FACTOR MASCULINO Y STRESS OXIDATIVO

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1 FACTOR MASCULINO Y STRESS OXIDATIVO ÁGUEDA ORTIZ La fertilidad masculina en la especie humana es relativamente baja en relación con la de otras especies. El tamaño relativo del testículo de los seres humanos es notablemente menor que el de otros mamíferos y tiene una de las tasas más bajas en cuanto a producción diaria de espermatozoides por gramo de testículo, así como proporciones bajas de espermatozoides progresivamente móviles y morfológicamente normales. 1 Esto hace que el varón pueda estar en mayor riesgo frente a las sustancias tóxicas que afectan la reproducción. El factor masculino está presente en aproximadamente la mitad de los casos de esterilidad y no se puede hallar ninguna causa identificable en más del 25% de los varones estériles. 2 En 1979 se publicó un trabajo que relacionaba el estrés oxidativo con alteraciones en la función espermática 3. Desde entonces, numerosos estudios han demostrado su importancia clínica en la etiología de la esterilidad masculina. 4,5 Hoy en día se le atribuye un papel principal en la esterilidad con origen en el varón ya que no sólo disminuye la capacidad fecundante del espermatozoide, sino también su habilidad para dar lugar a embriones sanos. ESTRÉS OXIDATIVO Y FUNCIÓN ESPERMÁTICA El estrés oxidativo es la situación en la que se encuentra una célula que presenta un desequilibrio entre sustancias oxidantes y antioxidantes; bien sea por un exceso en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), bien por una deficiencia en los sistemas de detoxificación de éstas. El gameto masculino fue el primer tipo celular donde se constató la capacidad para generar ROS. 6 La habilidad para generar especies reactivas de oxígeno (ROS) es un aspecto fundamental de la fisiología del espermatozoide. 7 Los metabolitos del oxígeno están implicados en procesos tan importantes como la capacitación espermática, la hiperactivación, la reacción acrosómica y la fusión de membranas para la fe [1]

2 Actualización Obstetricia y Ginecología 2011 cundación. 8,9 La capacitación espermática, por ejemplo, implica un gran aumento en el nivel de tirosina fosforilada en la cola y sobre todo en la pieza intermedia. 10 Las señales implicadas para que tenga lugar la fosforilación son el AMPc y el estado redox de la célula. 11 El anión superóxido y el peróxido de hidrógeno son dos factores importantes en este proceso. 12 Dependiendo de la naturaleza de las ROS y su concentración, así como el momento y el lugar de la exposición, las especies reactivas tienen efectos favorables o perjudiciales sobre las funciones de los espermatozoides. ESTRÉS OXIDATIVO Y VULNERABILIDAD ESPERMÁTICA Un conjunto de enzimas antioxidantes citoplasmáticas, tales como la superóxido dismutasa (SOD), la catalasa y la glutatión peroxidasa (GPX), mantiene la concentración de ROS y protege a las células de su exceso. Pero los espermatozoides son más susceptibles ya que su reducido citoplasma hace que carezcan de estos mecanismos endógenos para reparar los daños asociados al estrés oxidativo. 13 La generación excesiva de ROS en el semen, principalmente por los neutrófilos, pero también por espermatozoides anormales, podría ser una causa de esterilidad 14. El peróxido de hidrógeno es la principal ROS tóxica para los espermatozoides humanos. Las concentraciones moderadamente altas no afectan la viabilidad de los espermatozoides, pero los inmovilizan, generalmente por agotamiento del ATP intracelular y disminución ulterior en la fosforilación de las proteínas del axonema. El plasma seminal no sólo presenta especies reactivas, también posee los mecanismos para mantener un estado de oxidación adecuado. Contiene enzimas antioxidantes y diversas moléculas antioxidantes no enzimáticas como la melatonina, la vitamina C, la vitamina E, el piruvato, el glutatión y la carnitina. 15,16 Varios investigadores han encontrado concentraciones significativamente menores de antioxidantes en el semen de hombres estériles en relación con los controles. No obstante, las concentraciones patológicas de ROS detectadas en el semen de hombres estériles se deben más probablemente al aumento de la producción de ROS que a la disminución de la capacidad antioxidante del líquido seminal. El alto contenido de los espermatozoides en ácidos grasos poliinsaturados también hace que estas células sean más sensibles al estrés oxidativo. 17 La peroxidación lipídica afecta sobre todo a las membranas y se asocia a una disminución de la movilidad espermática. La pérdida de fluidez en la membrana, origina un fallo en la [2]

3 Reproducción actividad Ca 2+ /Mg 2+ ATPasa, que provoca un aumento del calcio intracelular y como consecuencia la pérdida de la movilidad espermática. En este sentido, Gomez y colaboradores señalaron que los niveles de producción de ERO por las poblaciones espermáticas puras se correlacionaron negativamente con la calidad del semen. 18 Funciones dependientes de la fluidez de la membrana como son la fusión al ovocito y la reacción acrosómica también se ven alteradas. Otra diana espermática para sufrir daño oxidativo es el material genético, siendo el agente inductor principal el peróxido de hidrógeno. El ADN nuclear está bien protegido por las protaminas, unas proteínas que sustituyen a las histonas nucleares presentes en otros tipos celulares y que ofrecen mayor estabilidad a la cadena de ADN. 19 El genoma del núcleo es particularmente resistente al exceso de ROS pero no acurre lo mismo con el material genético de las mitocondrias. 20 De hecho, la integridad del ADN mitocondrial es un excelente marcador de estrés oxidativo. FUENTES DE ROS Las especies reactivas se generan de forma controlada en el metabolismo del espermatozoide pero varios factores pueden estimular su producción. Por ejemplo, la presencia de leucocitos activados como consecuencia de una infección del tracto reproductor masculino; 21 las radiaciones electromagnéticas; 22 las radiaciones de teléfonos móviles 23 o agentes xenobióticos como las quinonas 24 favorecen la producción de ROS llegando a niveles perjudiciales. Otros factores hacen a los espermatozoides más susceptibles de sufrir daños por las especies reactivas porque impiden el correcto empaquetado del ADN como ocurre con algunos pesticidas organofosforados 25 y tóxicos ambientales. Algunas patologías asociadas a una espermatogénesis incompleta o a una disminución del sistema de antioxidantes también incrementan los efectos producidos por el exceso de ROS. Es lo que ocurre en casos de criptorquidia, 26 torsión testicular, 27 varicocele, 28 hipertiroidismo 29 o diabetes. 30 El manejo de las muestras seminales en el laboratorio es otra posible fuente de ROS. La centrifugación a la que se someten las muestras durante la realización de Swim up o gradientes de densidad aumenta el contenido en ROS. Los choques térmicos y la exposición al oxígeno atmosférico durante los procesos de criopreservación [3]

4 Actualización Obstetricia y Ginecología 2011 seminal afectan a la integridad de la membrana y se asocian al aumento en la producción de ROS y a la disminución de antioxidantes. 31 CONSECUENCIAS DE LA GENERACIÓN EXCESIVA DE ROS Durante procesos dependientes del estado redox como la capacitación espermática se han observado transformaciones morfológicas en las mitocondrias. 32 Recientemente se ha demostrado que estos orgánulos, tan abundantes en la cola y la pieza intermedia, son los principales generadores de ROS en los espermatozoides 33 y que cualquier factor capaz de interferir en la cadena transportadora de electrones es un potencial inductor de ROS. LA enzima mitocondrial implicada es la oxidorreductasa (diforasa) dependiente de NADPH. 34 La otra vía de formación de ROS en los espermatozoides es el sistema fosfato nicotinamida adenina dinucleótido (NADPH) oxidasa a nivel de la membrana plasmática. Prácticamente el semen de cada eyaculación está contaminado con posibles fuentes de ROS. Se deduce que en cada eyaculación algunos espermatozoides sufrirán daño oxidativo y pérdida ulterior de la función. De esta manera, el impacto de las ROS sobre la fertilidad masculina es un problema de grado más que de presencia o ausencia de la patología. En las mitocondrias disfuncionales la producción de ROS aumenta significativamente y estas moléculas a su vez afectan la función mitocondrial de los espermatozoides. Esta relación se puede deber a dos fenómenos interconectados mutuamente: las ROS que lesionan la membrana mitocondrial, y la membrana mitocondrial lesionada que aumenta la producción de ROS. Por otro lado, las mitocondrias tienen una función clave en el mecanismo de la apoptosis. Su integridad está determinada por la presencia de citocromo c en el espacio de la membrana interna. Los niveles altos de ROS desorganizan las membranas interna y externa de las mitocondrias. Esto produce la liberación de la proteína citocromo c de la mitocondria, que activa las caspasas e induce apoptosis. Se ha demostrado en varios tipos celulares que el estrés oxidativo puede ser inductor de la apoptosis. 35 [4]

5 Reproducción ESTRATEGIAS PARA REDUCIR EL ESTRÉS OXIDATIVO Como ya hemos mencionado, los leucocitos y espermatozoides inmaduros o anormales presentes en el eyaculado son fuentes generadoras de un exceso de ROS. Con las técnicas de selección espermática, separamos la fracción de espermatozoides móviles y sanos que generan cantidades fisiológicas de ROS. Es mejor, por tanto, no quedar el eyaculado en el laboratorio y demorarse mucho en seleccionar los mejores espermatozoides, libres de plasma seminal y otras células, lo que comúnmente llamamos técnicas de capacitación. Además, en el desarrollo de estas técnicas se utilizan medios de cultivo suplementados con gran cantidad de antioxidantes que contribuyen al balance redox. Recientemente, se ha comprobado en las técnicas de criopreservación seminal, que la suplementación de los medios empleados con antioxidantes tiene un efecto crioprotector sobre las células; 36 tras la descongelación los espermatozoides muestran mejor movilidad y mayor integridad en la membrana que utilizando medios carentes de antioxidantes. El tiempo y velocidad de centrifugación también afectan a los niveles de ROS. Especies negativas para ROS se vuelven positivas tras la centrifugación a 200g ó 500g. 37 El tiempo de centrifugación es más importante que la velocidad, por tanto, disminuyendo este intervalo y bajando la velocidad, obtendremos muestras menos oxidadas. Otra acción beneficiosa sería realizar el swim up previo a la centrifugación. Tanto la retirada de plasma seminal como la centrifugación contribuyen a generar ROS, así que, los espermatozoides deberían ser separados de los leucocitos cuando todavía son protegidos por los antioxidantes del plasma seminal. Las mejores técnicas de capacitación son aquellas en las que los espermatozoides móviles son separados previo a la centrifugación. MEDIDA DE LAS ROS A pesar de los numerosos estudios sobre el papel de las ROS durante tantos años y de conocer su importancia sobre la esterilidad masculina, no existen métodos fiables y reproducibles de uso clínico rutinario para calcular los niveles de ROS y complementar el estudio del varón. [5]

6 Actualización Obstetricia y Ginecología 2011 Existen métodos para medir ROS en el interior de la célula, como por ejemplo medir superóxido implicado en la reducción de ferricitocromo C. Son métodos muy sensibles pero necesitan que la concentración de espermatozoides no sea demasiado baja. 38 No sirven en caso de oligozoospermia. Otros métodos, miden ROS intra y extracelular por quimioluminiscencia. Son muy utilizados para medir peróxido de hidrógeno 39 pero tienen el inconveniente de no ser tan sensibles. Dado que la capacidad de generar ROS de los espermatozoides es muy baja comparada con los leucocitos, necesitamos de métodos más sensibles. Por otro lado, tenemos el inconveniente de que aún no se ha definido el nivel normal de ROS en hombres fértiles. BIBLIOGRAFÍA Working PK. Male reproductive toxicology: comparison of the human to animal models. Environ Health Perspect 1988; 77: Sharlip ID, Jarow JP, Belker AM, et al. Best practice policies for male infertility. Fertil Steril 2002; 77: Jones R, Mann T, Sherins R. Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa, spermicidal properties of fatty acid peroxides, and protective action of seminal plasma. Fertil Steril 1979; 31: Sikka SC. Relative impact of oxidative stress on male reproductive function. Curr Med Chem 2001; 8: Agarwal A, Gupta S, Sikka S. The role of free radicals and antioxidants in reproduction. Curr Opin Obstet Gynecol 2006; 18: Tosic J, Walton A. Formation of hydrogen peroxide by spermatozoa and its inhibitory effect on respiration. Nature 1946; 158:485. Agarwal A, Saleh RA, Bedaiwy MA. Role of reactive oxygen species in the pathophysiology of human reproduction. Fertil Steril 2003; 79, Bize I, Santander G, Cabello P, Driscoll D, Sharpe C. Hydrogen peroxide is involved in hamster sperm capacitation in vitro. Biol Reprod 1991; 44: Griveau JF, Renard P, Le Lannou D. An in vitro promoting role for hydrogen peroxide in human sperm capacitation. Int J Androl 1994; 17: Visconti PE, Moore GD, Bailey JL et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a camp dependent pathway. Development 1995; 121: Baker MA, Hetherington L, Aitken RJ. Identification of SRC as a key PKA stimulated tyrosine kinase involved in the capacitation associated hyperactivation of murine spermatozoa. J Cell Sci 2006; 119: de Lamirande E, Gagnon C. Impact of reactive oxygen species on spermatozoa: a balancing act between beneficial and detrimental effects. Hum Reprod 1995; 10 Suppl 1: [6]

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