1. INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA PARTE I: REPORTE CIENTÍFICO CONTENIDO BIOQUIMICA EXPERIMENTAL Agosto 2010

Transcripción

1 Sección 1 Sección 2 Sección 3 Sección 4 Sección 5 Sección 6 Apéndice CONTENIDO Introducción al laboratorio de Bioquímica Parte I: Reporte científico Parte II: Revisión de métodos espectroscópicos y elaboración de curva estándar de proteínas Estructura y propiedades de proteínas: Purificación de la enzima lactato deshidrogenasa de músculo esquelético de bovino Parte I. Extracción y precipitación por salado. Parte II. Purificación por cromatografía de intercambio iónico y de afinidad Parte III. Monitoreo del proceso de purificación. A. Determinación de concentración de proteínas. Monitoreo del proceso de purificación. B. Separación por electroforesis en gel de poliacrilamida-sds Actividad enzimática Parte I. Curvas temporales de actividad enzimática de la lactado deshidrogenasa de músculo esquelético de bovino. Parte II. Factores que modifican la actividad de las enzimas: Efecto de la concentración de sustrato y de un inhibidor. Genética Determinación del tipo de herencia en base a frecuencias fenotípicas y genotípicas Estructura, propiedades y función de ácidos nucleicos Transferencia de material genético I. Conjugación Transferencia de material genético II: Transformación Aislamiento de plásmidos Ensayos de restricción de plásmido Inducción de proteína recombinante Regulación del metabolismo Parte I: Regulación genética en el operón lac Parte II. Regulación hormonal del metabolismo de la glucosa Preparación de soluciones 1. INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA PARTE I: REPORTE CIENTÍFICO Objetivos Conocer la importancia de realizar un reporte científico. Conocer las características o partes de un reporte científico: Introducción, hipótesis, objetivo, métodos, resultados, discusión y conclusiones, y referencias. Conocer cómo se formulan las hipótesis. Plantear hipótesis. Aprender a realizar un reporte científico. Introducción Tanto en la Universidad como fuera de ella, sin importar el tema, tus ideas o argumentos, si no son expresados de manera clara y fácil de seguir, difícilmente serán tomados en cuenta. Es de gran valor, tanto para empresas como pare instituciones educativas y de investigación, contar con personal que pueda expresar claramente sus ideas de manera escrita y oral. En el desarrollo de las ciencias, la comunicación de las observaciones, resultados y propuestas, es fundamental para continuar avanzando en el conocimiento, y el instrumento principal es el reporte científico. En el reporte científico, no sólo se informa sobre los resultados de una investigación, sino también recopila una serie de ideas y propuestas, da cuenta de los errores y avances tecnológicos que pueden ayudar a replantear la dirección de una investigación o llevar a la resolución de un problema en particular. De hecho, uno de los pasos comunes dentro del llamado método científico es la de dar respuesta a las preguntas surgidas de la observación, a través de primero investigar la literatura cercana al tema de estudio (Figura 1.1.). Así como en el reporte, en todos los pasos que conforman al método científico debemos esforzarnos en expresar las ideas de manera clara y lógica. Por ejemplo, en el planteamiento de la hipótesis, tenemos que predecir lo que se espera del experimento propuesto, estableciendo en una frase corta las variables que se están manipulando o las mediciones que se harán, siempre en términos mensurables. Adicionalmente, la hipótesis incluye aquella información que previamente obtuvimos o conocemos respecto a la investigación. Para ayudarnos a construir la hipótesis generalmente se utilizan las preposiciones si y entonces. Examinemos el siguiente ejemplo: Si observamos que nuestra garganta nos duele, nos planteamos: Si tengo dolor de garganta entonces podría deberse a que tengo una infección en la garganta debida a bacterias o virus, o bien porque gritamos mucho el día anterior. Sin embargo, la anterior hipótesis no toma en cuenta lo que tenemos como conocimiento previo. Al replantearla podemos decir: Si sé que el resfriado es contagioso y no estuve en contacto con alguien que estuviera contagiado, y además fui a un juego de fútbol en donde grite mucho, entonces es probable que esto último me causará el dolor de garganta. A pesar de que mejoró, la hipótesis no establece como se validará o no la predicción. Se podría plantear otra diciendo: Si no tengo fiebre o síntomas de una infección en la garganta, pero sí una inflamación en la garganta, entonces el cultivo de exudado faríngeo y otros estudios clínicos darán negativo para una infección bacteriana o viral, por lo que la inflamación se deberá a un uso excesivo de las cuerdas vocales. 1 2

2 La hipótesis es una parte importante en una investigación y como se mostró, debe ser cuidadosamente planteada ya que considera el problema que se está investigando, el conocimiento previo y el diseño del experimento. Adicionalmente, al contrastar la hipótesis con los resultados sé llegan a conclusiones válidas, que permiten replantear las hipótesis y/o reportar lo encontrado. Frecuentemente, los reportes presentan las siguientes secciones: resumen del contenido, introducción o antecedentes, métodos, resultados, discusión, conclusiones, recomendaciones o perspectivas y referencias. La inclusión de recomendaciones generalmente ocurre en reportes para la industria y son determinantes para la toma de decisiones por parte de los directivos. A continuación se da una breve descripción de cada una de las secciones que conforman un reporte científico. Resumen. Su función es presentar un avance del contenido del reporte de una manera en la que el lector juzgue si debe leer el reporte completo. Se incluyen los antecedentes más relevantes, una frase sobre el objetivo del experimento, una descripción corta del método que se usó, los principales resultados y las conclusiones o implicaciones de los resultados. El resumen normalmente se escribe como un solo párrafo de 100 a 200 palabras. Introducción. Contiene la información necesaria para que el lector conozca por qué es importante el reporte, así como de que trata. La información que se utiliza en la introducción va de lo general a lo específico, esto es, se comienza primero desde un contexto amplio del tema, lo que facilita entender los conceptos y la importancia del tópico de la investigación en un área particular de estudio. Después, se hace un resumen de investigaciones anteriores, propias o de otros investigadores (literatura específica) para ayudar a justificar la presente investigación. La introducción finaliza con un párrafo en el que se plantea la hipótesis. En algunos casos se requiere que la parte final de la introducción contenga los objetivos del estudio. Métodos. El propósito de está sección es describir precisamente los materiales y métodos usados para realizar el experimento, siempre con suficiente detalle para que alguna otra persona pueda repetir el mismo procedimiento. Algunas veces se tiene que justificar por qué se usó un método en particular. La sección de métodos debe escribirse en pasado, ya que describe lo que se hizo. Figura 1.1. Diagrama que muestra los pasos del método científico. Se observa que las flechas van hacia delante pero también pueden en cualquiera de los puntos regresar. El método científico es un proceso que permite replantearse desde las preguntas hasta la manera en que los datos fueron analizados. Reporte científico Como se comentó con anterioridad, el principal propósito de escribir un reporte científico es el de comunicar la información que ha sido compilada como resultado de la investigación o experimentación y el análisis de los datos. Los reportes cubren una gran variedad de tópicos pero usualmente se enfocan en transmitir la información con un propósito claro y para una audiencia específica. Un buen reporte es un documento que es preciso, objetivo y completo. Debe también estar bien escrito, claramente estructurado y que se exprese de una manera en la que el lector mantenga la atención en él. Generalmente, el valor de una investigación se evalúa a través del reporte, es decir el reporte escrito es el único producto tangible de cientos de horas de trabajo. Debido a que se juzga el trabajo a través de un reporte escrito, éste debe ser de gran calidad. Resultados. En esta sección se describe pero no se explican los resultados; solo presenta los hechos que van a ser analizados posteriormente. Aunque, se puede explicar algún resultado que es particularmente importante, y que ayuda a entender los siguientes resultados. La sección de resultados debe ser clara y precisa y generalmente contiene figuras. El uso de las figuras como diagramas, tablas, gráficas, cuadros o mapas puede ser muy útil para mostrar o enfatizar la información en un reporte. Las figuras deben ser usadas para compilar los datos de una manera ordenada, son una herramienta útil para ayudar a los lectores a entender datos complejos o numerosos. Es esencial que las figuras estén integradas correctamente en el cuerpo del reporte, que sean referidas inmediatamente después de mencionarlas y deben explicarse. Un error común es mencionar la figura, colocarla y sólo decir que los datos se encuentran en la figura, lo correcto es decirle al lector en qué dato debe poner atención en la figura, aquello que es significativo y que podría utilizarse para comparar datos en figuras separadas o bien en ayudarte a explicar el porque del siguiente experimento. Discusión. La sección de discusión tiene dos principales objetivos, explicar los resultados del estudio y evaluar si lo encontrado en el estudio tiene un significado práctico, biológico, y/o causal. Para ello se necesita: a) interpretar y explicar los resultados; b) evaluar si las preguntas que se plantearon en la hipótesis han sido contestadas; c) mostrar cómo los resultados de la investigación se relacionan con los que han sido reportados anteriormente; d) calificar y evaluar la importancia y significado de los resultados, esto es, si los resultados son estadísticamente significativos, o si existió algún defecto en el diseño o en el procedimiento que pudieron afectar el resultado; e) plantear nuevas preguntas o determinar si se abrieron nuevas áreas de interés. Conclusiones. Está sección puede ser incluida como parte de la discusión o bien como una sección aparte. Establece de manera clara y concisa cuál es la relevancia del trabajo y sus implicaciones. 3 4

3 Referencias. Es necesario incluir una lista de referencias, las cuales deben estar citadas en el cuerpo del reporte. Las referencias se pueden colocar en una lista por orden alfabético, o numeradas de acuerdo a como fueron apareciendo en el texto. Cada referencia debe contener toda la información bibliográfica. Hay varios formatos para referencias que se pueden utilizar, consulta en internet o libros los formatos que se utilizan. Actividades sugeridas 1. El profesor proporcionará al menos un artículo de investigación, para que identifiquen en éste las partes de un reporte. Después cada equipo expondrá sus resultados. 2. Asignar un problema a resolver por equipo, permitir que los estudiantes formulen hipótesis y diseñen un experimento. Se podrán realizar al menos dos formas diferentes de reporte: La primera podría ser un reporte oral al final de esta sesión y la segunda un reporte escrito para la siguiente sesión. Cuestionario 1. Qué finalidad persigue el científico al escribir y publicar un artículo científico? 2. Investiga como se lleva a cabo el diseño de un experimento e incluye cuáles son las variables independientes, las dependientes y las control? 3. Qué estructura debe tener una hipótesis? 4. Cuáles son las secciones de un reporte científico? 5. Qué diferencia (s) hay entre la sección de resultados y la discusión? 6. Qué información bibliográfica deben de contener las referencias, si son libros, artículos o catálogos o páginas de internet? Referencias Day, Robert A. How to Write and Publish a Scientific Paper. 4th edition. Phoenix, AZ: Oryx Press, Williams, Joseph M. Style: Ten Lessons in Clarity and Grace. 6th edition. New York: Longman,2000. Objetivos PARTE II: REVISIÓN DE MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS Y ELABORACIÓN DE CURVA ESTÁNDAR DE PROTEÍNA Aplicar un método espectrofotométrico para medir la concentración de una proteína. Conocer el manejo de micropipetas y espectrofotómetros. Construir curvas de calibración y comprender su importancia. Determinar el intervalo de sensibilidad de una curva estándar. Comparar el intervalo de sensibilidad de dos métodos para determinar proteínas Introducción El espectrofotómetro es un instrumento ampliamente utilizado en el análisis cualitativo y cuantitativo de moléculas biológicas. Parte de la identificación de una molécula se determina por el trazado del espectro de absorción (A en función de la longitud de onda λ) en la región visible y ultravioleta. Mientras que la cuantificación de la misma se puede realizar de manera directa (si la sustancia absorbe en alguna región del espectro) o indirecta (por modificación del compuesto mediante una reacción química). Leyes que rigen la espectrofotometría Cuando un haz luminoso de intensidad P 0 pasa a través de una solución, parte de éste se absorbe, por lo tanto la intensidad de la radiación emergente P es menor al incidente P 0. La relación entre ambos se denomina transmitancia, T: T= P/P (1) La cantidad de luz absorbida es proporcional al número N de iones o moléculas capaces de absorber energía; por lo tanto, T disminuye a medida que la concentración aumenta. Ley de Lambert y Beer, conocida generalmente como Ley de Beer, considera que al dividirse la disolución en pequeñas secciones, en cada una de ellas se absorberá una pequeña cantidad de radiación P, que es proporcional a N. Tomando en cuenta que N es directamente proporcional a la concentración y si la longitud por la que pasa el haz de luz (longitud de la celda) es constante, podemos llegar a la ecuación general: -log P/ P 0= abc (2) donde: c es la concentración b es la longitud de la celda o paso óptico a es la constante de proporcionalidad llamada absortividad La absortividad o coeficiente de extinción es una característica propia de cada especie y depende de la estructura química de ésta. El valor de la absortividad para un compuesto varía con la longitud de onda. Definiendo que la relación -log P / P 0 es la absorbancia de la solución, la ecuación final que define a la ley de Beer queda de la siguiente manera: A λ = a λ bc (3) Es importante mencionar que la constante de proporcionalidad a depende de la longitud de onda por ello se le coloca el superíndice λ así como también a la absorbancia A (ec. 3). Si la concentración se 5 6

4 expresa en molaridad, entonces se denomina a la constante de proporcionalidad coeficiente de absortividad molar o coeficiente de extinción (ε). Convencionalmente, el paso de la luz es de 1 cm, por lo que entonces las unidades de ε son cm -1 mol -1 L. Hay que destacar que A es adimensional, ya que por definición es un índice. Una gráfica de absorbancia de una especie en disolución, a una longitud de onda dada, como una función de su concentración molar, se le llama curva de calibración o curva estándar. Es una línea recta y de acuerdo a la ecuación 3 la pendiente es εb. Conociendo ε y la longitud del paso de la luz b, la concentración de la sustancia en cualquier otra muestra puede ser determinada usando la Ley de Beer. La cuantificación de la especie debe realizarse a la longitud de máxima absorción. Determinación de proteínas Dos aplicaciones comunes de la determinación de proteínas son: 1) para reportar la actividad específica de una enzima y 2) para hacer un cargado homogéneo de proteína en geles de poliacrilamida-sds. Dado que hay varios métodos para medir proteínas totales, Cómo se escoge entre estos métodos? Generalmente se selecciona de acuerdo a su aplicación. Por ejemplo, para el cálculo de la actividad enzimática, el principal propósito es tener exactitud en los resultados, mientras que para colocar cantidades iguales de proteína en un gel de poliacrilamida-sds, la precisión es más importante. Cuantificación de proteínas por medición de absorbancia a 280 nm. El uso de la absorbancia en la región ultravioleta para medir la concentración de proteína es posiblemente el método más simple y rápido, aunque puede producir resultados poco exactos. La cuantificación de proteína por la medida de la absorción a 280 nm, depende de la presencia de aminoácidos aromáticos: tirosina (Tyr) y triptófano (Trp). La medida a 260 nm depende de la presencia de fenilalanina (Phe) ya que es en esta longitud de onda donde presenta su absorbancia máxima. Un alto orden de estructuración puede modificar la contribución de las Tyr y Trp en la absorbitividad molar del péptido o proteína y en consecuencia la absorbancia es sensible a cambios en el ph y fuerza iónica del medio. En la práctica determinaremos la concentración de una muestra problema utilizando, además de la ecuación de la Ley de Lambert y Beer, una curva patrón de absorbancia a 280 nm, esto último sólo con fines didácticos, ya que de manera rutinaria, la concentración de proteínas utilizando el método de absorbancia a 280 nm se obtiene solamente empleando la ecuación de Lambert y Beer y el coeficiente de extinción molar. Cuantificación de proteínas por un método colorimétrico. El ensayo de determinación de proteínas por Lowry es uno de los más usados en Bioquímica. Cuando a un péptido o proteína en disolución básica se le hace reaccionar con cobre se forma un compuesto colorido por coordinación entre los nitrógenos del péptido con el ión metálico. En el método de Lowry el reactivo de Folin- Ciocalteu (fosfomolibdato.fosfotungstato) se añade para incrementar la cantidad de color desarrollado. El aumento en el color ocurre cuando el complejo de cobre tetradentado transfiere los electrones al complejo fosfomolibdato/ fosfotungstato, reacción que produce una coloración azul que se lee a 750 nm. La reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu ocurre solamente con los residuos de tirosina y triptófano de la proteína. Material y equipo Celdas de plástico para espectrofotómetro Celdas de metacrilato grado UV para espectrofotómetro Tubos de microfuga 1 gradilla para tubos de microfuga 1 caja con puntas de 200 µl (amarillas) para micropipeta. 7 1 caja con puntas de 1000 µl (azules) para micropipeta. 1 Micropipeta 10 µl 1 Micropipeta µl 1 Micropipeta µl Vórtex Espectrofotómetro (por grupo) Reactivos Albúmina de suero bovino o BSA. Solución problema de proteínas (los profesores la proporcionarán) Disolución de carbonato-tartrato-cobre (CTC). Ver composición en apéndice. 10% Dodecilsulfato de sodio (SDS) 0.8 N NaOH H 2O Reactivo A. Se prepara inmediatamente antes de usarse con partes iguales de CTC, 10% SDS, 0.8 N NaOH y H 2O. Reactivo B. Dilución del reactivo de Folin Ciocalteu. 1 volumen de Folin + 5 volúmenes de H 2O. Guardar en frasco ámbar. Preparar preferentemente poco antes de usarse. Desarrollo experimental Determinación de proteínas por absorbancia a 280 ηm 1. Rotular los tubos de microfuga. 2. Añadir los volúmenes del estándar de BSA que se indican en la Tabla 1.1 y completar con agua. 3. Colocar los volúmenes indicados de la muestra problema y H 2O. 4. Encender el espectrofotómetro por lo menos 15 minutos antes de la determinación y seleccionar la λ de 280 ηm. 5. Utilizar celda de cuarzo para realizar las mediciones. 6. Ajustar el espectrofotómetro a cero con agua. 7. Realizar las lecturas y llenar la tabla con los datos de absorbancia. 8. Calcular la concentración de proteína de la curva estándar de acuerdo al volumen añadido de la solución estándar. 9. Construir la gráfica con los datos obtenidos. 10. Calcular la concentración de proteínas de la muestra con los datos de la regresión de la curva. Tabla 1.1. Volúmenes y cantidades del estándar de BSA para determinar la concentración de proteínas de una muestra utilizando la absorbancia a 280 nm. Tubo H 2O BSA Muestra A Proteína** 280ηm (1mg/mL) problema* (µg) µl µl 15 µl µl 30 µl µl 45 µl µl 60 µl µl 75 µl µl 90 µl µl 105 µl µl µl * La muestra problema la prepararán y entregarán los profesores. 8

5 ** Calcular la cantidad de proteína que contiene cada tubo de acuerdo a los µl que se añadieron del estándar de BSA. Y en el caso de la muestra problema de acuerdo a la fórmula y/o a los datos de la regresión de la curva estándar. 11. Calcular la concentración de proteínas de la muestra usa la ecuación de Lambert y Beer y el coeficiente de extinción molar de la Albumina de Suero Bovino (BSA) que es M -1 cm -1 o bien usando el coeficiente dado en porcentaje que es de 6.6 para una solución de BSA al 1% (10 mg/ml) y usando la fórmula 4 para determinar la concentración de la muestra. Absλ 280nm ConcentraciónL ( µ g / µ L) = *10 (4) ε(%) 12. Comparar los resultados obtenidos al haber realizado el punto 10 y el punto 11. Determinación de proteínas por el método de Lowry. 1. Rotular los tubos de vidrio y adicionar los reactivos en el orden que se indica en la Tabla 1.2. Recuerda: debes mezclar con el vórtex después de añadir cada una de las disoluciones. 2. Encender el espectrofotómetro, seleccionar la λ de 750 nm. 3. Utilizar las celdas de plástico para realizar las mediciones. 4. Ajustar el espectrofotómetro con la disolución del primer tubo de la tabla (sin BSA). 5. Realizar las lecturas. 6. Llenar la tabla con los datos de absorbancia. 7. Construir la gráficas de absorbancia vs concentración de proteína (µg). 8. Calcular la concentración de la proteína en la muestra 5. Grafica ambas curvas patrón en una sola gráfica y compara la cantidad de proteína que se necesita para tener una absorbancia de 0.15 en ambos métodos. Qué te dicen ambos valores respecto a la sesibilidad de cada uno de los métodos? Compara tus datos con los de tus compañeros y analiza Qué tan reproducibles son los datos? 6. Se obtiene una línea recta después de graficar absorbancia vs µg proteína? 7. De acuerdo a tus resultados, cuál es el intervalo en el que se podría determinar la concentración de una proteína en una muestra utilizando la curva estándar de determinación de proteínas por Lowry? Da una explicación. 8. Cuáles son las aplicaciones en general de una curva de calibración o estándar? Referencias Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J Molecular cloning a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY. Stoscheck CM. Quantitation of Protein Methods in Enzymology 182, Peterson GL A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry 83, Wang, Y., et al. Julio Quantitative analyses reveal the importance of regulated Hdmx degradation for P53 activation. PNAS, (104). 30, Notas y Cálculos. Tabla 1.2. Reactivos y cantidades a añadir para realizar una curva patrón de BSA y la determinación de la concentración de proteínas de una muestra problema, utilizando el método de Lowry para su determinación. Tubo H 2O BSA Muestra Reactivo A Reactivo B Proteína* A750ηm (1mg/mL) Problema* (µg) µl 500 µl 250 µl µl 5 µl 500 µl 250 µl µl 10 µl 500 µl 250 µl µl 15 µl 500 µl 250 µl µl 20 µl 500 µl 250 µl µl 25 µl 500 µl 250 µl µl 30 µl 500 µl 250 µl µl 35 µl 500 µl 250 µl µl 25 µl 500 µl 250 µl µl 50 µl 500 µl 250 µl Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos * La muestra problema la prepararán y entregarán los profesores. ** Calcular la cantidad de proteína que contiene cada tubo de acuerdo a los µl que se añadieron del estándar de BSA. Y en el caso de la muestra problema utilizando los datos de la regresión de la curva estándar generada. Cuestionario 1. Explica qué tipo de factores contribuyen en la desviación de la línea recta al graficar la absorbancia contra concentración (desviaciones a la ley de Beer). 2. De acuerdo al fundamento de los dos métodos de cuantificación de proteínas aplicados en está práctica cuáles son las principales diferencias entre ambos métodos? Considera los costos, facilidad, sensibilidad, el material utilizado Qué sustancias pueden interferir con cada una de las determinaciones? 9 10

6 2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS. Purificación de la enzima lactato deshidrogenasa de músculo esquelético de bovino. PARTE I. EXTRACCIÓN Y PRECIPITACIÓN POR SALADO. Objetivos - Conocer las propiedades físicoquímicas de las proteínas: carga, punto isoeléctrico, masa molecular y afinidad. - Conocer las diferentes estrategias utilizadas para aislar proteínas a partir de diferentes fuentes celulares. - Relacionar las propiedades fisicoquímicas de las proteínas con el fundamento de las técnicas utilizadas en la purificación de proteínas: Centrifugación diferencial, precipitación por salado, cromatografía en filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad. - Aplicar las técnicas de centrifugación y precipitación por salado como técnicas iniciales de purificación de una proteína. Introducción Una condición esencial para el estudio de la estructura y función de una proteína es su purificación, generalmente de un tejido que contiene miles de proteínas que difieren en tamaño, forma y carga. Hay varios aspectos que deben considerarse para realizar un método para purificar una proteína, como por ejemplo, para que se usara la proteína, cuales son las características propias de la proteína (tamaño, carga, solubilidad, hidrofilicidad y función biológica), la cantidad que se requiere purificar y el costo. Por lo tanto, no hay un procedimiento único para la purificación de proteínas, no obstante, si hay una forma sistemática en la que se puede realizar. Una guía básica para la purificación de una proteína toma en consideración lo siguiente: A. Definir los objetivos de la purificación. Grado de pureza, cantidad y nivel de actividad requeridos. B. Seleccionar la muestra biológica de inicio. Dependerá de la localización de la proteína tanto en tejidos como en compartimentos extracelulares o intracelulares. C. Desarrollar una técnica de análisis. Para la determinación rápida de la pureza, actividad o contenido total de proteína. Un método frecuentemente utilizado para evaluar la pureza es la separación de la proteína mediante electroforesis. D. Minimizar la manipulación de la muestra. Evitar los procedimientos largos, ya que se corre el riesgo de perder la actividad de la proteína o reducir el rendimiento. E. Remover al inicio del proceso los posibles contaminantes. Como por ejemplo las proteasas. F. Reducir el uso de aditivos. El uso de muchos y diversos aditivos como sales y amortiguadores en cada paso, puede llevar a la pérdida de la actividad de la enzima y aumentar los costos de la purificación. Seleccionar y usar sólo lo necesario. G. Usar una técnica diferente en cada paso. Para ello tomar en cuenta las propiedades fisicoquímicas de la proteína como tamaño, carga, hidrofobicidad y especificidad por ligandos. H. Minimizar el número de pasos. En cada paso se pierde proteína y tiempo, por lo que hay que combinar los pasos de manera lógica. Un protocolo típico de purificación de una proteína intracelular utiliza varias técnicas, que pueden incluir en la primera fase, la ruptura de las membranas celulares, la centrifugación diferencial o en gradiente de densidad para separar proteínas de las partículas subcelulares o bien de agregados de 11 diferente peso molecular. Una purificación posterior incluirá la precipitación selectiva de proteínas por la adición de sales o solventes miscibles en agua. En la tercera fase de la purificación se removerán los contaminantes utilizando la separación basada en la carga, tamaño y afinidad de la proteína. A continuación se describen brevemente las tres fases del proceso y algunas técnicas para purificar una proteína. SELECCIÓN DE LA FUENTE DE LA PROTEÍNA. Varias pueden ser las fuentes de la proteína, microorganismos, tejidos, cultivos celulares, células transformadas 1, entre otras. La elección de la procedencia de la proteína debe basarse en criterios tales como la facilidad de obtener cantidades suficientes de biomasa de la que se aísla la proteína, la cantidad de la proteína de interés en el tejido o célula, y cualquier propiedad peculiar de la proteína escogida, que ayudará en su estabilización y su aislamiento. En algunos casos, el investigador necesita forzosamente utilizar un tejido en particular, aún cuando la cantidad del tejido y de la proteína es insuficiente. La recomendación para estos casos, es realizar un ensayo piloto con una fuente de proteína distinta a la requerida. PRIMERA FASE. El objetivo inicial es la obtención del homogeneizado o extracto crudo y su clarificación o concentración. La homogeneización es un proceso donde las células y los tejidos son lisados en fragmentos lo suficientemente pequeños para dar lugar a una suspensión uniforme y estable llamada homogeneizado. Los equipos con los que se realiza la homogeneización son diversos y comprenden desde el mortero hasta las ondas ultrasónicas pasando por la licuadora. El método a utilizar para obtener el homogeneizado depende de la dificultad que presente el material biológico para romperse. Igualmente importante al método de homogeneización es la selección de la solución de homogeneización, puesto que será el medio al que estará expuesta la proteína y en el que se pueden adicionar componentes que ajusten el ph de la solución, la fuerza iónica, inhibidores de proteasas o algún estabilizador de la proteína. Posteriormente, para eliminar los contaminantes o clarificar la muestra se puede recurrir al proceso de centrifugación. La centrifugación aprovecha las propiedades de tamaño, forma y densidad de las proteínas para separarlas de otras moléculas que presentan características distintas. Como resultado, el efecto de la gravedad para cada proteína es diferente. En principio, se pueden separar organelos de una solución homogénea de partículas, al exponer a la muestra a diferente fuerza gravitatoria. Después de la centrifugación, algunas de las partículas que normalmente permanecían en solución se sedimentan. La fuerza centrífuga relativa (RCF) se calcula con la siguiente ecuación: Donde RPM son las revoluciones por minuto de un rotor con una distancia r (expresada en mm). El radio usado es la distancia del centro del eje del rotor a la posición intermedia del tubo. La fuerza centrífuga creada puede ser tan pequeña como 600 Xg (600 veces la gravedad) sedimentando pedazos de tejido, células intactas, núcleos, entre otros. El líquido residual o sobrenadante puede someterse a un paso posterior de centrifugación, en un proceso denominado centrifugación diferencial. Esto es varios pasos secuenciales de centrifugación a diferentes velocidades. Por ejemplo, después de sedimentar lo más pesado, el sobrenadante se puede centrifugar a una velocidad intermedia para sedimentar las membranas celulares o velocidades tan grandes como 300,000 Xg, en donde la mayor parte de las moléculas solubles permanecen en solución y las moléculas ligeras sedimentan. SEGUNDA FASE. El objetivo principal es remover una cantidad importante de contaminantes que pueden ser proteínas, ácidos nucleicos, toxinas y virus. Uno de los métodos más utilizados para 1 Células que fueron obtenidas a través de la introducción de un gene que codifica para una proteína distinta a la suya, a través del uso de técnicas de biología molecular. Ver sección 5 del manual. 12

7 eliminar proteínas contaminantes es el de la precipitación. Para que una proteína precipite debemos modificar el ambiente que le rodea, debido a que los grupos cargados en la superficie de una proteína pueden interaccionar tanto con las moléculas de agua como con los iones que se encuentran en solución. Existen varias estrategias para precipitar a las proteínas tales como cambio de ph, incremento en la temperatura, adición de solventes, moléculas cargadas, etc. Pero, el método más comúnmente empleado es la precipitación por salado con (NH 4) 2SO 4. Las proteínas globulares aumentan su solubilidad al incrementar la concentración de iones, fenómeno denominado de salting in. Pero cuando se eleva en exceso la concentración de iones, disminuye la solubilidad de las proteínas y precipitan ( salting out ). El mecanismo de salting-out se basa en la exclusión del cosolvente, en este caso la sal. La mayor parte de las proteínas presentan una capa de agua (capa de solvatación) que se encuentra asociada y cercana a su superficie. Al incrementar la concentración de los iones, la capa de solvatación disminuye y permite que los iones interaccionen con los residuos de las proteínas. Las interacciones de tipo hidrofóbico entre los residuos apolares de la proteína y el solvente, se evitan gracias al plegamiento o bien por la asociación entre proteínas, produciendo su precipitación. Debido al uso extensivo de este método, que además es muy económico, se han diseñado tablas y fórmulas en las que se pueden determinar las cantidades a añadir de (NH 4) 2SO 4 sólido o en solución, a una mezcla de proteínas para obtener una concentración dada. Después de la precipitación hay que retirar el agente precipitante. Una manera es diluir la solución para reducir la concentración del compuesto, otras formas pueden ser realizar la diálisis, la ultrafiltración o bien el paso por una columna de exclusión molecular. La diálisis suele llevarse a cabo colocando la muestra en un tubo estándar de diálisis, usualmente una membrana semipermeable de celulosa o celofán con un poro determinado. Se sumerge la bolsa de diálisis que tiene la muestra en una solución al menos 30 veces mayor al volumen de la muestra. La difusión de los materiales hacia adentro y fuera de la bolsa de diálisis permitirá reducir la concentración de la sal precipitante, disolver a la proteína, así como cambiar la solución en la que originalmente estaba la proteína. Existen dos desventajas de la diálisis: el costo de la membrana de diálisis y que el proceso puede llevar al menos 12 h. Por su parte, la filtración en gel no tiene el problema del tiempo. Una columna empacada con Sefadex-G25 puede usarse para eliminar moléculas de peso molecular menores a 5000 daltones. La muestra se coloca en la columna, las moléculas de menor tamaño entran por los poros de la matriz, mientras que las grandes son excluidas, por lo que al adicionar el amortiguador de elución, las proteínas de alto peso molecular se mueven con rapidez a través de la columna y salen primero, después eluyen o salen las de peso molecular menor. En un simple paso la muestra se desala, concentra, cambia de amortiguador y pierde proteínas o moléculas contaminantes. TERCERA FASE. El objetivo es obtener una proteína pura o con mínimas trazas de contaminantes. Para alcanzar el objetivo se utilizan uno o la combinación de varios métodos cromatográficos, como la cromatografía de exclusión molecular, intercambio iónico, interacción hidrofóbica y de afinidad. A continuación sólo se describen las dos técnicas que se usarán en el laboratorio. La cromatografía de intercambio iónico es una técnica que separa las biomoléculas en base a sus características de carga. Los grupos cargados sobre la superficie de una proteína interaccionan con los grupos con carga opuesta de la fase estacionaria. La carga electrostática de las proteínas depende del ph en el que se encuentren, cuando se iguala el número de cargas positivas a las negativas se dice que se encuentran en su punto isoeléctrico o pi. La carga neta de una proteína es positiva a valores de ph < pi, y se une fuertemente a una resina con cargas negativas o intercambiador catiónico. Mientras que, para que la proteína presente carga negativa la solución debe encontrarse en valores de ph > pi, y es capaz de unirse a intercambiadores de tipo aniónico que 13 contienen grupos cargados positivamente (Figura 2.1). Para eluir a la proteína de interés se utilizan soluciones que modifican el ph o la concentración de sales en la resina. Debido a que la separación de las proteínas de la matriz ocurre en orden de menor a mayor fuerza de unión, es común eluir a las proteínas usando un gradiente de concentración de sales en orden creciente de concentración. Figura 2.1. Separación por cromatografía de intercambio iónico. Dependiendo de la carga iónica de los soportes o resinas de cromatografía entonces ocurrirá la interacción con moléculas cargadas positiva o negativamente. Cromatografía de afinidad. Si la proteína a purificar tiene una afinidad específica por un ligando como su cofactor, un anticuerpo o un ión metálico, esa propiedad se puede usar para purificar a la proteína. Por ejemplo, para purificar a una deshidrogenasa es común usar al cofactor de la enzima, el NAD + o bien a un compuesto que presente alguna similitud a éste (Figura 2.2). Cuando la muestra atraviesa la columna de afinidad, la proteína de interés se unirá al ligando, mientras que el resto sale de la columna. Este tipo de separación, basada en el reconocimiento biológico, es muy específica y elimina a muchos contaminantes. Figura 2.2. Comparación entre las moléculas de Cibacrón blue 3GA y el NAD +. A) Los colorantes de triazina como el Cibacrón blue 3GA son comúnmente acoplados a resinas de agarosa para utilizarse en ensayos de purificación por cromatografía de afinidad. La molécula es estable, fácil de movilizar, barata y varias compañías las tienen disponibles para realizar purificaciones de proteínas que unen nucleótidos de piridina como B) el NAD +. En la práctica se purificará a la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) de músculo de bovino. En la primera parte del protocolo de purificación, se realizará la clarificación de la muestra mediante filtración y centrifugación y posteriormente se llevarán a cabo dos pasos secuenciales de precipitación con (NH 4) 2SO 4. En la siguiente sesión se realizará el desalado de la muestra mediante filtración en gel, para al final purificarla mediante una columna de intercambio iónico o de afinidad. Posteriormente, en la tercera parte del protocolo se evaluará el rendimiento, al determinar la cantidad total de proteína y por último en la cuarta parte del protocolo se determinará su pureza al realizar la separación de las muestras proteicas y visualización en un gel de poliacrilamida-sds. Material biológico 100 g de carne de res preferentemente filete de ternera A 14 B

8 Materiales y equipo para la extracción de la enzima (por grupo) 1 Tijeras 1 Espátula 1 Recipiente para hielo 1 Par de guantes de látex Gasa 1 Vasos de precipitados de 1L 1 Probeta de 250 ml 1 Probeta de 100 ml 4 Botellas de centrífuga Licuadora Balanza granataria Balanza de dos platos Materiales y equipo para la precipitación con sulfato de amonio 2 Tubos para centrífuga con capacidad para 50 ml 1 Recipiente para hielo 2 Vasos de precipitados de 100 ml 1 Espátula Tubos para microfuga de 1.5 ml Gradilla para tubos de microfuga 1 Caja con puntas de 200 µl (amarillas) para micropipeta. 1 Caja con puntas de 1000 µl (azules) para micropipeta. 1 Micropipeta µl 1 Micropipeta µl 1 Bandeja pequeña 1 Barra magnética 1 Agitador magnético Centrífuga (por grupo) Balanza (por grupo) Caja para almacenar tubos de microfuga en el congelador (por grupo) Reactivos Tris 50 mm ph 7.0 (NH 4) 2SO 4 sólido. Desarrollo experimental Importante. Todo el procedimiento deberá realizarse en frío (4 C). Mantener las soluciones y suspensión proteica en baño de hielo. Anotar en su libreta el peso del tejido utilizado, así como el volumen de la solución de homogeneización y los volúmenes resultantes después de cada uno de los pasos de purificación (Figura 2.3). Ya que estos valores son necesarios para calcular el rendimiento, contenido de proteína y actividad enzimática. A. Extracción. Esta primera parte la realizará el profesor con ayuda de un par de voluntarios y se distribuirá el homogeneizado a todos los equipos. 1. Cortar en trozos pequeños 80 g de tejido (eliminar el tejido conectivo y graso que acompaña a la carne) y colocarlos en un vaso de licuadora previamente enfriado (mantener el vaso en el cuarto frío hasta su uso). 2. Agregar 3 volúmenes de 50 mm Tris/HCl ph 7.0 frío por cada g de tejido (240 ml) y licuar brevemente, hacerlo en pulsos de 3 seg/3 a 6 veces para evitar que la licuadora se caliente. 3. Filtrar la mezcla sobre dos capas de gasa grandes (previamente humedecidas con agua destilada). Exprimir suavemente sobre la pared de un embudo y colectar el filtrado en un vaso 15 de precipitados de 1L. NOTA. Puede tomarse una alícuota de está fracción y denominarla Fracción Distribuir el filtrado en botellas de centrífuga y centrifugar a 7,000 rpm a 4 C durante 10 minutos. Decantar con cuidado el sobrenadante en un vaso de precipitados de 1 L. Al sobrenadante lo denominamos homogeneizado total (Fracción 1). Apartar 1 ml de la fracción 1 en un tubos de microfuga y almacenar a -20ºC para su posterior uso. Nota: Tirar el contenido de la gasa en el recipiente preparado para su deshecho. B. Precipitación con sulfato de amonio ((NH 4) 2SO 4) por equipo. 5. Tomar 25 ml de la fracción 1 y colocarlo en un vaso de precipitados. 6. Agitar el sobrenadante de manera continua y suave en un agitador magnético, mientras se añade lentamente sulfato de amonio sólido (8.15g de (NH 4) 2SO 4 por 25 ml del sobrenadante). La agitación debe ser lo suficientemente vigorosa para evitar la formación de cúmulos de sal no disueltos, pero no demasiado fuerte porque se puede producir espuma, en ningún momento utilizar varilla de vidrio o espátula para disolver los grumos. Se recomienda colocar una bandeja pequeña con hielo entre el vaso de pp y la parrilla de agitación para evitar que la solución se caliente. 7. Cuando toda la sal se ha disuelto la solución se encuentra a una saturación del 55% con sulfato de amonio. 8. La mezcla que ahora se encuentra turbia se vacía a un tubo de centrífuga de 50 ml y se centrífuga a 10,000 rpm 4 C por 10 minutos. 9. Colectar el sobrenadante (Fracción 2) y medir el volumen. Descartar el botón. Tomar 1 ml de la fracción 2 y almacenarla en un tubo de microfuga a 20 C para su posterior uso. 10. Calcular el peso de (NH 4) 2SO 4 para obtener una solución al 75% de saturación, (0.125 g de (NH 4) 2SO 4 por cada ml del sobrenadante obtenido). Agitar como se describió anteriormente. 11. Una vez disuelto el (NH 4) 2SO 4, colocar la mezcla turbia en un tubo de centrífuga. Centrifugar a 10,000 rpm a 4ºC por 10 min y descartar el sobrenadante. 12. Resuspender el botón en 1 ml de agua, el volumen final es de aproximadamente 1.8 ml. 13. Distribuir en 3 tubos de microfuga y etiquetar como Fracción 3. Uno de los tubos debe contener 1000 µl, ese volumen se usará en el siguiente protocolo experimental. Almacenar a 20 C. SUGERENCIAS: 1. Para evitar la congelación y descongelación innecesaria de las muestras es conveniente que al final de está sesión se almacenen las muestras en alícuotas y que se etiqueten apropiadamente, se sugiere el uso de la tabla que abajo se muestra. 2. Se recomienda sólo descongelar la alícuota una sola vez y después desecharla. Número Alícuota almacenada para: Volumen 16

9 de Fracción Determinación de proteínas. I PAGE-SDS II Curva temporal de actividad enzimática. III Obtención de parámetros cinéticos. IV Desalado * FPA* FPB* * Fracciones que se obtendrán en la siguiente sesión total almacenado g Tejido ml 50 mm Tris/HCl ph 7.0 Moler Homogeneizado Filtrar con gasa Homogeneizado Distribuir en botellas de centrífuga Centrifugar 7,000 rpm, 10 min, 4 C Botón Sobrenadante (SN) ml VOLUMEN TOTAL (FRACCIÓN 1; ml) A ml SN añadir g (NH 4) 2SO 4 (55% saturación) Agitar Notas y cálculos: Distribuir en tubos de centrífuga Centrifugar 10,000 rpm, 10 min, 4 C Botón Sobrenadante (FRACCIÓN 2; ml) Añadir g (NH 4) 2SO 4 (75% saturación) Agitar Recuerda que ya está al 55% de la sal Distribuir en tubos de centrífuga Centrifugar 10,000 rpm, 10 min, 4 C Botón Sobrenadante (FRACCIÓN 3) Añadir 1 ml de H 20; Volumen total obtenido ml Figura 2.3 Esquema de purificación inicial de la lactato deshidrogenasa mediante precipitaciones sucesivas con sulfato de amonio. Se sugiere llenar los espacios vacíos con las cantidades solicitadas

10 Cuestionario 1. Mencione cuatro usos que se les puede dar a las proteínas purificadas? 2. Dentro de la guía para purificar a una proteína se plantea que es importante establecer cuál va a ser el uso final de la proteína purificada. Explique por qué. 3. Clasifique los métodos que se seguirán para la purificación de la lactato deshidrogenasa, de acuerdo a las propiedades de las proteínas como carga, peso, solubilidad y unión a ligandos. 4. Por qué es importante mantener a la mezcla de proteínas a 4 C? 5. Investiga cuáles son las propiedades de la lactato deshidrogenasa, como localización subcelular, secuencia primaria de aminoácidos, pi (punto isoeléctrico), actividad enzimática que cataliza, peso molecular, estructura terciaria y/o cuaternaria. 6. De acuerdo al pi de la lactato deshidrogenasa que encontraste predice cual será su carga eléctrica cuando la proteína se encuentre en un amortiguador de fosfatos ph 7.0. Qué tipo de columna y eluyente recomiendas para su purificación y porqué? 7. Existen varios métodos en la literatura para purificar a la lactato deshidrogenasa, por qué existe esa variedad si todos purifican a la misma proteína? 8. Cuáles son las proteínas que se están purificando con un fin de uso farmacéutico o médico? Menciona al menos 2 y para que se usan Referencias Allen T, Mark W Desalting, Concentration, and Buffer Exchange by dialysis and ultrafiltration. Current protocols in protein science John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Castle DJ Overview of cell fractionation. Current protocols in protein science John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edición John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp Localización QP514.T4 Protein purification Handbook Amhersham Pharmacia Biotech AB. Uppsala, Sweden. Code number Pp 94. Salem J Enzymes: purification. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-7. Consultar la página Sheehan D, O Sullivan S Ion exchange chromatography. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-4. Consultar la página Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edición John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp Sitios recomendados para 1. aprender sobre las características y propiedades de las proteínas página desarrollada por el Dr. Rogelio Rodríguez Sotres. 2. calcular la concentración de sulfato de amonio a añadir a una muestra calcular la fuerza centrífuga de un rotor. Convierte rpm a Xg o vicerversa. PARTE II. PURIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Y DE AFINIDAD Objetivos - Aplicar la cromatografía en filtración en gel como una de las técnicas para el desalado y cambio de la solución amortiguadora de extractos proteicos. - Aplicar los métodos de cromatografía de intercambio iónico y de afinidad para purificar una proteína Material biológico Fracción 3 obtenida en la sección anterior Material y equipo 1 Columna de cromatografía vacía 1 Columna de Sephadex G-25 empacada con 2.5 ml de resina 1 Probeta de 50 ml Tubos para microfuga de 1.5 ml 1 Recipiente para hielo 1 Soporte universal 1 pinzas de tres dedos de sujeción con nuez Micropipeta de 1000 µl Micropipeta de 200 µl 1 caja de puntas de 1000 µl para micropipeta 1 caja de puntas de 200 µl para micropipeta Centrífuga (por grupo) Balanza (por grupo) Reactivos Desalado 2.5 % Sephadex-G25 (p/v). La columna contiene 2.5 ml de volumen de cama de Sephadex, preparado según se indica en el Apéndice. Se entrega empacada para su uso inmediato. Amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol. Contiene 10 mm de Tris/HCl ph 8.8 y 0.5 mm β- Mercaptoetanol. (Ver preparación en el apéndice) 400 mm PMSF Amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol-PMSF (1 mm). Se prepara poco antes de su uso. (Se entrega por grupo: Un frasco ámbar con 26 ml del amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol, añadir 65 µl de 400 mm PMSF para obtener una concentración final de 1 mm (agitar vigorosamente para disolver el PMSF añadido) Agua destilada estéril para el lavado de las columnas. Purificación por cromatografía de intercambio iónico Matriz para intercambio catiónico, Macro-prep High S de BIORAD (ver Apéndice). Amortiguador de equilibrio I. Contiene 50 mm de amortiguador de fosfatos ph 7.0. Amortiguador de elución I. Contiene 50 mm de amortiguador de fosfatos ph 7.0 y 1 M de NaCl. Amortiguador de elución II. Contiene 50 mm de amortiguador de fosfatos ph 3.0. Purificación por cromatografía de afinidad Matriz para purificación por afinidad. DEAE affi-gel blue gel (ver Apéndice). Amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol-PMSF El mismo que se uso para el desalado 19 20

11 Amortiguador de elución A. Amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol-PMSF-NAD +, preparado al momento según se indica a continuación: adicionar la solución de Tris-β-Mercaptoetanol- PMSF al frasco que contiene NAD + en polvo, para una concentración final 5 mm (ver apéndice). Desarrollo experimental Desalado mediante cromatografía de exclusión molecular 1.- Sujetar a un soporte universal la columna de sefadex, como se muestra en la Figura Tomar 1 ml de la fracción 3 y añadirlo a la columna. 3.- Adicionar a la columna poco a poco la mezcla de proteína y esperar a que entre a la columna por gravedad (aproximadamente en 1 minuto o menos). 4.- Desechar el primer ml que eluye de la columna (correspondiente al volumen vacío), agregar a la columna 1 ml de amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol-PMSF y colectar en un tubo de microfuga frío el segundo ml. Esta fracción contiene a la LDH (Fracción 4). Se guardan 100 µl para llevar a cabo la medición de actividad y determinación de proteína. El resto de la muestra se utilizará en el siguiente paso. NOTAS. 1La columna se lava con 10 ml de agua destilada estéril y se mantiene hidratada para reutilizarla, entregarla al profesor. 2No es necesario realizar la operación en condiciones de esterilidad, pero el usar agua estéril ayuda a disminuir una posible contaminación de la columna para el uso posterior de otro grupo de estudiantes. Figura 2.3 Purificación de proteínas por cromatografía líquida. A. Empacado de la columna y B. Colecta de fracciones de proteína después de añadir la solución de elución. Purificación por cromatografía de intercambio iónico o de afinidad. La mitad del grupo realizará la purificación por intercambio iónico de la LDH de la fracción 4 y la otra parte del grupo se enfocará en la purificación de la LDH por columna de afinidad, también a partir de la fracción 4. A. Empacado de la columna para la fase tres de la purificación. Adicionar 1 ml de alguna de las dos matrices que el profesor te proporcionará, para realizar intercambio catiónico o de afinidad. (Dejar drenar hasta obtener 0.5 ml de volumen contenido inicialmente en la columna). Si es necesario colocar la columna en un tubo de vidrio de 13X100 para centrifugar a 3,000 rpm por 10 min a 4 C). Es importante revisar que no se hayan producido burbujas para que el flujo del líquido sea constante; eliminar el eluato. B. Purificación por cromatografía de intercambio iónico 1. Se utilizará la columna que se preparó en el paso anterior con la matriz de intercambio iónico. 2. Equilibrar la columna adicionando poco a poco en la parte superior de la columna 1.0 ml de Amortiguador de equilibrio I. Es muy IMPORTANTE adicionar el volumen lentamente, de manera que el flujo de salida sea gota a gota. Se puede acelerar el proceso centrifugando a 3000 rpm por 5 minutos a 4 C. 3. Cuando la última gota del amortiguador de equilibrio haya salido, tapar la salida de la columna con parafilm y adicionar los 900 µl de la fracción 4. Posteriormente tapar la parte superior de la columna y agitar por inversión entre 5 a 10 veces. Destapar la salida y dejar que pase el líquido por la columna desechando éste volumen (Este es el volumen muerto y no contiene proteína). Nuevamente, se puede acelerar el proceso centrifugando a 3000 rpm por 5 minutos a 4 C. 4. Realizar un lavado con 1 ml de Amortiguador de equilibrio I (para eliminar la unión no específica). Alternativamente se centrífuga como se mencionó en los pasos 2 y Solicitar a su profesor el amortiguador de Elución I o II considerando las características de pi de la LDH. Para la elución se adiciona poco a poco 1.0 ml de amortiguador de elución y se recolectan ± 900 µl en al menos 2 fracciones de 450 µl cada una (Figura 2.3), las que denominamos, Fracción purificada FPIa y FPIb. Alternativamente se centrífuga como se mencionó anteriormente. 6. Estas fracciones se usaran posteriormente para determinarles proteína, actividad y realizar el corrimiento electroforético. NOTA. Posteriormente se lava la columna con al menos 10 ml de agua estéril y se guarda la columna lavada para ser reutilizada por otro grupo de estudiantes. Entregar al profesor. C. Purificación por cromatografía de afinidad. 1. Se utiliza una columna que se empaca con DEAE Affi-gel Blue (ver apéndice) 2. Se equilibra la columna al adicionar poco a poco 1 ml de amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol- PMSF (preparado al momento, como se indica en Reactivos o Apéndice I). El volumen que drena se desecha. Para acelerar el proceso de paso de las soluciones en la columna se puede centrifugar a 3000 rpm por 5 min a 4 C. 3. Enseguida se adiciona poco a poco 900 µl de la Fracción 4. Se centrífuga a a 3000 rpm por 5 min a 4 C o se deja drenar y se elimina la fracción no adsorbida (aproximadamente 900 µl, este es el volumen muerto, y no contiene proteína. 4. Añadir 1 ml del amortiguador Tris-PMSF para eliminar a las proteínas que no se han unido a la columna