CEPA CP-5 DE Streptomyces sp. INHIBE GERMINACIÓN DE CONIDIOS DE HONGOS. STRAIN CP-5 OF Streptomyces sp. INHIBITS CONIDIAL GERMINATION OF FUNGAL

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1 1 1 2 CEPA CP-5 DE Streptomyces sp. INHIBE GERMINACIÓN DE CONIDIOS DE HONGOS FITOPATÓGENOS STRAIN CP-5 OF Streptomyces sp. INHIBITS CONIDIAL GERMINATION OF FUNGAL PHYTOPATHOGENS Raúl Asael Rodríguez-Villarreal 1, Patricia Rivas-Valencia 2, Carlos Eduardo Hernández-Luna 1, Sergio Manuel Salcedo-Martínez 1, Raúl Rodríguez-Guerra 3& Facultad de Ciencias Biológicas, Av. Pedro de Alba y Manuel L. Barragán S/N, Facultad de Ciencias Biológicas, UANL, Ciudad Universitaria, C.P San Nicolás de los Garza Nuevo León, México; 2 Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), Campo Experimental Valle de México, km 13.5 carretera Los Reyes-Texcoco, Coatlinchán, Estado de México, México, C.P Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), Campo Experimental General Terán, km. 31 carretera Montemorelos-China, General Terán, Nuevo León, México C.P & Autor para correspondencia: rodriguez.raul@inifap.gob.mx Rodríguez-Villarreal et al: Inhibición de germinación conidial por Streptomyces sp

2 RESUMEN La cepa CP-5 de Streptomyces sp. previamente se reportó como antagónica contra hongos fitopatógenos habitantes del suelo y con acción fungicida contra Phytophthora capsici Leonian (Peronosporales: Pythiaceae). Se evaluó la capacidad de CP-5 sobre la germinación de conidios de cinco fitopatógenos en confrontaciones duales, la acción fungicida contra cuatro de ellos mediante la remoción de conidios de las confrontaciones, y sobre el biocontrol de Colletotrichhum musae (Berkeley & Curtis) Arx (Glomerellales: Glomerelaceae) en frutos de plátano por filtrados libres de células. La germinación de conidios fue inhibida de un 98.5 al 100 % y los conidios germinados fueron incapaces de desarrollar colonias, sugiriendo que CP-5 también tiene actividad antagónica contra las hifas de estos fitopatógenos. La remoción de conidios de la confrontación por 24 h con CP-5 demostró una potente acción fungicida. El filtrado libre de células de una colonia de 19 días de edad de CP-5 evitó la formación de apresorios, el desarrollo de lesiones más allá del sitio de inoculación y la producción de acérvulos en frutos inoculados con C. musae; mientras que el filtrado de una colonia de 260 días de edad fue incapaz de evitar la formación de apresorios, y el desarrollo de síntomas y acérvulos de C. musae. Los resultados demuestran que la cepa CP-5 tiene un mayor espectro de actividad antagónica al reportado previamente, que también cuenta con acción fungicida contra conidios de hongos fitopatógenos y su filtrado libre de células protege de la antracnosis a frutos de plátano inoculados con C. musae PALABRAS CLAVE: Streptomyces sp., acción fungicida, biocontrol de Colletotrichum musae

3 ABSTRACT The CP-5 strain of Streptomyces sp. was previously reported with high antagonistic activity against phytopathogenic fungi soil inhabitants, and fungicidal action against Phytophthora capsici Leonian (Peronosporales: Pythiaceae). The ability of CP-5 to inhibit conidial germination of five phytopathogens in dual confrontations, the fungistatic or fungicidal action against four of them by removing conidia of confrontations, as well as the ability of biocontrol of Colletotrichum musae (Berkeley & Curtis) Arx (Glomerellales: Glomerelaceae) in banana fruits by cell-free filtrates was evaluated. The conidial germination was inhibited from 98.5 to 100%, but the germinated conidia were unable to develop colonies, suggesting that CP-5 also has antagonist activity against the hyphae of these phytopatogens. The removal of conidia of confrontation for 24 h with CP-5 demonstrated potent fungicidal action. The cell-free filtrate of a 19 days old colony of CP-5 prevented the formation of appressoria, lesion development beyond the site of inoculation and acervuli production in banana fruit inoculated with conidia; while filtrated of a colony of 260 days old was unable to prevent the formation of appressoria, and the development of symptoms and acervuli of C. musae. The results show that the CP-5 strain of Streptomyces sp. has a broader spectrum of antagonistic activity than previously reported, it also has fungicidal activity against conidia of phytopathogenic fungi and their free cell filtrate is able to protect of anthracnose to banana fruits inoculated with C. musae KEY WORDS: Streptomyces sp., fungicidal activity, biocontrol of Colletotrichum musae

4 INTRODUCCIÓN Los actinomicetos son el mayor grupo de microorganismos que producen compuestos con actividad biológica, por lo que han recibido gran atención en la búsqueda de nuevas cepas y especies capaces de tener alguna actividad biológica en diversos campos de aplicación, incluyendo el área agrícola (Hasani et al., 2014; Sharma, 2014). Durante la búsqueda de microorganismos con capacidad de causar un elevado nivel de antagonismo contra fitopatógenos, es común reportar cepas o especies de actinomicetos como potenciales agentes de biocontrol (Mokrane et al., 2013; Evangelista-Martínez, 2014; Shahbazi et al., 2014). Sin embargo, es frecuente que se desconozca el efecto de esos antagonistas contra otros fitopatógenos, limitando el conocimiento de su espectro de acción para el desarrollo de nuevos bioproductos. Un caso exitoso es el del actinomiceto Streptomyces lydicus DeBoer, Dietz, Silver & Savage (Actinomicetales: Streptomycetaceae), que inicialmente se reportó con actividad biológica contra Pythium ultimum Trow (Peronosporales: Pythiaceae) en Europa (Crawford et al., 1993), y que ahora es comercializado como un producto con actividad biofungicida contra numerosas especies tanto de hongos como de bacterias fitopatógenas. En México se han identificado cepas de actinomicetos aislados de suelos agrícolas (Castillo-Fabela et al., 2001; Dávila et al., 2013), de hormigas (Sánchez-Ovalle et al., 2011; Dávila et al., 2013) y de suelos no cultivados (Evangelista-Martínez, 2014) que han mostrado actividad antagónica contra fitopatógenos como Colletotrichum sp., Rhizoctonia solani Kühn (Cantharellales: Ceratobasidiaceae) y Phytophthora capsici Leonian (Peronosporales: Pythiaceae). Sin embargo, es necesario ampliar el número de microorganismos con potencial como agentes de biocontrol que cuenten con un mayor espectro de acción contra fitopatógenos, que permita el desarrollo de nuevos productos o subproductos para el control de enfermedades de plantas. Previamente se seleccionó una cepa de actinomiceto denominada CP-5, e identificada como Streptomyces sp., por su actividad antagónica sobre el crecimiento micelial de fitopatógenos causantes

5 de pudrición de raíz en diversos cultivos. Esta actividad fue de tipo fungistática contra R. solani y Macrophomina phaseolina (Tassi) Goidanichen (Botryosphaeriales: Botryosphaeriaceae) y fungicida contra P. capsici (Rodríguez-Villarreal et al., en revisión). Aquí se extiende la investigación con la cepa CP-5 para establecer si cuenta con actividad antagónica contra conidios, los cuales son importantes estructuras de diseminación y de desarrollo de epifitias en especies de hongos fitopatógenos. El objetivo de esta investigación consistió en determinar la capacidad de la cepa CP-5 de Streptomyces sp. para inhibir la germinación de conidios de cinco especies de hongos fitopatógenos de conocida importancia, cuatro que causan daños severos en frutos y uno causante de pudriciones de raíz. Adicionalmente se evaluó la capacidad de biocontrol de filtrados libres de células de CP-5 en frutos de plátano inoculados con C. musae. Lo anterior permitiría establecer un mayor espectro de acción de CP- 5 sobre fitopatógenos y su potencial para desarrollarse como agente de biocontrol. MATERIALES Y MÉTODOS Cepas. La cepa CP-5 de Streptomyces fue aislada de suelo colectado en 2012 del Cerro del Potosí y se ha mantenido en activo mediante transferencias cada 2-5 meses. Las cepas de fitopatógenos de importancia por atacar diversos frutos, y productoras de conidios, utilizadas en esta investigación son C. gloeosporioides (Penzig) Penzig & Saccardo (Glomerellales: Glomerelaceae) que causa antracnosis en diversos cultivos, C. musae que causa antracnosis en plátano, Penicillium sp. que causa pudrición de frutos de diversas especies y Monilinia fructicola (Winter) Honey (Helotiales: Sclerotiniaceae) que causa la pudrición café del durazno. Otro fitopatógeno productor de conidios utilizado es Fusarium oxysporum Schlechtendal (Hipocreales: Nectriaceae), que es causante de pudrición de raíz en diversos cultivos. Todas las cepas se encuentran conservadas en agua y aceite mineral (Rodríguez y Gato, 2010). Inhibición de la germinación de conidios. La cepa CP-5 fue inoculada en el centro de cajas Petri conteniendo el medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) y se mantuvo en crecimiento por 8 días a 26

6 C previo a la inoculación con conidios de C. gloeosporioides, C. musae, F. oxysporum, Pencillium sp. y M. fructicola. Se elaboró una suspensión de conidios de cada fitopatógeno a una concentración de 500 mil conidios ml -1, y 10 µl de suspensión de cada uno se confrontó en cuatro puntos alrededor de cada colonia de CP-5, a una distancia aproximada de 1 cm. Cada fitopatógeno se inoculó en cuatro cajas Petri (repeticiones) tanto con la bacteria como en el testigo conteniendo sólo PDA, y se incubaron a 26 C. A las 24 h se cuantificó, en un campo microscópico a 150 X, los conidios germinados en los cuatro puntos de inoculación por caja Petri y se obtuvo el porcentaje promedio de germinación por repetición en base al total de conidios observados. Se consideraron conidios germinados aquellos que mostraron un tubo germinativo mayor del 50 % de su tamaño. Sólo en el testigo de M. fructicola fue posible determinar la germinación debido a que el lento crecimiento del micelio desarrollado a partir de los conidios germinados permitió su cuantificación. Mientras que en los testigos de los demás fitopatógenos el crecimiento micelial fue denso e imposibilitó la cuantificación de conidios individuales germinados o no, por lo que se consideró el 100 % de germinación en éstos. A los cuatro días de establecidas las confrontaciones se determinó, en cada repetición, el porcentaje de puntos de inoculación de conidios que desarrollaron colonias. Tipo de antibiosis sobre conidios. Se evaluó la capacidad fungicida de CP-5 sobre conidios de C. musae, C. gloeosporioides, Pencillium sp. y F. oxysporum. Se inocularon 10 µl de una suspensión de 500 mil conidios ml -1 en cuatro puntos (repeticiones) alrededor de colonias de CP-5 de 20 días de edad, crecidas en el centro de cajas Petri conteniendo PDA; como testigos se inocularon las suspensiones de cada fitopatógeno en cuatro puntos de cajas Petri conteniendo sólo PDA. A las 24 h se determinó la ocurrencia o no de germinación en los cuatro puntos inoculados con conidios, y se obtuvo el porcentaje de puntos en los que hubo al menos un conidio germinado. También, a partir de la confrontación con CP-5, se transfirieron e invirtieron en una nueva caja Petri con PDA los fragmentos

7 de medio de cultivo en que se inocularon los conidios, para dejarlos depositados y determinar su viabilidad transcurridas otras 24 h. Se determinó el porcentaje de conidios germinados en base al total de conidios observados (n) en dos campos visuales del microscopio a 150 X, de cada repetición. La germinación mayor al 98 % de los conidios se consideró que es debida a un efecto fungistático, en el que los conidios se mantienen viables sin germinar durante la confrontación en presencia de CP-5; mientras que una germinación menor al 2 % se consideró un efecto fungicida, en el que los conidios se vuelven inviables después de 24 h de confrontación con CP-5. Adicionalmente, a las 72 h se determinó el porcentaje de colonias que se desarrollaron a partir de los conidios depositados en las cajas Petri conteniendo PDA. Se excluyó a M. fructicola de este experimento debido a que fue incapaz de desarrollar colonias visibles en el experimento anterior. Inhibición de apresorios de C. musae. En frutos de plátano se determinó la capacidad del filtrado libre de células de la cepa CP-5 sobre la formación de apresorios a partir de conidios, el diámetro de lesión y la formación de acérvulos de C. musae. Se utilizaron colonias de 19 y 260 días de edad de CP- 5 crecidas en PDA y mantenidas a 26 C. Se extrajeron discos de 1.3 cm de diámetro del borde externo de las colonias de CP-5, se colocaron en 3 ml de agua estéril y se agitaron a 100 rpm por 18 hr. Posteriormente se colectó el líquido, y se utilizó como filtrado libre de células; una alícuota de 40 µl de filtrado obtenido de colonias de ambas edades se dispersó en cajas Petri conteniendo PDA para confirmar que estaban libres de células de CP-5. Además, se elaboró una concentración de 500 mil conidios ml -1 a partir de una colonia de seis días de edad de C. musae; de esta suspensión se dispersaron 40 µl en cajas Petri conteniendo PDA para determinar la viabilidad de los conidios. Se estableció un experimento independiente, bajo un diseño completamente al azar con cuatro repeticiones (un fruto por repetición), para el filtrado obtenido de las colonias de cada edad de CP-5. Los tratamientos consistieron del testigo (20 µl de agua estéril), filtrado (10 µl de agua con 10 µl de

8 filtrado), conidios de C. musae (10 µl de agua con 10 µl de suspensión de conidios) y filtrado más conidios (10 µl de filtrado con 10 µl de suspensión de conidios). Los tratamientos se aplicaron en tres sitios de cada fruto. A las 24 y 48 h se observó bajo un microscopio estereoscópico a 56 X la ocurrencia o no de apresorios en cada sitio de inoculación, se obtuvo el porcentaje de sitios con presencia de apresorios en cada fruto y se realizó un análisis estadístico con los datos obtenidos a las 48 h. A los nueve días se midió el diámetro de las lesiones (cm) y se determinó la ocurrencia de acérvulos en los sitios inoculados; con los datos se obtuvo un promedio y un porcentaje de ambas variables respectivamente, y se analizaron estadísticamente. Análisis de datos. Los datos obtenidos fueron sometidos a un análisis de varianza, y en su caso se obtuvieron comparaciones de medias mediante la prueba de Tukey. RESULTADOS Inhibición de la germinación de conidios. Los conidios de C. gloeosporioides, C. musae y M. fructicola fueron incapaces de germinar a las 24 h de haberse establecido la confrontación con CP-5. Mientras que para Pencillium sp. y F. oxysporum la germinación fue de 1.5 y 0.5 %, respectivamente (Cuadro 1). Aunque fueron escasos los conidios germinados de estas últimas especies, no se observó el desarrollo de colonias a los cuatro días después de establecidas las confrontaciones (Fig. 1). Aunque el porcentaje de conidios germinados de M. fructicola es menor al 100 % en el testigo, no se observó conidios germinados en la confrontación con CP-5. Los resultados demuestran una fuerte actividad antagónica de CP-5 sobre la germinación de conidios de los fitopatógenos evaluados. Tipo de antibiosis sobre conidios. Se desarrolló un abundante crecimiento micelial a las 24 h en los testigos de cada fitopatógeno inoculados en PDA; mientras que en la confrontación de conidios con CP-5 no se observó germinación en los cuatro puntos de inoculación de los fitopatógenos. La confrontación de conidios de los fitopatógenos por 24 h con CP-5 causó una inhibición completa de su germinación a las 24 h posteriores de su transferencia a cajas Petri conteniendo PDA, y sólo se

9 desarrolló una colonia de C. gloeosporioides y Penicillium sp. a las 72 h después de la transferencia de conidios de los cuatro puntos inoculados (Cuadro 2). Considerando el criterio establecido en los materiales y métodos, se muestra que el antagonismo causado por CP-5 es debido a una antibiosis que causa un efecto fungicida sobre los conidios de los cuatro fitopatógenos usados en el experimento. Inhibición de apresorios de C. musae. Las cajas Petri inoculadas con los filtrados obtenidos de colonias de 19 y 260 días de edad de CP-5 de Streptomyces sp. mostraron ausencia de colonias de la bacteria, confirmando que se encontraban libres de células; mientras que en la suspensión de conidios de C. musae dispersada en PDA todos los conidios observados se encontraron germinados, lo que indicó la viabilidad de los conidios usados en los experimentos. El filtrado libre de células obtenido de una colonia de CP-5 de 19 días de edad mostró frutos de plátano con porcentajes de sitios inoculados con formación de apresorios y producción de acérvulos, así como diámetro de lesiones, similares al testigo y al tratamiento con filtrado más conidios de C. musae (p=0.01). En el experimento con el filtrado libre de células de CP-5 de 260 días de edad, los dos tratamientos con inoculación de C. musae fueron similares entre sí para el porcentaje de sitios con formación de apresorios y producción de acérvulos, pero diferentes al testigo y al filtrado solo; mientras que para el diámetro de lesión hubo diferencias (p=0.01) entre los cuatro tratamientos (Cuadro 3). Los resultados muestran que el filtrado libre de células de una colonia joven de CP-5 (19 días de edad) es capaz de inhibir la formación de apresorios de C. musae (Fig. 2), reducir el área dañada por el fitopatógeno y evitar el desarrollo de acérvulos en frutos de plátano (Fig. 3). También, se demostró que esta actividad se pierde en filtrados obtenidos de colonias de 260 días de edad. DISCUSIÓN La ausencia de germinación de conidios de C. gloeosporioides, C. musae y M. fructicola y el bajo porcentaje de germinación de Pencillium sp. y F. oxysporum, que ocurren en la confrontación con la cepa CP-5 de Streptomyces sp., demostró que esta cepa tiene una potente actividad antagónica contra

10 estos fitopatógenos, además de la previamente reportada contra R. solani, M. phaseolina y P. capsici (Rodríguez-Villarreal et al., en revisión). Aunque hubo un porcentaje bajo de conidios germinados de Pencillium sp. y F. oxysporum a las 24 h de establecida la confrontación, éstos fueron incapaces de desarrollar colonias a los cuatro días posteriores, lo que sugiere que CP-5 tiene actividad antagónica contra el crecimiento micelial de ambas especies mientras permanecen en la confrontación. Aunque la exposición de conidios de C. gloeosporioides, C. musae, Pencillium sp. y F. oxysporum por 24 h con una colonia de CP-5 inhibió completamente la germinación, y aún a las 24 h de su remoción a nuevo medio de cultivo sin CP-5, fue posible observar una colonia (25 %; de un máximo posible de cuatro) de C. gloeosporioides y Pencillium sp. a las 72 h. Lo anterior indica que al menos un reducido número de conidios pueden mantener su viabilidad después de 24 h de exposición a la cepa CP-5. Algunas investigaciones han evaluado la capacidad antagónica de cepas de Streptomyces en confrontaciones duales (Sživković et al., 2010; Maldonado et al., 2010; Dávila et al., 2013; Kanini et al., 2013; Shahbazi et al., 2014) o sus productos (Taechowisan et al., 2005; Alam et al., 2012; Taechowisan et al., 2012) sobre la germinación de conidios de algunos de los fitopatógenos usados en esta investigación, pero sólo se encontró documentada la acción fungicida o fungistática por Streptomyces sp. contra Peniillium digitatum (Maldonado et al., 2010; Najmeh et al., 2014). Bajo las condiciones in vitro utilizadas en esta investigación, se demuestra que la cepa CP-5 de Streptomyces sp. tiene una acción fungicida contra conidios de los cuatro fitopatógenos evaluados. La actividad inhibitoria de filtrados libres de células de una colonia de 19 días de edad de CP-5 sobre la formación de apresorios de C. muse en frutos, indica que el antagonismo observado contra este fitopatógeno en cajas Petri es debido a productos liberados al medio de cultivo expuesto al crecimiento de la bacteria. La inhibición de apresorios se vio reflejada en una menor área dañada y ausencia de producción de acérvulos en la inoculación combinada del fitopatógeno y el filtrado. Algunas investigaciones han sido dirigidas a la selección in vitro de actinomicetos con actividad antagónica

11 contra C. musae, como los estudios de Taechowisan et al. (2005 y 2012), pero sólo una muestra resultados similares a los obtenidos en esta investigación sobre la reducción del diámetro de las lesiones en fruto (Ara et al., 2012). Estos últimos autores inocularon numerosas cepas de actinomicetos en frutos de plátano y encontraron una identificada como Streptomyces sp. capaz de inhibir cerca del 85% los daños causados por la enfermedad cuando se inoculó C. musae. El uso de filtrado libre de células de la colonia de CP-5 de 19 días de edad causó un diámetro de lesión similar al testigo; sin embargo, el filtrado de colonia de 260 días de edad no evitó la formación de apresorios y de acérvulos, así como la aparición de síntomas. Lo anterior indica que el sustrato expuesto al crecimiento de CP-5 pierde su actividad contra C. musae cuando es mantenido por un largo periodo de almacenamiento. Es conocido que filtrados libres de células de cepas antagónicas del género Streptomyces son potentes inhibidores del crecimiento micelial o de la germinación de conidios de fitopatógenos, por lo que las respuestas observadas en los experimentos desarrollados en esta investigación posiblemente se deban a la producción de antibióticos o enzimas, como se ha reportado previamente en otras especies del género Streptomyces (Anitha y Rabeeth, 2010; Sharma, 2014; Kumar y Kumar, 2014). Previamente se ha reportado que la cepa CP-5 de Streptomyces sp. tiene fuerte actividad antagónica contra el crecimiento micelial de cuatro fitopatógenos habitantes del suelo causantes de pudriciones de raíz en plantas cultivadas. En esta investigación se encontró que esta cepa cuenta con un mayor espectro de acción contra conidios de cinco fitopatógenos, y que tiene una acción fungicida contra C. gloeosporioides, C. musae, F. oxysporum y Penicillium sp. Adicionalmente, se demostró que el filtrado libre de células de CP-5 tiene un efecto de biocontrol contra C. musae en frutos de plátano. Es necesario determinar en un futuro próximo algunas propiedades del filtrado libre de células de CP-5 sobre la acción fungicida observada en esta investigación, así como establecer la capacidad de la

12 bacteria en mantener esta acción sobre distintos sustratos e identificar el o los compuestos responsables de la antibiosis. AGRADECIMIENTOS Se agradece el apoyo financiero otorgado por el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (No. de registro ; INIFAP) para la realización de esta investigación como parte del proyecto Desarrollo y establecimiento de estrategias de selección y evaluación de agentes de biocontrol contra hongos y bacterias fitopatógenas. LITERATURA CITADA Alam, M., S. Dharni, A. Khaliq, S. K. Srivastava, A. Samad & M. K. Gupta A promising strain of Streptomyces sp. with agricultural traits for growth promotion and disease management. Indian. Exp. Biol. 50: Anitha A. & M. Rabeeth Degradation of fungal cell walls of phytopathogenic fungi by lytic enzyme of Streptomyces griseus. Afr. J. Plant Sci. 4: Ara I., H. Rizwana, M. R. Al-Othman & M. A. Bakir Studies of actinomycetes for biological control of Colletotrichum musae pathogen during post harvest anthracnose of banana. African Journal of Microbiology Research 6: Castillo-Fabela, E., G. Gallegos-Morales, F. D. Hernández-Castillo, M. Cepeda-Siller, y V. M. Zamora-Villa Efectividad In Vitro de actinomicetos aislados de rizósfera de papa sobre Rhizoctonia solani Kühn. Revista Mexicana de Fitopatología 19: Crawford D.L., J. M. Lynch, J. M. Whipps & M. A. Ousley Isolation and characterization of actinomycete antagonists of a fungal root pathogen. Applied and Environmental Microbiology 59:

13 Dávila M., M. D., G. Gallegos M., F. D. Hernández C., Y. M. Ochoa F., y A. Flores O Actinomicetos antagónicos contra hongos fitopatógenos de importancia agrícola. Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas 4: Evangelista-Martínez Z Isolation and characterization of soil Streptomyces species as potential biological control agents against fungal plant pathogens. World J. Microbiol. Biotechnol. 30: Hasani A., A. Kariminik & K. Issazadeh Streptomycetes: Characteristics and their antimicrobial activities. Int. J. Adv. Biol. Biom. Res. 2: Kanini G. S., E. A. Katsifas, A. L. Savvides & A. D. Karagouni Streptomyces rochei ACTA1551, an indigenous Greek isolate studied as a potential biocontrol agent against Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici. BioMed Research International. 2013:10p. Kumar R. & S. Kumar Bioprospecting of actinomycetes and its diversity in various environments: a review. Current Discovery 3: Maldonado M. C., C. E. Orosco, M. A. Gordillo & A. R. Navarro In vivo and in vitro antagonism of Streptomyces sp. RO3 against Penicillium digitatum and Geotrichum candidum. African Journal of Microbiology Research 4: Mokrane S., N. Bouras, N. Sabaou & F. Mathieu Actinomycetes from saline and non-saline soils of Saharan palm groves: Taxonomy, ecology and antagonistic properties. African Journal of Microbiology Research. 7: Najmeh N., G. H. Shahidi Bonjar, S. Sareh & L. Shahidi Bonjar Biological control of citrus green mould, Penicillium digitatum, by antifungal activities of Streptomyces isolates from agricultural soils. Af. J. Microbiol. Res. 8: Rodríguez, B. D. y C. Y. Gato Métodos alternativos en la conservación de Trichoderma harzianum Rifai. Fitosanidad 14:

14 Rodríguez-Villarreal R. A., K. I. Peña-Carrillo, E. Fernández-Cruz, I. H. Almeyda-León, I. Hernández- Torres, E. Acosta-Díaz, R. Rodríguez-Guerra Antagonismo e identificación genética de un actinomiceto con potencial para el biocontrol de Phytophthora capsici Leonian (Peronosporales: Pythiaceae). Vedalia (en revisión). Sánchez-Ovalle M. D. R., S. R. Sánchez-Peña, G. Gallegos-Morales y A. Sánchez-Arizpe Actividad inhibitoria de actinomicetos aislados de hormigas cultivadoras de hongos (Hymenoptera: Formicidae) sobre Colletotrichum lindemuthianum y Rhizoctonia solani. Revista Agraria-Nueva Epoca 8: Shahbazi P., Md. Y. Musa, G. Y. A. Tan, F. A. Avin, W. F. A. Teo & V. Sabaratnam In vitro and in vivo evaluation of Streptomyces suppressions against anthracnose in chili caused by Colletotrichum. Sains Malaysiana 43: Sharma M Actinomycetes: Source, identification, and their applications. Int. J. Curr. Microbiol. App. Sci. 3: Sživković S., S. Stojanović, Ž. Ivanović, V. Gavrilović, T. Popović & J. Balaž Screening of antagonistic activity of microorganisms against Colletotrichum acutatum and Colletotrichum gloeosporioides. Arch. Biol. Sci. 62: Taechowisan T., S. Chanaphat, W. Ruensamran & W. S. Phutdhawong Antifungal activity of 3- methylcarbazoles from Streptomyces sp. LJK109; an endophyte in Alpinia galangal. Journal of Applied Pharmaceutical Science 2: Taechowisan T., C. Lu, Y. Shen & S. Lumyong Secondary metabolites from endophytic Streptomyces aureofaciens CMUAc130 and their antifungal activity. Microbiol. 151:

15 Cuadro 1. Conidios germinados a las 24 h, y colonias desarrolladas a los cuatro días, durante la confrontación de cinco fitopatógenos con CP-5. Tratamiento Conidios germinados (%) (n)* Colonias desarrolladas (%) (n)** C. gloeosporioides a Nd*** a 4 CP-5 vs C. gloeosporioides 0.0 b b 4 C. musae a Nd a 4 CP-5 vs C. musae 0.0 b b 4 Penicillium sp a Nd a 4 CP-5 vs Penicillium sp. 1.5 b b 4 F. oxysporum a Nd a 4 CP-5 vs F. oxysporum 0.5 b b 4 M. fructicola 80.2 a a 4 CP-5 vs M. fructicola 0.0 b a *= promedio de conidios observados por repetición; **= promedio de puntos inoculados observados por repetición; ***= no determinado

16 Cuadro 2. Germinación a las 24 h y desarrollo de colonias a las 72 h a partir de conidios de cuatro especies de fitopatógenos después de confrontados con CP-5 por 24 h. Conidios germinados (%) (n)* Colonias desarrolladas (%) (n) C. gloeosporioides C. musae F. oxysporum Penicillium sp *= número de observaciones

17 Cuadro 3. Efecto de filtrado libre de células de colonias de dos edades de CP-5 sobre la formación de apresorios (a las 24 h), y diámetro de lesión y formación de acérvulos de C. musae (a los 9 días) en frutos de plátano. Filtrado de colonia de19 días Filtrado de colonia de 260 días Tratamiento Sitios con Diámetro Lesiones con Sitios con Diámetro Lesiones con formación de de lesión acérvulos formación de de lesión acérvulos apresorios (%) (cm) (%) apresorios (%) (cm) (%) Testigo 0.0 a 0.61 a 0.0 a 0.0 a 0.40 c 0.0 a Filtrado 0.0 a 0.59 a 0.0 a 0.0 a 0.60 bc 0.0 a C. musae b 1.17 b b b 1.35 a b Filtrado + C. 0.0 a 0.62 a 0.0 a b 0.97 ab b musae Valores promedio de cada tratamiento seguidos de la misma letra no difieren estadísticamente (p=0.01; Tukey)

18 Figura 1. Desarrollo de colonias a partir de conidios de cinco fitopatógenos a los cuatro días de establecidas las confrontaciones con CP-5. Testigos en la fila superior, y en la inferior las confrontaciones Figura 2. Frutos de plátano (primer plano) y sitios tratados en los frutos (segundo plano) a las 48 h de ser tratados con agua (A), filtrado libre de células de colonia de 19 días de edad de CP-5 (B), conidios de C. musae (C) con un recuadro (D) mostrando apresorios (flechas), y filtrado más conidios de C. musae (E) Figura 3. Imagen a los nueve días de sitios tratados con agua (A), conidios de C. musae (B) mostrando acérvulos (flechas), filtrado libre de células de colonia de 19 días de edad de CP-5 (C) y filtrado más conidios de C. musae (D)

19 Fig

20 Fig

21 Fig