Incidencia de los Virus en la Producción de Ajo y su Control

Transcripción

1 Incidencia de los Virus en la Producción de Ajo y su Control Ajo Los virus de ajo han sido los responsable de pérdidas en los rendimientos que llegan hasta un 70%. El Instituto de Fitopatología y Fisiología Vegetal del INTA ha trabajado desde su inicio en el control de esta enfermedad a través de la identificación y caracterización de los virus, producción de reactivos de diagnóstico y en la obtención de plantas libres de virus Dra. Vilma Conci, Ing. Agr. Eva Cafrune, Biól. Pablo Lunello, Ana Canavelli, Ing. Agr. Sergio Nome, Roxana Bracamonte, Patricia Alochis y Biól. Cecilia Perotto, IFFIVE - INTA, Córdoba. Dado que el ajo se propaga vegetativamente, la difusión de material infectado con patógenos sistémicos, como los virus, es muy alta. Estos patógenos se perpetúan en las generaciones siguientes y si bien no causan la muerte de la planta, producen infecciones crónicas que ocasionan severas reducciones en los rendimientos. Debido a la forma de multiplicación de la especie (por bulbillos) no existe ajo naturalmente libre de virus; todas las plantas están contaminadas por una mezcla de diferentes especies virales formando un complejo. Los virus de ajo han sido detectados en todas las áreas productoras del mundo. Su identificación y la producción de los correspondientes reactivos para detectarlos adquieren importancia fundamental ya que a partir de 1994 han comenzado a regir en la Argentina normas para la fiscalización de semilla de ajo. Estas normas contemplan la detección de virus, con porcentajes diferentes según la categoría, medida que también se está incorporado en las legislaciones de otros países. Desde hace muchos años se conoce la presencia en este cultivo de virus transmitidos por pulgones (áfidos) principalmente pertenecientes a los géneros Potyvirus y Carlavirus. Dentro de los Potyvirus se ha detectado el Onion yellow dwarf virus (OYDV) en ajo y en cebolla, que probablemente sea el virus más importante del complejo debido a los graves daños que causa en la producción. El OYDV se encuentra ampliamente distribuido, se han detectado niveles de infección del 52% en plantas prove- Ensayo comparativo de rendimiento mostrando plantas libres de virus (derecha) y plantas infectadas con virus (izquierda). idiaxxi 55

2 Bulbos ajo Blanco libres de virus (arriba) y bulbos de plantas infectadas con virus (abajo). Planta de ajo libre de virus in vitro. nientes de Europa y del 86% de Asia. En la Argentina, el OYDV fue reportado en cebolla y ajo. Actualmente es poco frecuente en cebolla, pero en ajo está muy difundido, infectando todas las áreas productoras del país en porcentajes que varían entre el 33 y 100%. El Leek yellow stripe virus (LYSV) ha sido detectado en todos los países donde se han estudiado los virus de ajo. En nuestro país fue encontrado en ajo y en puerro y se identificaron 7 especies de pulgones como vectores, su presencia ha sido confirmada en todas las regiones productoras del país. Dentro de los Carlavirus, también transmitidos por pulgones, fueron identificados el Shallot latent virus (SLV), descrito en chalote y posteriormente señalado en ajo, y el Garlic common latent virus (GCLV). Por otro lado, se ha detectado que gran parte de los virus que infectan al ajo son transmitidos por ácaros; ellos integran un nuevo grupo de virus de plantas denominado Allexivirus y fueron identificados con letras, Garlic virus-a, B, C, D, E, X (GarV-A, B, C, D, E, X). En Argentina, se detectó la presencia de GarV-A y se produjo antisuero a partir de proteína de la cápside del virus expresada en bacteria. El IFFIVE-INTA, con financiamiento de CONICET, SEPCyT y la Agencia Córdoba Ciencia, trabaja en la caracterización de los virus de ajo, producción de reactivos de diagnóstico, estudios de incidencia de los virus en la producción, obtención de plantas libres de virus, y control. INCIDENCIA DE LOS VIRUS EN EL RENDIMIENTO Se estudió el efecto de los distintos virus en el rendimiento de ajo Rosado Paraguayo y ajo Blanco. En ajo Rosado Paraguayo, en 2 años de ensayos a campo se detectó que los bulbos producidos por las plantas infectadas con la mezcla de virus son 43-53% menos pesados que aquellos provenientes de plantas libres de virus; por otra parte, cuando están infectadas solo con OYDV produce una disminución en el peso del bulbo de 24-39%. Además, pudo comprobarse una correlación entre concentración de virus y producción. Se comprobó que en las plantas donde se detectó la mayor concentración de virus, el peso y perímetro de los bulbos fue menor. Las plantas libres de virus produjeron altos porcentajes de bulbos grandes (82%) y pocos bulbos pequeños (menos del 7%). Las plantas infectadas con el complejo de virus obtuvieron en su mayoría bulbos pequeños (63%) y no más del 11% de los bulbos grandes. En ajo Blanco se evaluó el efecto de la mezcla de virus respecto a plantas libres de virus, así como el efecto de los dos virus por separado (OYDV y LYSV). Se realizaron diferentes ensayos que fueron repetidos durante dos y tres ciclos de 56 idiaxxi

3 Minibulbillo de ajo. rendimientos entre 58 y 68% en el peso de los bulbos y entre 24 y 31% en el perímetro. Las plantas infectadas con este virus produjeron los mayores porcentajes de bulbos pequeños en los años estudiados (38 y 36%). PRODUCCIÓN DE PLANTAS LIBRES DE VIRUS Desde hace mucho tiempo el Instituto de Fitopatología y Fisiología Vegetal del INTA trabaja en la producción de plantas de ajo libres de virus a través de termoterapia y/o cultivo de meristemas. El proceso incluye varios pasos que se han ido perfeccionando conforme avanzan las investigaciones sobre el tema. cultivo y permitieron obtener los siguientes resultados. - Las plantas libres de virus emergieron más rápido y en mayor porcentaje que las plantas infectadas. A los 30 días de la siembra, entre el 70 y el 73% de las plantas sanas habían emergido mientras que las plantas enfermas con la mezcla de virus solo lo hicieron entre el 32 y 37%. - Las plantas sanas duplicaron la altura (26-30 cm) de las plantas enfermas con la mezcla de virus (12-18 cm). - Las infectadas con la mezcla de virus provocaron disminuciones en el peso de los bulbos variables entre 39 y 69% y entre el 18 y 33 % en el perímetro. - Las plantas sanas produjeron en su mayoría bulbos grandes (54-70%) y las infectadas con la mezcla de virus produjeron bajos porcentajes de bulbos grandes (11-25%). - El LYSV causó una disminución del 13% en la altura de las plantas con respecto a las sanas. Este virus produjo una disminución en el peso de los bulbos que varió entre 0 y 36% y en el perímetro entre 0 y 13%, dependiendo del año de cultivo y del tamaño de diente sembrado. Los dientes más chicos mostraron las mayores diferencias. - El OYDV, ocasionó reducciones en los La producción de plantas libres de virus es una tarea larga y costosa, por lo tanto es indispensable trabajar a partir de material seleccionado de acuerdo con sus características agronómicas. En general, se liberan de virus cultivares o selecciones clonales realizadas por las Estaciones Experimentales Agropecuarias La Consulta y San Juan del INTA y materiales elegidos por productores que solicitan su liberación. Se escogen los mejores bulbos y estos son mantenidos en ambientes fresco y seco hasta comenzar con el proceso. TERMOTERAPIA Las altas temperaturas afectan a los virus retardando la infección. De acuerdo con este principio, en muchos casos resulta muy eficiente la aplicación de un período de altas temperaturas antes de la extracción de los meristemas para obtener mayor porcentaje de plantas libres de virus. En este caso, el material que será liberado de virus es sometido a un tratamiento de termoterapia de días a 36º C. Los avances obtenidos en los últimos años respecto a cada uno de los diferentes virus que infectan el ajo y las pruebas de termoterapia realizadas con diferentes cultivares han permitido observar que la respuesta a la liberación de virus es variable. Por ejemplo, se ha detectado que los Potyvirus en la mayoría de los cultivares son fácilmente liberados empleando solamente cultivo de meristema. En ese caso no es necesario aplicar previamente termoterapia. Por otra parte, en muchos cultivares la liberación de Allexivirus ha sido más efectivo aplicando un período de termoterapia. Para una producción más eficiente de plantas libres de virus es nece- idiaxxi 57

4 Multiplicación de plantas de ajo libres de virus en jaula antiafidos. sario hacer un ajuste del protocolo conforme a los virus que se pretendan eliminar y al cultivar con el cual se esté trabajando. Con la ayuda de lupa y de instrumental estéril, bajo cámara de flujo laminar, se extrae el domo meristemático más un primórdio foliar. Este explanto es sembrado en medio de cultivo adecuado y mantenido en condiciones ambientales que permitan el desarrollo de una planta in vitro. Cada meristema es identificado con un número que se mantiene para hacer el seguimiento de todas las plantas que se generen a partir de ese meristema (clon). En esta etapa, el desarrollo de plantas se ve influenciado por el empleo o no de la termoterapia realizada previamente. Los explantos provenientes de plantas sometidas a tratamiento de calor con frecuencia no desarrollan plantas. Considerando varios cultivares de ajo diferentes se ha obtenido un 55-57% de plantas desarrolladas cuando provienen de termoterapia. Cuando no se aplica termoterapia previa a la extracción de meristemas, se ha obtenido un número mayor de plantas desarrolladas (80-90%). MICROPROPAGACIÓN Las plantas desarrolladas in vitro son transferidas a un medio de micropropagación para su multiplicación ellas son mantenidas en estas condiciones hasta obtener el número de plantas deseadas, efectuando repiques a medio fresco cada 6-8 semanas. La tasa de multiplicación varía entre 1/6 y 1/2, dependiendo de los cultivares y del tiempo de permanencia bajo las condiciones in vitro. Se ha podido detectar que la multiplicación no es homogénea para todos los clones, algunos de ellos multiplican mucho y otros lo hacen en escasa cantidad. Por otra parte se ha comprobado que la tasa de multiplicación varía con el número de repiques en el medio de multiplicación, siendo baja en los primeros y aumentando a partir del segundo o tercer repique a medio fresco. RUSTICACIÓN Y TRANSFERENCIA DE LAS PLANTAS A TIERRA Las plantas libres de virus son multiplicadas in vitro hasta obtener el número deseado, luego se induce la formación de microbulbillos o bien son transferidas a tierra en macetas individuales. Los dientes cosechados pueden ser sembrados directamente en suelo en jaulas con malla antiafidos y multiplicados durante sucesivos ciclos de cultivo. Los bulbos cosechados en estas condiciones son entregados a productores o semilleros para su multiplicación a gran escala en áreas aisladas de cultivos de ajo, para evitar su contaminación. 58 idiaxxi

5 ANÁLISIS DE LAS PLANTAS OBTENIDAS El proceso de liberación de virus a través del cultivo de meristema no es 100% eficiente. Por tal motivo, después de obtener las plantas in vitro es imprescindible realizar minuciosos análisis para cada uno de los virus que permitan detectar cuáles han sido eliminados y que plantas están realmente libres de virus. También hay que considerar que cuando las plantas están in vitro los virus están en muy bajas concentraciones, por lo que es importante utilizar métodos de diagnóstico de alta sensibilidad. En el IFFIVE se utilizan sistemas serológicos combinados con microscopía electrónica (inmuno electro microscopía más decoración, ISEM-D) para realizar los análisis, ya que son los que han ofrecido mayor seguridad debido a su sensibilidad y a la amplia gama de virus que pueden detectar. Se trabaja con antisueros obtenidos a partir de OYDV, LYSV, GCLV, SLV, GarV-A y Mix (de ajos crónicamente enfermos con la mezcla de virus que naturalmente infecta este cultivo) para detectar todos los posibles virus que afectan a esta especie, aun aquellos cuya identidad no ha sido completamente esclarecida. Además, se ha implementado el diagnóstico mediante Inmuno captura seguida de transmisión reversa y reacción en cadena de la polimerasa (IC-RT-PCR) con iniciadores específicos para OYDV, LYSV y GCLV. ESQUEMA ACTUAL DE ANÁLISIS El primer test se realiza a partir de plantas in vitro durante los primeros repiques a medio de micropropagación. Se extrae una porción de tejido para realizar las pruebas, se analiza una planta por clon y se asume el mismo estado sanitario para todo el clon mientras permanece in vitro. Las plantas son probadas mediante ISEM-D con los antisueros mencionados anteriormente. Cuando las plantas son transferidas a tierra, en jaulas antiáfidos, son nuevamente analizadas, una por una, mediante ISEM-D y/o DAS-ELISA. Durante los siguientes ciclos de multiplicación en jaulas o a campo, en áreas aisladas de otros cultivos de ajo, se realizan análisis periódicos mediante DAS- ELISA. Una vez obtenidas las plantas sanas in vitro (plantas madres) deben ser transferidas nuevamente a tierra y luego multiplicadas durante varios ciclos de cultivo hasta obtener el número suficiente de dientes como para iniciar una producción comercial de ajo. Las diferencias en los rendimientos son muy importantes respecto a las plantas infectadas, sin embargo cuando son sembradas próximas a plantas infectadas, se ha detectado entre 87 y 100% de plantas contaminadas con OYDV y entre 62 y 87% con LYSV en el primer ciclo de cultivo. A pesar de ello, el rendimiento de las plantas libres de virus fue considerablemente mayor, como se explicó anteriormente. En este proceso es importante conocer cuánto tiempo mantienen sus altos niveles de rendimientos las plantas reinfectadas. En ensayos realizados en el IFFIVE durante 5 años de cultivo se observó una disminución progresiva de los rendimientos en función del tiempo en que las plantas son sacadas al campo y expuestas a condiciones de infección. Se detectó una importante caída en los rendimientos hasta el 3º año; en el 4º y 5º año la pérdida en el peso y perímetro de los bulbos respecto al 3º año no fue tan marcada. Los rendimientos obtenidos después de 5 años no disminuyeron a los valores de las plantas crónicamente enfermas, registrándose todavía un 33% de diferencia en el peso de los bulbos respecto a las plantas que nunca habían sido liberadas de virus (Fig. 1). Con los resultados obtenidos podemos confirmar que el rendimiento de las plantas de ajo, cuando se infectan con distintos virus, va disminuyendo año a año hasta alcanzar los valores de las plantas crónicamente enfermas que, según los resultados obtenidos, va más allá de los cinco años. Es importante considerar que la pendiente de la curva de caída en los rendimientos depende del grado de contaminación del cultivo. Si las plantas no son sometidas a altas presiones de infección, como ocurrió en el ensayo realizado, los altos niveles de producción pueden ser mantenidos por más tiempo. idiaxxi 59

6 Fig 1. Curvas de caída del peso (izq) y perímetro (der) de las cabezas de ajo según el número de años de exposición a la infección viral, respecto a bulbos de plantas crónicamente enfermas Bibliografía Conci, V.C Virus y fitoplasmas de ajo. En Burba, J. L. 50 temas sobre producción de ajo. Vol. 3, pp EEA-INTA La Consulta, Mendoza, Argentina. Conci, V.C. y Nome, S.F Virus Free Garlic (Allium sativum L.) Plants Obtained by Thermotherapy and Meristem Tip Culture. Journal of Phytopathology. 132: Lunello, P., Perotto, C, Nome, S. y Conci V Efecto del Leek yellow stripe virus (LYSV) y del complejo viral en el cultivo de ajo. Fitopatología Brasilera 26 (suplemento): 541. Van Dijk, P Carlavirus isolates from cultivated Allium species represent three viruses. Neth. J. Pl. Path. 99: Van Dijk, P Survey and characterization of potyviruses and their strains of Allium species".neth. J. Pl. Path. 99. Supplement 2: idiaxxi