ENSAYO DE METILXANTINAS EN EQUINOS CRIOLLOS COLOMBIANOS DE PASO
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- Irene Prado Mora
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2 ENSAYO DE METILXANTINAS EN EQUINOS CRIOLLOS COLOMBIANOS DE PASO
3 PROTOCOLO DETERMINACIÓN DE METILXANTINAS EN SANGRE DE CABALLOS ALIMENTADOS CON ALFALFA PELETIZADA Y OTROS PRODUCTOS En diferentes países se han reportado resultados positivos a la presencia de metilxantinas en caballos de competencia. A diferencia del campo deportivo humano, las trazas de cafeína o sus metabolitos en la sangre y/u orina de los caballos puede generar muchos problemas si se reportan en los resultados de análisis químicos. En nuestro medio, la presencia de cafeína en el alimento de los equinos a través de subproductos de la producción de café o cacao constituye una posible causa de tales reportes. Sin embargo, puesto que la literatura científica reporta más de 60 tipos de plantas que contienen cafeína, no se debe descartar algunas de ellas como fuente de xantinas, bien sea que el animal las ingiera como material verde o como parte de alimentos concentrados o henos para equinos. (Bonati M.N., Garattini S. Pharmacokinetics of caffeine. Isl. Atlas Sci. Pharmacol. 1988; 2:33-39)
4 OBJETIVOS GENERAL Evaluar la presencia de metilxantinas en la sangre de caballos alimentados con productos que podrían contener trazas de cafeína/teobromina.
5 MATERIALES Y MÉTODOS TRATAMIENTOS Se conformarán tres grupos de la siguiente manera: GRUPO 1: T1: CONTROL NEGATIVO: Conformado por 5 animales: 4 hembras y 1 macho. Estos animales recibirán una dieta de concentrado comercial más heno de angleton, agua consumo voluntario. GRUPO 2: T2: Conformado por 5 animales: 4 hembras y 1 macho. Estos animales recibirán una dieta de concentrado comercial más alfalfa peletizada, agua consumo voluntario. Previamente se evaluarán 2 marcas comerciales de alfalfa peletizada que se hayan asociado de manera recurrente a resultados positivos a metilxantinas en animales alimentados con los mismos, y en el ensayo se utilizará aquella que muestre los mayores niveles de metilxantinas (cafeína, teobromina). GRUPO 3: T3: CONTROL POSITIVO: 2 hembras y 2 machos. Estos animales recibirán una dieta de concentrado comercial más heno de angleton y agua consumo voluntario. Al tiempo cero (t 0) del experimento, un subgrupo de 2 animales (un macho y una hembra) recibirán cafeína, uno por vía oral y el otro por vía subcutánea. El subgrupo restante de 2 animales (un macho y una hembra) recibirán teofilina, uno por vía parenteral (SC) y el otro por vía oral. Momento de administración: Tiempo cero. Protocolo Sugerido: Instituto Colombiano Agropecuario - ICA
6 MATERIALES Y MÉTODOS LA CAFEÍNA SE ADMINISTRARÁ: Por vía parenteral: se utilizará el producto CARDIOTÓN, con Reg. Ica No 643-DB, una solución inyectable que contiene 100 mg/ml. Se administrará una dosis de 2,5 mg de cafeína/kg por vía SC. Momento de administración: Tiempo cero. Por vía oral: se administrará una dosis de 4 mg de cafeína/kg; la dosis total se disolverá en 200 ml de agua destilada y se administrará mediante sonda nasogástrica, seguida de dos tazas de agua.
7 MATERIALES Y MÉTODOS LA TEOFILINA SE ADMINISTRARÁ: Por vía parenteral: utilizando un medicamento humano (solución inyectable: 10 ml contienen 200 mg de teofilina); se utilizará la vía intravenosa. El volúmen total para una dósis de 15 mg de teofilina/kg se disuelve en 100 ml de glucosa al 5% o solución salina estéril, y se administra muy lentamente. Por vía oral: utilizando un medicamento humano (comprimidos que contienen 250 mg), la dosis será de 10 mg de teofilina /kg administrado el día cero, dos veces al día.
8 METODOLOGÍA ANALÍTICA Identificación de las muestras: se hará de manera que se garantice la identificación inequívoca del animal del cual se obtuvo, con la fecha y hora de toma. Cada muestra deberá ser tomada bajo una estricta y segura cadena de custodia y subdividida en muestras A y B. Sustancias a determinar: En cada muestra de los animales de los grupos 2 y 3 se determinarán: cafeína, teofilina, teobromina y paraxantina. Métodos de análisis: Se empleará la técnica de Espectrometría de gases - Cromatografía gaseosa. MS-CG: Técnica estandarizada y validada.
9 LUGAR : CRIADERO SAN PABLO - COTA EJERCITO DE COLOMBIA MUNICIPIO : COTA, CUNDINAMARCA FECHA ENSAYO : AGOSTO 18 A 23 DE 2015 ENTIDAD RESPONSABLE : FEDEQUINAS ENTIDAD SUPERVISORA : ICA
10 MATERIALES Concentrado Comercial con registro ICA. Heno. Alfalfa Peletizada sin registro oficial. Aminofilina de uso humano, presentación en ampolletas de 10 ml (240 mg/ml). Teofilina: liberación prolongada de uso humano, presentación cápsulas de 125 mg. Cafeína de uso veterinario, presentación ampolletas de 10 ml (0,1 gr/ml). No. de Ejemplares: 14. Se realizó examen clínico previo a cada ejemplar (día cero), por Médico Veterinario adscrito a Fedequinas, registrando sexo, edad, peso, condición corporal, alzada, frecuencia cardiaca y frecuencia respiratoria. A cada ejemplar se le tomaron muestras de sangre para exámenes de laboratorio de: cuadro hemático, función hepática y función renal. Los animales fueron manejados por los palafreneros asignados al Criadero San Pablo del Ejercito Nacional.
11 TOMA DE MUESTRAS Se realizó la toma de muestras de sangre por parte de un Médico Veterinario adscrito a FEDEQUINAS, con la supervisión permanente de un funcionario asignado por el Instituto Colombiano Agropecuario ICA. El protocolo utilizado fue el mismo al que se aplica en la toma de muestras para pruebas de doping en las Exposiciones Equinas avaladas por las Asociaciones Federadas
12 ANÁLISIS DE MUESTRAS Los análisis de las muestras de sangre se realizaron en el Laboratorio de Cromatografía y Espectrometría de Masas - CROM MASS, de la Universidad Industrial de Santander, con sede en la ciudad de Bucaramanga.
13 DISEÑO UTILIZADO DISEÑO EXPERIMENTAL ENSAYO METILXANTINAS EN EQUINOS TRATAMIENTO IDENTIFICACIÓN EJEMPLAR SEXO DIETA DÍA MEDICACIÓN Y VÍA DE ADMINISTRACIÓN 1 17 H 18 H 20 H 3 KGR. DE CONCENTRADO + HENO A VOLUNTAD NO H 22 H 37 H 38 H 39 H 40 H 41 M 31 H HENO A VOLUNTAD 3 KGR. DE CONCENTRADO + 3 KGR. DE ALFALFA + HENO A VOLUNTAD 32 H 3 KGR. DE CONCENTRADO + CAFEÍNA - 1,6 Gramos (SONDA NASO GÁSTRICA) 33 M HENO A VOLUNTAD CAFEÍNA - 1,0 Gramo (SUBCUTÁNEO) 34 H NO NO TEOFILINA - 6,72 Gramos (INTRAVENOSO) TEOFILINA - 3,75 Gramos (ORAL)
14 ANIMALES MATERIALES
15 MEDICAMENTOS MATERIALES TEOFILINA: AMINOFILINA CAFEÍNA: CARDIOTÓN
16 DIETA HENO MATERIALES CONCENTRADO ALFALFA PELETIZADA
17 TOMA DE MUESTRAS MATERIALES
18 RESULTADOS METILXANTINAS EN EL ALIMENTO UTILIZADO EN EL ENSAYO ALFALFA Cafeína 6,66 mg/kg 6660 µg/kg Teobromina <0,5 mg/kg < 500 µg/kg Teofilina <0,5 mg/kg < 500 µg/kg HENO Cafeína 7,79 mg/kg 7790 µg/kg Teobromina <0,5 mg/kg < 500 µg/kg Teofilina <0,5 mg/kg < 500 µg/kg CONCENTRADO Cafeína 2,27 mg/kg 2270 µg/kg Teobromina 9,55 mg/kg 9550 µg/kg Teofilina <0,5 mg/kg <500 µg/kg
19 ESPERADOS RESULTADOS Hipótesis: El consumo continuo de alimento (alfalfa, concentrado, heno) que contiene metilxantinas puede generar un nivel estacionario de la concentración sanguínea de las mismas; la concentración así generada puede ser detectada mediante pruebas analíticas como MS-GC.
20 REPORTE RESULTADOS
21 RESULTADOS METILXANTINAS EN SUERO DE LOS EQUINOS UTILIZADOS EN EL ENSAYO DÍA O DÍA 1 DÍA 2 DÍA 3 DÍA 4 DÍA 5 TRATAMIENTO PESEBRERA MEDICACIÓN HORA TOMA MUESTRA RESULTADO HORA TOMA (Teof/Caf) ng/ml MUESTRA RESULTADO HORA TOMA (Teof/Caf) ng/ml MUESTRA RESULTADO (Teof/Caf) ng/ ml HORA TOMA MUESTRA RESULTADO (Teof/Caf) ng/ ml HORA TOMA MUESTRA RESULTADO (Teof/Caf) ng/ ml HORA TOMA MUESTRA RESULTADO (Teof/Caf) ng/ ml 1.1 CONCENTRADO + HENO 1.2 HENO 17 20:32 179/649 14:52 <100/<100 12:45 <100/<100 12:37 <100/<100 12:35 <100/<100 12:28 <100/< NO 20:36 <100 14:45 <100/<100 12:37 <100/130 12:30 <100/<100 12:25 <100/<100 12:22 <100/< :42 <100 14:40 <100/<100 12:22 <100/<100 12:25 <100/<100 12:20 <100/<100 12:17 <100/< :46 <100 14:37 <100/<100 12:15 <100/<100 12:17 <100/<100 12:15 <100/<100 12:12 <100/<100 NO 22 20:52 <100 14:30 <100/<100 12:30 <100/<100 12:12 <100/<100 12:10 <100/<100 12:05 <100/<100 2 CONCENTRADO + ALFALFA + HENO NO 19:50 <100 15:20 <100/<100 11:30 <100/<100 11:35 <100/<100 11:30 <100/<100 11:30 <100/<100 19:42 <100 15:15 <100/<100 11:35 <100/<100 11:45 <100/<100 11:37 <100/<100 11:40 <100/<100 19:30 <100 15:10 <100/<100 11:45 <100/<100 11:51 <100/<100 11:45 <100/<100 11:42 <100/<100 19:20 351/997 15:05 100/<100 12:00 <100/<100 11:59 <100/<100 11:50 <100/<100 11:47 <100/<100 19:10 <100 14:50 <100/<100 12:05 <100/<100 12:05 <100/<100 11:55 <100/<100 11:55 <100/<100 RESULTADO (Teof/Caf) ng/ml RESULTADO (Teof/Caf) µg/ml 179/649 0,179/0,649 <100 <0,100 <100 <0,100 <100 <0,100 <100 <0,100 <100 <0,100 <100 <0,100 <100 <0, /997 0,351/0, 997 <100 <0,100
22 GRUPO DE CONTROL POSITIVO RESULTADOS ENSAYO METILXANTINAS EN EQUINOS RESULTADOS GRUPO MEDICADO DÍA O DÍA 1 DÍA 2 DÍA 3 DÍA 4 DÍA 5 TRA/TO IDENTIF. EJEMPLAR MEDICACIÓN HORA TOMA MUESTRA RESULTADO (Teof/Caf) ng/ml HORA MEDICACIÓN HORA TOMA MUESTRA RESULTADO (Teof/Caf) ng/ ml HORA TOMA MUESTRA RESULTADO (Teof/Caf) ng/ ml HORA TOMA MUESTRA RESULTADO (Teof/Caf) ng/ ml HORA TOMA MUESTRA RESULTADO (Teof/Caf) ng/ ml HORA TOMA MUESTRA RESULTADO (Teof/Caf) ng/ ml HORA TOMA MUESTRA RESULTADO (Teof/Caf) ng/ ml HORA TOMA MUESTRA RESULTADO (Teof/Caf) ng/ ml 31 TEOFILINA (INTRAVENOSA) 20:25 <100 7:12 8: /100 14: /<100 22: /<100 11: /<100 11:00 757/<100 11:00 208/<100 11:00 199/<100 3 CONCENTR. + HENO CAFEÍNA (ORAL) CAFEÍNA (SUBCUTÁNEO) 20:18 <100 7:05 8:35 200/ :25 606/ :05 624/ :05 529/ :07 185/<100 11:10 <100/<100 11:06 <100/<100 20:12 <100 7:00 8:20 <100/417 14:15 373/ :10 284/ :10 344/ :12 100/<100 11:15 <100/<100 11:15 <100/< TEOFILINA (ORAL) 19:50 <100 6:45 8: /<100 14: /<100 22: /<100 11: /178 11: /<100 11:22 656/<100 11:21 211/<100 NOTA: RESULTADOS DE TEOFILINA/CAFEINA (Teof/Caf), DADOS EN NANOGRAMOS/MILILITRO (ng/ml)
23 GRUPO DE CONTROL POSITIVO RESULTADOS Vía Oral Cafeína CAFEINA ng/ml TEOFILINA ng/ml DIA 0 < 100 < 100 DIA 1: 8: DIA 1: 14: DIA 1: 22: DIA DIA 3 < DIA 4 < 100 < 100 DIA 5 < 100 < 100
24 GRUPO DE CONTROL POSITIVO RESULTADOS Cafeína Vía Subcutánea CAFEINA ng/ml TEOFILINA ng/ml DIA 0 < 100 < 100 DIA 1: 8: < 100 DIA 1: 14: DIA 1: 22: DIA DIA 3 < 100 < 100 DIA 4 < 100 < 100 DIA 5 < 100 < 100 ORAL Dosis: 4 mg/kg CAFEINA ng/ml SC Dosis: 2.5 mg/kg CAFEINA ng/ml DIA 0 < 100 < 100 DIA 1: 8: DIA 1: 14: DIA 1: 22: DIA DIA 3 < 100 < 100 DIA 4 < 100 < 100 DIA 5 < 100 < 100 Teofilina ORAL Dosis: 4 mg/kg TEOFILINA ng/ml SC Dosis: 2.5 mg/kg TEOFILINA ng/ml < 100 < < < 100 < 100 < 100 < 100 < 100
25 GRUPO DE CONTROL POSITIVO RESULTADOS Teofilina ORAL 10 mg/kg TEOFILINA TEOFILINA ng/ml ng/ml DIA 0 <100 <100 DIA 1: 8: DIA 1: 14: DIA 1: 22: DIA DIA DIA DIA INTRAVENOSA 15 mg/kg International Reference
26 RESULTADOS CANTIDAD DE CAFEÍNA CONSUMIDA POR DÍA EN LOS ANIMALES DEL GRUPO 2: 3 kg de ALFALFA: 19,98 mg Dosis: para un animal de 300 kg: 0,066 mg/kg/pv Concentración proyectada en sangre a las 24 h:. Biodisponibilidad: 40% ng/ml 0,015-0,020 µg/ml
27 CONCLUSIONES Los resultados de los análisis de las muestras de los alimentos (alfalfa, concentrado, heno) demuestran la presencia de cafeína y teobromina en los productos comerciales. Los resultados obtenidos con la técnica analítica utilizada por el laboratorio CROM MASS la Universidad Industrial de Santander (UIS) en los animales que consumieron alfalfa/concentrado durante cinco (5) días consecutivos, se ubicaron por debajo del límite de cuantificación (NMC: Nivel mínimo de cuantificación: 100 ng/ml). Los resultados de los análisis de las muestras de caballos que recibieron los medicamentos con cafeína/teofilina concuerdan con los reportes de la literatura internacional.
28 CONCLUSIONES Si se administran medicamentos de uso veterinario o de uso humano que contienen como ingredientes activos la cafeína o la teofilina (aminofilina), los niveles que se hallarán en sangre se ubicarán por encima de un NMC (Nivel Mínimo de Cuantificación) de 100 ng/ml durante 1 a 5 días. Estudios realizados en otros países, demuestran que los niveles de cafeína y teobromina que pueden encontrarse rutinariamente en alfalfa peletizada y alimentos concentrados para equinos, no generan concentraciones sanguíneas asociadas con estimulación motora (4000 ng/ml = 4 µg/ml) o cambios del comportamiento de los animales (2000 ng/ml = 2 µg/ml). A futuro, la Federación continuará investigando sobre el efecto de la Teofilina y otras sustancias, en la estimulación motora de los Caballos Criollos Colombianos de Paso.
29 Supervisión del Estudio Funcionarios ICA Labotarorios Laboratorio de Cromatografía y Espectometría de Masas Universidad Industrial de Santander Lugar Criadero San pablo Ejercito Nacional
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