes a plagas locales, a fin de evaluar su sustentabilidad frente a un aumento en las presiones de selección para plagas cada vez más virulentas.

7 Plantas y cultivos transgénicos 7 Mejora del rendimiento 3.2 Una de las principales tecnologías que desembocaron en la "Revolución verde", fue la creación de variedades de trigo semienanas de alto rendimiento. Los genes responsables de esa reducción de altura fueron los genes japoneses NORIN 10 introducidos en los trigos occidentales durante la década de 1950 (genes del enanismo insensibles a la giberelina). Estos genes tenían dos ventajas: producían una planta más corta y fuerte, que respondía bien a la aplicación de más fertilizante sin colapsarse; y aumentaban directamente el rendimiento al reducir la elongación celular de las partes vegetativas de la planta, de modo que ésta invertía más energía en las partes reproductivas comestibles. Estos genes fueron aislados en fechas recientes, y se demostró que actúan exactamente de la misma manera cuando se les utiliza para transformar otras especies de plantas agrícolas (Peng y cols. 1999). Hoy por hoy, esta técnica de enanismo puede utilizarse para aumentar la productividad de cualquier planta agrícola cuyo rendimiento económico se encuentre en las partes reproductivas, en vez de en las vegetativas. Tolerancia al estrés biótico y abiótico 3.3 La creación de cultivos con resistencia intrínseca al estrés biótico y abiótico, ayudaría a estabilizar la producción anual. Por ejemplo, el virus de la mancha amarilla del arroz (RYMV) devasta los arrozales africanos al destruir directamente la mayor parte del cultivo, con un efecto secundario en las plantas sobrevivientes, a las que vuelve más vulnerables a las infecciones micóticas. Como resultado, este virus ha puesto en serio peligro la producción arrocera de África. Los métodos ordinarios de control del RYMV, que se basan en las técnicas tradicionales de cruzamiento, no han logrado introducir la resistencia de las especies silvestres en el arroz cultivado. Los investigadores han recurrido a una nueva técnica, que imita la "inmunización genética", al crear plantas de arroz transgénicas que son resistentes al RYMV (Pinto y cols. 1999). Actualmente, las variedades transgénicas resistentes están a punto de ser sometidas a pruebas de campo con el fin de evaluar la eficacia de su resistencia al RYMV. Esta podría ser la solución del riesgo de colapso total de las regiones arroceras del sub-sahara africano. Podríamos dar muchos otros ejemplos para ilustrar la gama de las investigaciones científicas actuales, como las plantas transgénicas modificadas para combatir el virus de la mancha anular de la papaya (Souza 1999), las papas resistentes al tizón (Torres y cols. 1999) y arroz resistente al tizón bacteriano de la hoja (Zhai y cols 2000), o como ejemplo de un factor abiótico, plantas modificadas para producir un exceso de ácido cítrico en las raíces que, de ese modo, toleran mejor el aluminio presente en los suelos ácidos (de la Fuente y cols. 1997). Estos ejemplos tienen un claro potencial comercial, pero será imprescindible, si es que queremos obtener los máximos beneficios, que la investigación de tecnología MG siga financiada con recursos públicos. Por ejemplo, pese a que la tecnología MG nos da acceso a nuevas pozas genéticas donde se encuentran fuentes de

8 8 Cristina Rivas Wagner resistencia, será necesario demostrar que dichas fuentes serán más estables que las fuentes de resistencia intraespecíficas usadas de manera ordinaria. Uso de tierras marginales 3.4 Una inmensa extensión de la superficie terrestre del planeta, tanto en las costas como en el interior de los continentes, se considera marginal porque es excesivamente salina o alcalina. Ya se logró identificar, clonar y transferir a otras plantas un gen de tolerancia a la sal presente en el mangle negro (Avicennia marina). Según se ha visto, las plantas transgénicas toleran mayores concentraciones de sal. Asimismo, el gen gutd, de Escherichia coli, ha servido para generar plantas de maíz transgénicas que toleran la sal (Liu y cols 1999). Estos genes representan una fuente potencial para el desarrollo de sistemas agrícolas que permitan el uso de las tierras marginales (M.S. Swaminathan, com. pers. 2000). Beneficios en cuanto a nutrición 3.5 La deficiencia de vitamina A es causa de que medio millón de niños queden parcial o totalmente ciegos cada año (Conway y Toennissen 1999). Los métodos tradicionales de mejora de plantas no han logrado producir cultivos que contengan altas concentraciones de vitamina A, de modo que la mayoría de los gobiernos dependen de costosos y complejos programas de complementación para atender este problema. Los investigadores han introducido tres nuevos genes en el arroz: dos de ellos proceden del narciso y uno de cierto microorganismo. El arroz transgénico exhibe mayor producción de beta-caroteno, el precursor de la vitamina A, y la semilla es de color amarillo (Ye y cols. 2000). Este arroz amarillo o dorado, puede ayudar a resolver el problema de la deficiencia de vitamina A entre los niños de las regiones tropicales. La fortificación con hierro es necesaria porque los cereales son deficientes en micronutrientes esenciales como este metal. La deficiencia de hierro provoca anemia en las mujeres embarazadas y los niños pequeños. Por consiguiente, cerca de 400 millones de mujeres en edad reproductiva sufren de esta afección y tienen mayores riesgos de muerte fetal o de parir niños con muy bajo peso, así como una mayor probabilidad de muerte por parto. La anemia ha sido identificada como un factor de riesgo en más de 20% de los casos de muerte posparto en Asia y África (Conway 1999a, b). Mediante el uso de genes relacionados con la síntesis de una proteína fijadora de hierro y con la producción de una enzima que facilita la absorción del hierro presente en los alimentos humanos, se produjo un arroz transgénico con altas concentraciones de hierro (Goto y cols. 1999; Lucca 1999). Estas plantas contienen de dos a cuatro veces más hierro que el arroz no transgénico, pero queda pendiente investigar su asimilación biológica.

9 Plantas y cultivos transgénicos 9 Menor impacto ambiental 3.6 La disponibilidad y el uso eficiente del agua se han convertido en temas de importancia mundial. Los suelos sometidos a labores de labranza intensa (arado) para el control de las malezas y la preparación del suelo, son propensos a la erosión y sufren una grave pérdida de agua. Las comunidades tradicionales han recurrido por muchos años a sistemas de labranza mínima. Existe la necesidad de crear cultivos que prosperen en tales condiciones, incluyendo la introducción de resistencia a enfermedades de las raíces que se controlan actualmente por medio de la labranza, así como de herbicidas que puedan ser utilizados en vez de la labranza (Cook 2000). Según se ha visto en los países más desarrollados, la tecnología MG es una herramienta útil para introducir resistencia a las enfermedades radiculares en condiciones de labranza mínima. Sin embargo, será necesario un cuidadoso análisis de tipo costo-beneficio, a fin de asegurar el logro del máximo provecho. Asimismo, será necesario evaluar minuciosamente las diferencias regionales en cuanto a técnicas agrícolas, así como el impacto potencial de la sustitución de un cultivo tradicional por uno nuevo de tipo transgénico. Otros beneficios de las plantas transgénicas 3.7 Las variedades transgénicas de primera generación han beneficiado a muchos agricultores en forma de menores costos de producción, mayores rendimientos o ambas cosas. En muchos casos, también han beneficiado al ambiente porque reducen el uso de plaguicidas o permiten la siembra de cultivos con menos actividades de labranza. Los insectos ocasionan enormes pérdidas agrícolas en el campo y en los productos cosechados que se encuentran en tránsito o almacenamiento, pero las preocupaciones en cuanto a la salud de los consumidores y el impacto ambiental, han limitado el registro de muchos plaguicidas químicos prometedores. Los genes de resistencia a las plagas, cuando son introducidos cuidadosamente en los cultivos para evitar la selección futura de resistencia a las plagas, constituyen alternativas con las que puede reducirse el uso de plaguicidas químicos en muchos cultivos importantes. Además, reducir la contaminación de nuestros alimentos por parte de patógenos que constituyen riesgos de salud por la vía alimenticia (p.ej., las micotoxinas), sería benéfico para los agricultores y consumidores por igual. Fármacos y vacunas procedentes de plantas transgénicas 3.8 Existen vacunas contra muchas de las enfermedades que le provocan grandes sufrimientos e incluso la muerte a numerosas personas en los países en vías de desarrollo, pero su producción y aplicación son normalmente muy costosas. Casi todas las vacunas deben ser almacenadas

10 10 Cristina Rivas Wagner en condiciones de refrigeración, y para su aplicación se depende de especialistas debidamente capacitados, lo que se suma a los gastos. En algunos países, incluso el costo de las agujas para inyectar las vacunas puede ser prohibitivo. Por consiguiente, suele suceder que las vacunas no llegan a quienes más las necesitan. Actualmente, los investigadores están estudiando el potencial de la tecnología MG para la producción de vacunas y fármacos por medio de plantas. Esto significaría un acceso más fácil, una producción más económica y una manera alternativa de generar ingresos. Ya se han producido vacunas contra enfermedades infecciosas del aparato digestivo en plantas como la papa y el plátano (banano) (Thanavala y cols. 1995). Otro objetivo adecuado serían los cereales. Recientemente se logró expresar, en semillas de arroz y trigo, un anticuerpo contra el cáncer que reconoce células cancerosas de pulmón, mama y colon y que, por lo tanto, puede ser útil para el diagnóstico y la terapia en lo futuro (Stoger y cols. 2000). Estas tecnologías se encuentran en una fase aún muy temprana de su desarrollo, y será necesario investigar las preocupaciones obvias en cuanto a la salud humana y la seguridad ambiental durante su producción, antes de que dichas plantas sean aprobadas como cultivos especiales. No obstante, la creación de plantas transgénicas para la producción de sustancias terapéuticas tiene un enorme potencial como una manera de ayudar a resolver los problemas de enfermedad en los países en vías de desarrollo. Casi una tercera parte de las medicinas que se utilizan actualmente se derivan de las plantas, uno de los ejemplos más famosos es el de la aspirina (la forma acetilada de un producto natural de las plantas, el ácido salicílico) Se cree que menos de 10% de las plantas medicinales han sido identificadas y caracterizadas, y existe la posibilidad de utilizar la tecnología MG de tal manera que aumente los rendimientos de las sustancias medicinales una vez identificadas. Por ejemplo, las valiosas sustancias contra el cáncer vinblastina y vincristina son los únicos medicamentos aprobados para el tratamiento del linfoma de Hodgkin. Ambas se derivan de la vincapervinca (hierba doncella) de Madagascar, que las produce en muy pequeñas concentraciones junto con 80 a 100 compuestos químicos muy similares. Por consiguiente, la producción de estos compuestos terapéuticos es sumamente costosa. En la actualidad se están llevando a cabo investigaciones intensivas con el fin de descubrir el potencial de la tecnología MG en cuanto se refiere a incrementar las concentraciones de compuestos activos o permitir su producción en plantas más fáciles de cultivar que la vincapervinca (Leech y cols. 1998). Es nuestra recomendación que la investigación y desarrollo de cultivos transgénicos debiera enfocarse en plantas que: (i) aumenten la estabilidad de la producción; (ii) le aporten beneficios nutritivos al consumidor; (iii) reduzcan el impacto ambiental de la agricultura intensiva y extensiva; y (iv) faciliten la producción de fármacos y vacunas; al mismo tiempo que (v) se desarrollen protocolos y reglamentos que aseguren que los cultivos transgénicos diseñados para satisfacer necesidades no alimenticias, como la producción de compuestos farmacéuticos, sustancias químicas industriales, etc., no se difundan o mezclen con otros cultivos alimenticios transgénicos o no transgénicos.

11 Plantas y cultivos transgénicos 11 OBTENCIÓN DE VECTORES PARA TRANSFORMACIÓN DIRECTA 4 Los vectores utilizados en la transformación de plantas mediante métodos directos, son plásmidos bacterianos en los que han sido clonados los genes a ser introducidos en el genoma vegetal. Estos vectores son de tamaño variable (2 a 50 kb). Una vez identificados los genes y las respectivas secuencias reguladoras, ellos son agrupados, formando una construcción que consta de un promotor, una secuencia codificadora, y una señal de terminación. Esas construcciones son luego introducidas en un vector adecuado, o sea en un plásmido bacteriano. Un vector contiene básicamente, los genes de interés a ser introducidos, los genes marcadores para transformación y selección, un origen de replicación, y un gen que confiere a las bacterias resistencia a un antibiótico. Uno de los genes marcadores más utilizados es el gus (uida), debido a que su expresión puede ser fácilmente detectada mediante métodos enzimáticos, colorimétricos y de fluorescencia. Como se mencionó, para la selección de las células transformadas se utilizan genes que confieren resistencia a antibióticos. Los más utilizados son el gen neo (npt II), que confiere resistencia a la canamicina, geneticina o paromomicina y el gen hpt, que confiere resistencia a la higromicina. También se puede recurrir a genes que confieren resistencia a herbicidas, como el bar, que codifica a la enzima fosfinotricina acetiltransferasa (PAT), confiriendo resistencia a la fosfinotricina. Existen diferentes métodos de aislamiento de plásmidos bacterianos. Todos ellos siguen tres etapas básicas: crecimiento de la bacteria y amplificación del plásmido, concentración y lisis de las células bacterianas, y purificación del plásmido. El método de aislamiento del plásmido por lisis alcalina ha sido empleado exitosamente en diferentes linajes de bacterias. Se basa en la naturaleza circular de los plásmidos y en el alto peso molecular del ADN cromosómico. Cuando un extracto celular se expone a un ph alcalino (cercano a 12), el ADN linear (cromosómico) se desnaturaliza mientras que el ADN circular (plásmido) permanece intacto. Luego el extracto es neutralizado con una solución de acetato de sodio, en presencia de una alta concentración salina, lo que hace que el ADN cromosómico precipite, junto con las proteínas. MÉTODOS DE TRANSFORMACIÓN 5 Los biólogos pueden recurrir a tres métodos, para introducir los genes de interés en la célula vegetal. Ellos son: electroporación de protoplastos, biobalística e infección con Agrobacterium.

12 12 Cristina Rivas Wagner - Electroporación de protoplastos: Se trata de un método utilizado para introducir macromoléculas en células vegetales. Llamamos protoplastos a las células vegetales desprovistas de su pared celular (Figuras 1 y 2). Cuando estos protoplastos son cultivados in vitro, pueden reconstituir su pared, dividirse por mitosis y regenerar una planta entera. La obtención de protoplastos requiere de la incubación del tejido vegetal en un medio de digestión compuesto de enzimas pectocelulolíticas, como las que digieren la celulosa, las hemicelulosas, y las pectinas, que son los principales constituyentes de las paredes celulares. Es importante que el ph de las soluciones empleadas favorezca la actividad de las enzimas empleadas, sin comprometer la viabilidad de las células. Luego de la digestión de la pared celular, se procede a la purificación y determinación del número de protoplastos intactos. La electroporación consiste en la inducción de poros reversibles en las membranas celulares, que permiten el pasaje de iones y moléculas. La electroporación de protoplastos se realiza inmediatamente después de su purificación. Para ello, una suspensión de protoplastos se incuba con los plásmidos en los que están clonados los genes de interés, y los genes marcadores, que posibilitan la identificación de las células transformadas. La mayoría de los aparatos de electroporación (electroporadores) utilizan descargas de capacitores, para producir descargas de alto voltaje. La intensidad del pulso está determinada por el voltaje aplicado y la conductividad del medio. El grado de permeabilidad de la membrana, por su parte, depende del campo eléctrico aplicado y del tipo celular. Altos niveles de permeabilidad facilitan la entrada del ADN, pero disminuye la viabilidad de las células. La eficiencia de la transformación puede estimarse mediante dos parámetros: Frecuencia absoluta de transformación: nº de colonias transformadas nº inicial de protoplastos Frecuencia relativa de transformación: nº de colonias transformadas. 100 nº inicial de colonias obtenidas La eficiencia de la transformación varía considerablemente entre especies, y entre cultivares de la misma especie. Se han reportado frecuencias absolutas de transformación en el rango de 10-6 a 10-3.

13 Plantas y cultivos transgénicos Figura 1: Protoplastos de (derecha). 13 Oryza sativa (izquierda) y Dahlia pinnata Figura 2: A, pelos radicales de Medicago sativa; B, protoplastos obtenidos a partir de esos pelos radicales luego de 3 minutos de incubación con enzimas para digerir la pared celular. La barra blanca, en ambas fotos corresponde a 10 µm. - Biobalística Esta técnica fue propuesta por Sanford en 1987, para introducir material genético en el genoma nuclear de plantas superiores. En los últimos años se ha usado para transformar bacterias, protozoos, hongos, algas, insectos y

14 14 Cristina Rivas Wagner tejidos animales. La biobalística, utiliza microproyectiles a alta velocidad, para introducir ácidos nucleicos y otras moléculas en células y tejidos. Este proceso también se conoce con los nombres de bombardeo con microproyectiles, gen gun (pistola génica), aceleración de partículas, etc. Se utilizan micropartículas de 0,2 a 4 µm de diámetro, cubiertas con secuencias de ácidos nucleicos, aceleradas a velocidades superiores a los 1500 km/h. Estas partículas (de oro ó tungsteno) penetran la pared y la membrana plasmática, alojándose aleatoriamente en los organoides celulares. Posteriormente, el ADN se libera de las partículas y se integra en el genoma nuclear del organismo receptor. Se han desarrollado varios mecanismos para lograr la aceleración de las micropartículas, entre los que se destaca uno que funciona mediante la descarga de helio de alta presión. En la Figura 3 se aprecia un esquema de una pistola génica. Figura 3: Fotografía mostrando una pistola génica. - Transformación mediante infección con Agrobacterium. Este método se basa en el uso de una bacteria del género Agrobacterium como herramienta para introducir el gen de interés en el genoma de la planta. Antes de describir la técnica propiamente dicha, veamos algunas características de la especie bacteriana. I) Características del género Agrobacterium Se trata de bacterias aeróbicas y Gram positivas, comúnmente encontradas en el suelo. No forman esporas, poseen forma de bacilo (Figura 4 A) y se mueven por medio de 1 a 6 flagelos. En particular, Agrobacterium tumefaciens, es el agente etiológico de la agalla de la corona y A. rhizogenes el de la raíz en cabellera, ambas diseminadas en

15 Plantas y cultivos transgénicos 15 casi todos los tipos de suelos, cultivados o no. La infección de una planta con Agrobacterium, comienza con la penetración de la bacteria en el tejido vegetal, a través de una lesión producida por insectos, tratamientos culturales, heladas, etc. Las bacterias son atraídas por sustancias liberadas por las células lesionadas, tales como aminoácidos, azúcares y fenoles. Una vez en contacto con las células vegetales, las bacterias sintetizan microfibrillas de celulosa, propiciando una mejor fijación. Las moléculas liberadas a través de las heridas también son responsables por la activación de genes localizados en la región de virulencia (región vir) del plásmido Ti de la bacteria (Ti: inductor de tumores) que es un plásmido de alto peso molecular, presente en todos los linajes patogénicos de Agrobacterium (Figura 5). La región vir contiene aproximadamente 25 genes, que codifican proteínas que promueven la transferencia de otra región del plásmido Ti de la bacteria, hacia la célula infectada. Esa región se denomina T -ADN, y se integra en forma estable, al genoma vegetal. Una vez en el genoma vegetal, los genes de T-ADN (también conocidos como oncogenes) son transcriptos, codificando enzimas involucradas en la síntesis de hormonas vegetales, tales como las auxinas y citocininas. Como consecuencia de ese desbalance hormonal, las células transformadas proliferan desordenadamente, produciendo un tumor que se conoce vulgarmente con el nombre de agalla de la corona (Figura 4 B). En el caso de A. rhizogenes, la expresión de los oncogenes conduce a la producción de raíces en la región donde se produjo la herida, síntoma denominado raíces en cabellera. Nótese que en la naturaleza se producen plantas transgénicas, sin la intervención del hombre, cuando el T-ADN bacteriano es inyectado a la célula vegetal, para luego integrarse y expresarse en el genoma hospedante. El T -ADN también posee genes que codifican enzimas responsables por la síntesis de opinas, que son aminoácidos y carbohidratos modificados. Las opinas producidas por las células transformadas son utilizadas exclusivamente por la bacteria como fuente de energía. Los linajes salvajes, en general no son utilizados para la obtención de plantas transgénicas, debido a las alteraciones fisiológicas que ellos producen.

16 16 Cristina Rivas Wagner Figura 4. A: Microfotografía de barrido mostrando A. tumefaciens sobre una célula vegetal, B: Agalla de la corona en girasol. Figura 5: Plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens

17 Plantas y cultivos transgénicos 17 II) Transformación de células de Agrobacterium con el / los genes de interés. Veamos ahora como podemos introducir los plásmidos que contienen los genes de interés, en las células de Agrobacterium (transformación). Pese a que los oncogenes son los responsables de la producción de tumores, las únicas regiones del T- ADN esenciales para su transferencia son las secuencias de aproximadamente 25 pb localizadas en sus extremidades. De este modo, los genes presentes en el T - ADN pueden ser eliminados y sustituidos, sin alterar el proceso de transferencia. Además de las extremidades del T - ADN, la región vir también es esencial para la transferencia. La preparación de un linaje de Agrobacterium para ser utilizado como vector para la transformación de plantas transgénicas, incluye dos etapas: En la primera etapa, se debe obtener un linaje desarmado, en el cual el T-ADN original, con sus oncogenes fue eliminado por un proceso de doble recombinación. Actualmente disponemos de linajes desarmados, obtenidos a partir de linajes salvajes de diferentes orígenes. La segunda etapa, implica la preparación de un vector conteniendo el T- ADN con los genes de interés. Debido a su gran tamaño (aproximadamente 200 kb), el plásmido Ti no puede ser manipulado directamente, por lo que se emplean plásmidos más pequeños (vectores), que resultan fáciles de manipular. Estos vectores contienen las extremidades del T-ADN, entre las cuales se clonan los genes de interés. Una vez obtenido el vector, este debe ser transferido al Agrobacterium mediante un proceso que se conoce con el nombre de transformación. Se han desarrollado tres métodos de transformación: conjugación, electroporación y shock térmico: a) Conjugación: se trata de un método simple y eficiente que no requiere de equipamiento específico y prescinde de la preparación de ADN plasmidial de E. coli. En el protocolo más común, se realiza un cocultivo de dos l inajes de E. coli ( helper y donante ) y un linaje de Agrobacterium (receptora), según puede apreciarse en la Figura 6. El linaje helper suministra las funciones de movilización (mob) y transferencia ( tra) de plásmidos, entre bacterias compatibles, mientras que el linaje donante, contiene el vector que será transferido. Durante la conjugación, el plásmido helper es transferido al linaje donante, promoviendo posteriormente su movilización hacia Agrobacterium, junto con el vector. El plásmido helper no se replica en Agrobacterium, y por lo tanto es eliminado. Luego de la transferencia, se seleccionan los linajes recombinates de Agrobacterium mediante el uso de antibióticos apropiados. La principal desventaja de la conjugación es la posibilidad de que ocurran alteraciones en el plásmido introducido, debido a la recombinación con el plásmido helper.

18 18 Cristina Rivas Wagner T- ADN a) binari o A. tumefacien s recep tor a b) Vir T- ADN T- ADN Vir c) T- ADN Vir d) T- ADN Vir Figura 6: Transferencia de un vector hacia Agrobacterium mediante conjugación. El plásmido helper pasa a E. coli donante (a y b), y luego a Agrobacterium, promoviendo la transferencia del vector binario (c). El plásmido helper no se replica en bacterias y es eliminado (d). El vector binario se mantiene independientemente del plásmido Ti desarmado. b) Electroporación: Consiste en someter a las células del linaje receptor de Agrobacterium a un pulso de alto voltaje, generado por un capacitor, en

19 Plantas y cultivos transgénicos 19 presencia del vector. Como consecuencia del campo eléctrico generado, la membrana plasmática se desestabiliza, produciendo poros por los que se produce el pasaje de macromoléculas. Se trata de un método muy eficiente y relativamente simple, que se utiliza con mucha frecuencia. Su principal limitante es la necesidad de contar con el equipamiento de laboratorio: electroporador y una fuente de alta tensión. c) Shock térmico ( freeze thaw ): este método se basa en la permeabilización de la membrana en condiciones extremas de temperatura (de 186 a 37ºC), permitiendo el pasaje del vector hacia el Agrobacterium receptor. En los métodos directos de transformación (electroporación y shock térmico), en los cuales el vector es transferido directamente hacia la célula receptora, la probabilidad de que el ADN se altere es mínima, en comparación con el método de conjugación. III) Obtención de plantas transgénicas mediante Agrobacterium. El conocimiento de las bases moleculares del mecanismo de infección por Agrobacterium, y el desarrollo de técnicas de biología molecular, permitieron desarrollar protocolos para introducir en las plantas genes exógenos, utilizando aquella bacteria como vector. Como se ha mencionado en los ítems anteriores, esto fue posible gracias a la obtención de vectores derivados del plásmido Ti ó Ri, y su introducción en linajes de Agrobacterium desarmados, en los cuales los oncogenes fueron eliminados. Desde entonces, este sistema de transformación fue ampliamente utilizado, en un gran número de especies. Algunas de las razones que justifican su universalidad, son la alta eficiencia de transformación, el bajo costo operacional y la simplicidad de las técnicas. La mayoría de los protocolos desarrollados, son una modificación del propuesto por Horsch en 1985 para transformar discos foliares de tabaco (Nicotina tabacum) y consta de las siguientes etapas (Figura 7): - Infección: Consiste en el cultivo del explanto vegetal en un medio líquido ó sólido, junto con el linaje desarmado de Agrobacterium que contiene el ó los genes a ser introducido/s en la planta. El tiempo de cultivo puede variar desde algunas horas, hasta varios días. En la elección del explanto debe tenerse en cuenta la facilidad de reproducción in vitro. De este modo, dependiendo de las especie y del cultivar, se han utilizado como explantos discos foliares, segmentos de tallos o raíces, tubérculos, cotiledones, protoplastos, embriones somáticos, etc. Generalmente se realiza una herida en el explanto, antes o durante el contacto con la bacteria, ya que a través de ella se liberan las sustancias que inducen a los genes de virulencia del Agrobacterium. Durante esta etapa, se produce la unión de la bacteria a la región donde se encuentra la herida, la inducción de los genes de la región vir, y la transferencia del T-ADN hacia el genoma vegetal. - Selección: En una segunda etapa el explanto es transferido a un medio de regeneración apropiado conteniendo uno ó más antibióticos descontaminantes, que permiten eliminar a las células de Agrobacterium, que a partir de ese momento ya no son requeridas.

20 20 Cristina Rivas Wagner Normalmente se adiciona al medio de cultivo un agente de selección, que es responsable de la inhibición del crecimiento de las células no transformadas. El efecto nocivo de este agente, en las células transformadas, es anulado por el producto de expresión del gen marcador de selección (generalmente una enzima). De este modo, sólo las células transformadas serán capaces de desarrollarse en este medio de cultivo selectivo. Debemos tener en cuenta que ningún sistema de selección es totalmente eficiente, de modo que pueden producirse algunos escapes (plantas no transformadas, que a pesar de no expresar el gen marcador, consiguen regenerarse en presencia del agente de selección). - Enraizamiento: Durante las semanas siguientes, los brotes resistentes al agente de selección son aislados a medida que regeneran, y transferidos a un medio de enraizamiento, rico en auxinas (hormonas vegetales, como el ácido 3-indol acético, 3- indol butírico, etc, que se caracterizan por inducir la diferenciación de raíces). - Rustificación: Una vez enraizados, los brotes transformados son aclimatados y llevados a invernáculo. potencialmente - Análisis molecular: Para comprobar la integración y expresión del gen foráneo en el genoma de la planta, es necesario un exhaustivo análisis molecular, mediante técnicas como Northern Blot, Southern Blot, Western Blot, etc, que serán descriptas más adelante. Posteriormente, también deben realizarse estudios genéticos de segregación, para demostrar la estabilidad de la integración. Figura 7: Etapas de la transformación con Agrobacterium.