ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE EMPAQUES COMESTIBLES Y BIODEGRADABLES A BASE DE PROTEINA DE SUERO LACTEO INCORPORADO CON NISINA, EDTA Y NICON

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1 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE EMPAQUES COMESTIBLES Y BIODEGRADABLES A BASE DE PROTEINA DE SUERO LACTEO INCORPORADO CON NISINA, EDTA Y NICON Arredondo Ruiz M., García Almendaréz B. E. y Regalado González C. DIPA. Facultad de Química. Universidad Autónoma de Querétaro RESUMEN Microorganismos patógenos como Listeria monocytogenes pueden encontrarse principalmente en la superficie y esto se atribuye a una contaminación post-procesamiento ó una manipulación inadecuada. En el presente trabajo se llevo a cabo el estudio de la actividad de tres agentes antimicrobianos: Nisina (0.01% p/v), bacteriocina producida por una bacteria láctica Lactococcus lactis; Nicón (150, 200, 250 y 300 ppm), extracto cítrico de amplio espectro y EDTA (30mM), un compuesto quelante, contra microorganismos deterioradores y patógenos de alimentos. Los cuales fueron incorporados en un material de empaque biodegradable y comestible, a base de proteína de suero. Inicialmente se valoró la prueba se sensibilidad en placa (in vitro), probando hasta 11 concentraciones y mezclas de los agentes; seleccionándose aquellos que presentaron actividad con los microorganismos de prueba. Posteriormente se incorporaron éstos en los materiales de empaque. El material de empaque esta compuesto de proteína de suero (WPI), un agente plastificante (sorbitol) y un compuesto hidrofóbico (cera de abeja), entre sus componentes mayoritarios. En las pruebas in vitro los compuestos que presentaron amplia actividad antimicrobiana fueron: Nicon (250ppm), y a las mezclas de Nisina + Nicon 250 y Nisina + Nicon 300. Realizandose contra los microorganismos deterioradores de alimentos cárnicos: Pseudomona sp, Brochotrix thermospacta, y Lactobacillus minor. Los agentes antimicrobianos fueron incorporados en la formulación del material de empaque en las concentraciones antes mencionadas, logrando obtener un empaque como su sabor aceptable. Se estudió la actividad antimicrobiana del empaque elaborado, mediante la prueba de difusión en agar, por medio de dos tecnicas: disco-cubierto y discoextendido en supericie, en la primera se simula el efecto de la película activa sobre el alimento contaminado y en la segunda estando un alimento ya empacado, el efecto de la película activa sobre una contaminación posterior inoculado con los microorganismos deterioradores y se incluyendo al reto los patógenos Listeria monocytogenes Scott A, Stafylococcus aureus 4389 además también se reto el hongo Aspergilius niger. Los materiales activos desarrollados presentaron actividad antimicrobiana en cada uno de ellos. El estudio de agentes antimicrobianos de origen natural, así como el desarrollo de sistemas apropiados de incorporación en materiales de empaque, son aspectos importantes de la aplicación de la microbiología y la biotecnología para la implementación y mejora de una eficiente tecnología de las barreras múltiples en la conservación de los alimentos. INTRODUCCIÓN La inocuidad de los alimentos es un problema muy importante que debe considerarse no sólo en nuestro país sino alrededor de todo el mundo. Muchas tecnologías han sido desarrolladas para asegurar hacia la conservación de los alimentos basada en cambios de Página 1 de 1

2 temperatura, reducción de la actividad de agua, control del ph, irradiación etc,. Sin embargo, todos estos métodos pueden ser aplicados en combinación con una variedad de agentes antimicrobianos. (Min, 2005). La combinación de agentes antimicrobianos con diferentes mecanismos de acción es una aplicación de la teoría de barreras múltiples. La aplicación de recubrimientos y películas biodegradables y comestibles protectoras que prolongan la vida de anaquel, no es nueva. El recubrimiento de naranjas y limones frescos con cera evitando la perdida de agua, fue practicada en China desde los siglos XII y XIII. (Hardenburg, 1967) Esto fue solo el inicio de una serie de desarrollos e innovaciones en la creación de una gran variedad de materiales de empaque hasta nuestros días (Miller, 1997). Las ventajas de la utilización de estos materiales biodegradables, como empaques en alimentos, es la sustitución de polímeros sintéticos, disminuyendo la explotación de los recursos no renovables contribuyendo a la disminución del deterioro ambiental. En los últimos treinta años diversos reportes han sido realizados en el uso de películas y recubrimientos que extienden la vida de anaquel y mantienen la calidad de los alimentos frescos, congelados y procesados (Kester y Fennema, 1986).Los empaques para alimentos son importantes por que los protegen, permitiendo mantener la calidad, evitando problemas de rancidez, contaminación microbiana, pérdida de humedad, aroma, sabor, entre otros. Generalmente una película comestible es definida como una capa delgada de polímeros biodegradables comestibles, que se encuentran en los alimentos en forma de recubrimiento o como una película pre-formada sobre o entre los componentes de los alimentos (Krochta y DeMulder-Johnson, 1997). Un empaque activo ha sido definido como un sistema en el cual el alimento, el empaque y la atmósfera interactúan de una forma positiva prolongando la vida de anaquel o bien brindando características muy especificas. (Miltz y Passy, 1995). Dentro de las sustancias activas que pueden ser incorporadas encontramos agentes antimicrobianos, antioxidantes, saborizantes, pigmentos, etc. brindando a las películas funciones activas que mantienen o mejoran la calidad de los alimentos además de ser comestibles y biodegradables (Han, 2001) Los agentes antimicrobianos pueden ser incorporados en los materiales de empaque inicialmente y migrar dentro del alimento a través de la difusión. No debemos olvidar que la investigación de los empaques tiene mas apoyo hacia las películas comestibles y biodegradables, tales como películas de proteína. Algunas ventajas de la utilización de películas incluyen: disminución de la contaminación ambiental (películas que son biodegradables), mejoramiento de las propiedades de los alimentos empacados (sabores, colores), reducción de la pérdida de humedad y valor nutricional (Kim y Ustunol, 2001) MATERIALES Y METODOS Los medios de cultivo utilizados fueron Agar Soya Tripticaseina (AST) Bioxon, Agar MRS (MRS) Oxoid, Caldo Soya Tripticaseina (Bioxon ), Caldo MRS (Difco ), Agar y Caldo BHI (Bioxon ). Peptona Bacteriológica 0.1% (Oxoid ) como diluyente. Los agentes antimicrobianos utilizados fueron: Nisina (Ecobio Biotech, China), EDTA (Invitrogen USA) 1% y Nicón (Comercializadora Argarza). Los microorganismos utilizados fueron Pseudomona sp en medio AST, Brochotrix t. en medio AST, y Página 2 de 2

3 Lactobacillus minor en MRS, Stafylococcus aureus y Listeria monocytogenes en medio BHI. El efecto antimicrobiano de los agentes y de los materiales de empaque activo se realizó mediante el método de la difusión en agar. Inoculando 80 μl de las diluciones adecuadas para cada microorganismo y 200 μl de Tween 20 (al 50%) e incubando por 24 horas a la temperatura de 30 y 37 ºC. Formulación de la película: WPI 5%, agente plastificante 5%, nisina 0.1%, tween 0.1%, agente hidrofóbico 0.8%. Por vertido en caja; secado de las películas 2 h a 40º C y posteriormente a temperatura ambiente hasta 24 h. Esterilización de la película con luz UV 2 h. Se colocaron las películas en el agar inoculado e incubamos por 24 h a la temperatura óptima del microorganismo de prueba. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se logro determinar la sensibilidad de microorganismos tanto deterioradores como patógenos a dos agentes antimicrobianos de origen natural (nicón y nisina). Es importante mencionar que a pesar de que el EDTA estaba considerado como un agente quelante muy activo, no fue seleccionado para su incorporación en los materiales de empaque (Tabla No1). De un total de 11 agentes antimicrobianos, se logro seleccionar 4 de ellos (nisina 0.1%, nisina + nicón 250 ppm, nisina + nicón 300 ppm, nicón 300 ppm) los cuales presentaron una mayor actividad antimicrobiana en las diferentes formulaciones de empaque incorporadas con estas concentraciones. Se logro elaborar empaques activos biodegradables, con las 5 formulaciones antes mencionadas, aceptables en sabor y apariencia. En la incorporación de los antimicrobianos seleccionados a la formulación de los empaques activos, se obtuvo una actividad importante tanto en patógenos como en deterioradores, podemos observar a demás en Brochotrix thermospacta y Listeria M. Scott A que son un ejemplo claro de la aplicación de la tecnología de barreras múltiples donde la combinación de los mecanismos de los dos agentes antimicrobianos produjeran una mayor actividad antimicrobiana ( Tabla No.2). Se observó diferencia en cuanto a los halos de inhibición para cada una de las tecnicas, en disco-extendido en supericie podemos detectar mayor actividad antimicrobiana. Se presentan ejemplos de dos alimentos que fuero recubiertos por inmersión: salchichas y pequeños trozos de queso manchego, manteniéndose intactas las características tanto físicas como organolépticas. CONCLUSIONES La mezcla de nicon nisina en sus diferentes concentraciones permitió observar la inhibición de los microorganismos tanto deterioradores como patógenos. La incorporación de mezclas nisina + nicón 250, 300; en la formulación de los empaques, permitió evaluar el efecto sobre microorganismos patógenos y deterioradores de los cuales el mas sensible Brochotrix t. De las dos técnicas de evaluación de la actividad antimicrobiana se observo una mayor sensibilidad de los microorganismos en discoextendido en superficie. Se ha estudiado una alternativa muy importante en cuestión de materiales de empaques, para prolongar la vida de anaquel de los alimentos conservando su calidad e inocuidad; Página 3 de 3

4 contribuyendo al mismo tiempo a la conservación del medio ambiente. Lo que nos brinda la oportunidad de realizar posteriormente pruebas de inhibición sobre productos alimenticios. BIBLIOGRAFÍA Han, J.H Antimicrobial food packaging. Food Technol. 54(3): Hardenburg, R.E Wax and related coatings for horicultural products. A bibliography. Agricultiral Research Service Bulletin 51-55, United States Deparment of Agriculture, Washintong, D.C. Kester, J.J, Fennema, O.R Edible films and coatings: a review. Food Technol. 40(12):47-59 Kim S.J., Ustunol Z Solubility and moisture sorption isotherms of whey protein-based edible films as influenced by lipid and plasticizer incorporation. J. Agric. Food Chem. 49: Krochta J.M., De Mulder- Johnston C Edible and biodegradables polymer films: challenges and opportunities. Food Technol. 51(2): Miller, K.S., Krochta, J.M Oxygen and aroma barrier properties of edible films: A review. Trendsa Food Sci. Technol. 8: Miltz, J., Passy, N., Mannheim, C.H Trends and applications of active packaging system. In: Food and Food Packaging Materials-Chemical Interactions. Ackerman, P., Jagerstand, M. Ohlsson, T. (Eds.). Cambridge, Royal Society of Chemistry. pp Min, S., Harris, L. J., Han, J.H., Krochta, J.M Listeria monocytogenes inhibition by whey protein films and coatings incorporating lysozyme. J. Food Prot. 68: Tabla No 1. Actividad antimicrobiana de los agentes antimicrobianos y sus mezclas in vitro Halos de inhibición / mm Pseudomona Brochotrix Lactobacillus Nisina EDTA Nisina + EDTA Nicon (250 ppm) Nicon (250 ppm) + EDTA Nicon (250 ppm) + Nisina Nicon (250 ppm)+ EDTA+ Nisina Nicon (300 ppm)+ EDTA+ Nisina Nicon (300ppm) Nicon (200 ppm) Nicon (150 ppm) HCl 0.02N Página 4 de 4

5 Tabla No 2. Agentes antimicrobianos y sus mezclas Microorganismos Nicon 300ppm Nisina Brochotrix thermospacta Nicon 250 ppm + Nisina Nicon 300 ppm + Nisina Pseudomona sp ND Lactobacillus Listeria monocytogenes ND Stafilococcus aureus ND ND Página 5 de 5