Cátedra de Química Biológica 2009 HORMONAS: Aspectos moleculares

Transcripción

1 Cátedra de Química Biológica 2009 HORMONAS: Aspectos moleculares Mecanismos de comunicación y regulación del funcionamiento de células y organismos. Sistemas de comunicación. Sistema endocrino. HORMONAS Tipos de acciones promovidas por las hormonas. RECEPTORES. o Intracelulares o De membrana plasmática. Rc asociados a proteínas G. Rc proteína-tirosina quinasa. Rc ligados a otras actividades enzimáticas. SISTEMA DE TRANSMISIÓN DE SEÑALES o AMP-3,5 cíclico. o Fosfatidilinositolbifosfato o Señal del calcio. o Ras y quinasas MAP o JAK_STAT INSULINA Mecanismo de acción. Acciones de la insulina en la regulación de la síntesis y degradación del glucógeno. 1

2 HORMONAS: ASPECTOS MOLECULARES MECANISMOS DE COMUNICACIÓN Y REGULACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE CÉLULAS Y ORGANISMOS ORGANISMOS UNICELULARES Modulación de la Actividad Enzimática (Activadores o Inhibidores) Efectos alostéricos Regulación de Síntesis de proteínas Expresión Genética Inductores o represores ORGANISMOS PLURICELULARES Órganos y tejidos con la necesidad de disponer de sistemas de comunicación Nervioso Red de comunicaciones rápidas que conecta e interrelaciona los diversos componentes del organismo. Actúa por liberación de neurotransmisores en los terminales sinápticos. Endócrino Formado por glándulas en distintos tejidos que elaboran y secretan productos activos (hormonas) que se vierten a la circulación en respuesta a estímulos específicos. Vehiculizados por la sangre, alcanzan tejidos, donde provocan un efecto determinado. Sistemas de Comunicación Sistema Neuroendócrino. Una región del cerebro, el hipotálamo, produce factores que controlan la secreción de hormonas en la hipófisis anterior y también oxitocina y vasopresina, liberadas en la hipófisis posterior, con efectos sobre glándula mamaria y riñón respectivamente. La médula adrenal vierte en la sangre adrenalina y noradrenalina, agentes que también actúan como neurotransmisores. Estas interrelaciones, entre otras, nos permiten hablar de la existencia de un sistema neuroendócrino. Para completar la integración debe tenerse en cuenta la relación con el sistema inmunitario. Las células integrantes de este sistema secretan citoquinas que influyen sobre las funciones neuroendócrinas y viceversa. Por esta razón, en los sistemas biológicos de comunicación e integración es posible reunir en la misma categoría de mediadores químicos a hormonas, factores de crecimiento, neurotransmisores y citoquinas. Otros Mecanismos de Comunicación A) Parácrinos: secretan sustancias que actúan sobre sus vecinos. Ejemplos: eicosanoides, factores de crecimiento y citoquinas. B) Autócrinos: secretan sustancias que actúan sobre la misma célula. 2

3 La modulación de la actividad de enzimas por medio de efectores alostéricos y la regulación de la síntesis de proteínas a través de inductores y represores son procesos aptos para asegurar el funcionamiento de los sistemas metabólicos en organismos unicelulares. Pero esto no es suficiente en los pluricelulares, los niveles de organización, la complejidad estructural, el desarrollo de órganos y tejidos altamente diferenciados, lleva a la necesidad de disponer de sistemas de comunicación que puedan adaptar la actividad de cada célula a las necesidades del organismo y promover su funcionamiento como una unidad integrada. Esta misión esta a cargo de los sistemas nervioso y endocrino. El sistema nervioso cumple la función de una red de comunicaciones rápidas que conecta e interrelaciona los diversos componentes del organismo. El sistema endocrino está constituido por una gran diversidad de células, agrupadas en glándulas discretas o dispersas en distintos tejidos, que elaboran o secretan productos activos. En muchos casos estos productos denominados HORMONAS, se vierten en la circulación en respuesta a estímulos específicos. Vehiculizadas a la sangre, las hormonas alcanzan los tejidos blanco ó diana en los cuales provocan un efecto determinado. Este concepto clásico de hormona debe ser ampliado. También se secretan sustancias que no llegan a la sangre; actúan sobre la misma célula de origen (mecanismos autócrinos) o sobre células contiguas (mecanismos paracrinos). En esta presentación mencionaremos los mecanismos más importantes que utilizan las células para comunicarse y explicaremos la forma en que envían señales e interpretan las señales que reciben. Si bien nos concentraremos el los mecanismos de recepción e interpretación de señales de la célula animal y específicamente las del sistema endocrino, también efectuaremos una reseña de lo que conocemos acerca de las vías de señalización de las células vegetales. Principios generales de la señalización celular: La información puede transmitirse de diversas maneras y con frecuencia la comunicación implica la conversión de señales de información de una en otra. Los puntos críticos de esta transmisión se producen cuando el mensaje se convierte de una forma en otra. Este proceso de conversión se denomina transducción de la señal. En la mayor parte de esta presentación nos dedicaremos a analizar la recepción y la transducción de señales, que son los dos fenómenos a los que se refieren los biólogos celulares cuando hablan de señalización celular. Sin embargo, en primer lugar consideraremos brevemente los distintos tipos de señales que se envían las células entre sí. Las señales pueden actuar a distancias largas o cortas. Los organismos pluricelulares mantienen cuatro formas de comunicación celular: En los organismos pluricelulares, el modo de comunicación más usual consiste en la emisión de la señal a todo el cuerpo por medio de la secreción de moléculas señalizadoras en el torrente sanguíneo (en el caso de los animales) o en la savia (en el caso de los vegetales). Las moléculas señalizadoras que se utilizan en este tipo de comunicación son las hormonas y en los animales las células que producen las hormonas se denominan células endocrinas. Este tipo de células forma tejidos especializados denominados glándulas endocrinas. Por ejemplo, parte del páncreas en una glándula que produce la hormona insulina, esta regula la captación de glucosa en las células de todo el cuerpo. 3

4 El proceso conocido como señalización parácrina es menos común. En este caso las moléculas señalizadoras se difunden en forma local a través del medio extracelular y permanecen en las zonas cercanas a la célula que la secreta. Así actúan como mediadores locales sobre las células vecinas. Por ejemplo: moléculas como la histamina que contribuyen a la inflamación en el sitio de una infección. O moléculas que controlan la proliferación celular como el (PDGF) factor de crecimiento derivado de las plaquetas, actúa durante la cicatrización de las heridas. Neuronal Al igual que las células endocrinas, las neuronas pueden enviar mensajes a través de largas distancias. Sin embargo, en el caso de la señalización neuronal, el mensaje no se emite en forma amplia sino que se envía de manera rápida y específica a células diana individuales a través de líneas privadas. Las células nerviosas tienen una prolongación denominada axón que termina en uniones especializadas llamadas sinapsis sobre células diana que pueden estar alejadas del cuerpo celular. Por ejemplo: Los axones que conecta la medula espinal con el dedo gordo del pie, pueden tener más de un metro de longitud. Al ser activada por señales del entorno o de otras células nerviosas la neurona envía impulsos eléctricos a lo largo de su axón a velocidades de hasta 100m/seg. Al llegar a la terminación del axón estas señales eléctricas se convierten en señales químicas: cada impulso eléctrico estimula a la terminación nerviosa que libera un pulso de una señal química extracelular llamada neurotransmisor (acetilcolina). Luego estos neurotransmisores atraviesan el estrecho (< 100 mm) espacio existente entre la membrana de la terminación del axón y la membrana de la célula diana en menos de 1 mseg. Esta forma de comunicación intracelular mediada por señales la más intima y la más cercana de todas no requiere de liberación de una molécula secretada. Las células entran contacto directo a través de moléculas señalizadotas alojadas en sus membranas plasmáticas. El mensaje se envía cuando una molécula señalizadota anclada en la membrana plasmática de una célula emisora se una a una molécula receptora ubicada en la membrana plasmática de la célula diana. Durante el desarrollo embrionario, por ejemplo, esa señalización dependiente del contacto es importante en los tejidos en los cuales las células adyacentes que al comienzo son similares se especializan de diversas maneras. 4

5 Para la señalización endocrina, paracrina y neuronal se utilizan muchas moléculas señalizadoras del mismo tipo. Las principales diferencias radican es la velocidad y en la selectividad con que se envían las señales a sus dianas. 5

6 SISTEMAS de COMUNICACIÓN CONSIDERACIONES GENERALES RECEPTORES La recepción de la señal comienza cuando una señal originada en el exterior de la célula diana encuentra una molécula diana perteneciente a esa célula. En casi todos los casos la molécula diana es una proteína receptora o un receptor y cada receptor se activa por un solo tipo de señal. La proteína receptora realiza el primer paso de la transducción: recibe una señal externa y genera como respuesta una nueva señal intracelular. Como regla este es solo el primer paso de una cadena de procesos intracelulares de transducción de la señal. Las moléculas de señalización extracelular se unen a receptores de superficie o bien a enzimas o receptores intracelulares. Algunas moléculas señalizadotas hidrófobas pequeñas, en cambio, se difunden a través de la membrana plasmática de la célula diana y activan enzimas o se unen a receptores intracelulares, en el citosol o en el núcleo. La mayoría de las moléculas de señalización son grandes e hidrófilas y por ende no pueden atravesar la membrana plasmática directamente; en lugar de ello se unen a receptores de superficie, los que a su vez generan una o más señales dentro de la célula diana. En este caso, hay tres clases principales de receptores de superficie celular. Receptor asociado con canales iónicos. Receptores asociados con proteínas G. Receptores asociados con enzimas. 6

7 SISTEMA ENDOCRINO CONSIDERACIONES GENERALES Está constituido por una gran diversidad de células, agrupadas en glándulas discretas o dispersas en distintos tejidos, que elaboran y secretan productos activos. En muchos casos estos productos, denominados HORMONAS, se vierten a la circulación en respuesta estímulos específicos. Vehiculizados por la sangre, las hormonas alcanzan los tejidos blanco o diana en los cuales provocan un efecto determinado. Este concepto clásico de hormona debe ser ampliado. También se secretan sustancias que no llegan a la sangre; actúan sobre la misma célula de origen (mecanismos autocrinos) o sobre células contiguas (mecanismos paracrinos) NATURALEZA QUÍMICA DE LAS HORMONAS: Esteroides: Glucocorticoides de corteza suprarrenal. Aldosterona de corteza suprarrenal. Andrógenos de corteza suprarrenal. Estrógenos y progesterona del ovario. Testosterona del testículo. 1,2,5-dihidroxi-D 3 metabolito activo de la vitamina D 3. Derivados de Aminoácidos: Adrenalina o Epinefrina de la médula suprtearrenal. Noradrenalina o Norepinefrina de la médula suprtearrenal. Tiroxina y Triyodotironina de tiroides. Melatonina de la glándula pineal. Derivados de ácidos grasos poliinsaturados ( llamados eicosanoides). Prostaglandinas Tromboxanos Leucotruienos Péptidos. Factores reguladores del hipotálamo. Vasopresina del hipotálamo. Oxitocina del hipotálamo. Adenocorticotrofina (ACTH) de adenohipófisis. Melanosito estimulante (MSH) de adenohipófisis. Glucagón del páncreas, Gastrina, Secretina y otras del tracto gastrointestinal. Pancreozinina Calcitonina de tiroides. Proteínas Paratiroidea Insulina del páncreas. Prolactina (PR) Foliculoestimulante (FSH) Luteinizante (LH) ó estimulante de células intersticiales (ICSH) Hormona de Crecimiento (GH) Tirotrófica (TSH) 7

8 TIPOS DE ACCIONES PROMOVIDAS POR HORMONAS: Acción sobre mecanismos de transporte en membranas celulares: algunas hormonas modifican el flujo de metabolitos o iones a través de membranas por su acción sobre sistemas de transporte o canales iónicos. Modificación de la actividad enzimática: se observan cambios en la actividad de determinadas enzimas, esta acción es rápida y de carácter transitorio. Se ejerce principalmente a nivel de enzimas regulatorias cuya actividad es aumentada o disminuida por modificación covalente. Acción sobre la síntesis de proteínas: Muchas hormonas modulan la síntesis de enzimas y otras proteínas. Actúan predominantemente a nivel del ADN nuclear, regulando el proceso de transcripción génica. La misma hormona puede poner en marcha más de uno de los mecanismos señalados. Por ejemplo la insulina favorece el transporte de determinados metabolitos a través de membrana, modifica la actividad de enzimas y también la síntesis de proteínas. 8

9 PROPIEDADES GENERALES DE LAS HORMONAS Actividad. Las hormonas actúan en concentraciones muy pequeñas. Por ejemplo hormonas proteicas alcanzan concentraciones en el plasma de y M, mientras que hormonas esterioideas 10-9 y 10-6 M. Vida media. Debido a su actividad debe ser degradada en productos inactivos. El tiempo promedio de duración puede variar de segundos a días. Velocidad y ritmo de secreción. En general el ritmo de secreción no es un proceso uniforme y sostenido. Responde a estímulos ambientales o del medio interno. Por ejemplo la liberación de insulina es promovida por incrementos de la concentración de glucosa en sangre. Las hormonas sexuales presentan ciclos. Las esteroideas de la corteza adrenal cada 24horas (variaciones circadianas). Especificidad. Es una de las propiedades más importante de las hormonas, su gran especificidad de acción. Solo actúa sobre las células que constituyen su blanco, objetivo ó diana.la hormona es vertida a la circulación general y alcanza a todos los tejidos; sin embargo, su acción se ejerce unicamente a nivel de un número limitado de células, en las cuales provoca un efecto definido de respuesta. Esta especificidad indica la existencia de un mecanismo por el cuál la hormona reconoce a sus células efectoras. RECEPTORES La especificidad de las hormonas y su capacidad para identificar el blanco son posibles gracias a la presencia de receptores en las células efectoras. Estos receptores son macromoléculas o asociaciones macromoleculares a las cuales la hormona se fija selectivamente en virtud de una estrecha adaptación conformacional o complementariedad estructural. La Hormona (H) y su receptor (R) forman un complejo (HR) que presenta las siguientes características destacables: Adaptación inducida. La fijación de la hormona al receptor implica una adaptación estructural recíproca de ambas moléculas. Saturabilidad. El número de receptores en una célula es limitado y presenta una cinética hiperbólica del tipo enzima-sustrato, visualizando la saturabilidad. Reversibilidad. La unión de hormona-receptor es reversible. Localización de los receptores. Los receptores pueden estar ubicados en el interior de la célula o en la membrana externa. El tipo de receptor dependerá en la mayoría de los casos a la naturaleza química de la hormona, se estás son poco polares y atraviesan con facilidad las membranas se unirán a receptores intracelulares. Las de naturaleza proteica o peptídica y las moléculas pequeñas pero francamente polares se fijan a receptores de superficie de membrana. Número de receptores. El número de receptores de superficie puede variar entre a La cantidad de receptores intracelulares es mucho menor. Generalmente el 20% de los receptores están ocupados cuando se ejerce una respuesta máxima. El resto de los receptores son los llamados de reserva. 9

10 RECEPTORES INTRACELULARES Las hormonas esteroides, tiroideas, ácido retinoico y metabolitos activos de la Vitamina D 3, poco polares ingresan a través de las membranas de todas las células y son retenidas en aquellas que poseen en su interior receptores específicos. Algunos de los receptores mencionados, especialmente los de los glucocorticoides, pueden hallarse también en el citoplasma. mover Al llegar la hormona, se une con gran afinidad a su receptor específico y desplaza las Hsp. El receptor sufre un cambio conformacional, forma dímeros y se fija a sitios definidos del ADN, llamados elementos de respuesta a hormonas (HRE), generalmente ubicados corriente arriba del promotor del gen Blanco. Los HRE son repeticiones invertidas de segmentos palindrómicos, separados por dos a cinco pares de bases. Desde su lugar de fijación al elemento de respuesta, el complejo hormonareceptor interacciona con factores de transcripción unidos al sitio promotor e influye sobre el complejo de iniciación encargado de ubicar correctamente la RNA polimerasa II y asegura el comienzo de la transcripción. Ejemplo de hormonas hodrofobas: CORTISOL: Afecta el metabolismo de proteínas, los hidratos de carbono y los lípidos de la mayoría de los tejidos. ESTRADIOL: Induce y mantiene los caracteres sexuales secundarios femeninos. TESTOSTERONA: Induce y mantiene los caracteres sexuales secundarios masculinos TIROXINA: Estimula el metabolismo de muchos tipos celulares. Los receptores intracelulares pertenecen a una superfamilia de moléculas estructuralmente homólogas, derivadas de un gen ancestral común. Presentan tres dominios fundamentales: A)Un dominio hipervariable en el extremo N-terminal, una porción de este dominio participa en acciones reguladoras de la transcripción. B) El dominio central, en el cuál se encuentran dedos de zinc capaces de interactuar con secuencias específicas del ADN, en este dominio es donde se encuentran las mayores homologías entre las familias. C) El tercer dominio corresponde al C-Terminal, posee un sitio de unión a la hormona. 10

11 RECEPTORES DE MEMBRANA PLASMATICA: Los receptores de superficie en la membrana plasmática son transmisores de señales al interior de la célula. La llegada de una molécula de hormona, considerada el primer mensajero en el sistema de señales, produce cambios conformacionales en su receptor específico, los cuales son transmitidos a proteínas efectoras (enzimas o canales). Como resultado de la activación de enzimas, en algunos casos se producen moléculas de pequeño tamaño (segundos mensajeros) que difunden rápidamente y hacen más efectiva la propagación de la señal en el interior de la célula. Hormonas diferentes, que actúan en células distintas y suscitan respuestas muy disímiles, suelen utilizar los mismos intermediarios para cumplir su acción. Por esta razón, el repertorio de sistemas transmisores de señales es más redicido que el de hormonas. TIPOS PRINCIPALES DE RECEPTORES DE MEMBRANA 1. Receptores asociados a proteínas G 2. Receptore proteína-tirosina quinasa 3. Receptores ligados a otras actividades enzimáticas 1. RECEPTORES ASOCIADOS A PROTEINAS G Pertenece a una numerosa familia de receptores de superficie que presentan 7 hélices α transmembrana de 22 a 24 residuos hidrofóbicos cada una. El extremo N- terminal, extracelular, tiene inserta varias cadenas oligosacáridicas; la hormona se une a un nidcho formado por los extremos externos de varias de las hélices α transmembrana; el asa entre las hélises 5 y 6 y el extremo C-terminal se encuentran en el lado citosólico e interaccionan, cuando el receptor es activado por la hormona, con proteínas G ubicadas en la faz interna de la membrana plasmática. El mecanismo general de acción de receptores asociados a proteínas G, es el siguiente: a) La unión de hormona al receptor induce en este un cambio conformacional que le permite interactuar con una proteína G en la cara interna de la membrana. b) La proteína G, unida a GDP en su estado inactivo, reemplaza GDP por GTP y se activa. c) La proteina G activada estimula una enzima localizada en la membrana, que cataliza la producción de segundos mensajeros. d) El segundo mensajero provoca cambios en determinadas proteínas celulares responsable de la respuesta final. Frecuentemente esto acontece después de una serie de reacciones en cascada. 11

12 MECANISMO GENERAL DE ACCIÓN DE PROTEÍNAS G mover Proteína G Las proteínas G, así llamadas por su propiedad de unirse a nucleótidos de guanina (GDP ó GTP), juegan un papel esencial en sistemas de transmisión de señales. Sirven de nexo entre receptores de siete pasos transmembrana y proteínas efectoras dentro de la célula. Las proteínas G son heterotriméricas, constituidas por: Una subunidad α de kda. Una subunidad β de 37 kda. Una subunidad γ de 8 kda. Las subunidades β y γ forman un conjunto estrechamente asociado que funciona como una unidad (dímero). El heterotrímero esta adosado a la cara interna o citosólica de la membrana, a la cuál se mantiene anclado. La subunidad α es fijada por un resto miristato. La subunidad γ esta asociada por una cadena isoprenoide. La subunidad α posee el sitio que fija con alta afinidad nucleótidos GDP y GTP. Mientras esta unido a GDP se mantiene firmemente asociado al conjunto βγ para integrar el heterotrímero, que es INACTIVA. La llegada de la hormona al receptor de membrana promueve en éste un cambio conformacional que 12

13 determina su interacción con la proteína G inactiva. Se produce entonces liberación de GDP e ingreso de GTP a la subunidad α. El complejo α-gtp se disocia del dímero βγ y adquiere actividad moduladora sobre la proteína efectora que le sigue en el sistema de señales. La subunidad α tiene actividad GTPasa; es capaz de hidrolizar el GTP fijado para dar GDP y Pi libre. La subunidad α unida a GDP vuelve a fijarse al dímero βγ y reconstituye el heterotrímero inactivo. Se han reconocido la existencia de 20 tipos distintos de subunidades α, 5 de β y 10 de γ, lo cuál permite componer una gran variedad de proteínas G, las que han sido agrupadas en familias según el tipo de subunidad α que poseen. 2-RECEPTORES PROTEINA-TIROSINA QUINASA Existen receptores con actividad catalítica en su propia molécula y otros asociados directamente a enzimas. Receptores con actividad tirosina quinasa intrínseca. La insulina y numerosos factores de crecimiento se unen a receptores de este tipo en la membrana celular. En su mayoría están constituidos por una cadena polipeptídica cuyo extremo N-terminal, extracelular, posee el sitio de unión del ligando. Es común numerosos restos de cisteína en este dominio. Sigue una hélice α transmembrana y la porción citosólica, correspondiente al segmento C-terminal, donde se encuentra el sitio activo de la tirosina quinasa. El receptor de la INSULINA es algo más complejo; está formado por dos heterodímeros αβ unidos entre sí por puentes disulfuro. La subunidad α, extracelulares, poseen e lugar de unión de la hormona. Las subunidades β tienen un segmento transmembrana cada una y un dominio citosólico con actividad tirosina quinasa. La fijación del ligando al dominio extracelular de estos receptores produce un cambio conformacional que induce dimerización (excepto en la insulina, formada por dos heterodímeros) y activación de la tirosina quinasa. Se produce fosforilación cruzada de una cadena a otra en varios restos tirosina del dominio citosólico; se habla de autofosforilación del receptor. Como resultado de esta fosforilación aumenta aún más la actividad de la quinasa y se crean sitios a los cuales pueden unirse otras proteínas que actúan como eslabones en la cadena de transmisión de la señal. Los restos fosfotirosina promueven la fijación, a la porción citosólica del receptor, de proteínas que contienen dominios SH2. La proteína con dominio SH2 unida al receptor activado es fosforilada en restos tirosina y favorece la asociación de otras proteínas con dominios SH2. 13

14 Receptores con actividad tirosina quinasa extrínseca. Existe otra familia de receptores con capacidad para asociarse a proteína-tirosina quinasas del citoplásma. Son semejantes en estructura a los receptores protein-tirosina quinasa descriptos, aunque no presentan sitio catalítico. Cuando el ligando se fija al dominio extracelular se produce dimerización y la porción citosolíca interacciona con tirosina quinasa. El receptor es fosforilado por la quinasa en varios restos tirosina que facilitan la unión de proteínas con dominios SH2. El resultado es prácticamente el mismo que el descripto para Rc con tirosina quinasa incluida en su molécula. Estos receptores se distinguen en dos familias principales: Src (SH2) y JAK. 14

15 3. RECEPTORES LIGADOS A OTRAS ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS Algunas hormonas y otros agentes de naturaleza peptídico se unen a receptores de membrana cuyo dominio citosólico tiene activida guanilato ciclasa, enzima que cataliza la formación de GMPc, este actúa como segundo mensajero. A esta clase de receptores pertenecen los de los peptídos natriúreticos atriales. Mencionaremos aquí, aunque no son receptores de membrana, sino intracelulares, a otro tipo de Rc guanilato ciclasa. Son hemoproteínas citosólicas activadas por pequeñas moléculas que atraviezan la membrana fácilmente, los mensajeros paracrinos óxido nitroso (NO) y monóxido de carbono (CO). Una tercera forma de receptores relacionados con guanilato ciclasa es la de bastoncillos de la retina. El resultado de la activación de todos estos receptores es la formación de GMP-3,5 -cíclico. 15

16 SISTEMAS DE TRANSMISIÓN DE SEÑALES 1. Sistema del AMP-3,-5 -cíclico. El descubrimiento de esta molécula a fines de la década del 50 abrió un nuevo campo que permitió establecer mecanismos básicos generales para explicar la acción de numerosos hormonas. El AMP-3,5 -cíclico se genera a partir de ATP en reacción catalizada por adenilato ciclasa, enzima que requiere Mg++, es una proteína integral de membrana plasmática de más de 100kDa.. Está formada por una cadena polipeptidica compuesta por dos porciones iguales, unidas en tándem, cada una de las cuales posee los siguientes dominios: un segmento N-terminal intracelular seguido de seis hélices transmembrana y un largo dominio citosólico. Los segmentos cotosólicos situados a continuación de cada conjunto de seis hélices transmembrana contiene el sitio catalítico. En mamíferos se han identificado nueve formas diferentes de adenilato ciclasa, en distintos tejidos y con propiedades regulatorias diferentes. Pracicamente todas son activadas por α s; no todas son inhibidas por α i; Ca2+, Ca2+-calmodulina y proteina quinasa C ejercen efectos sobre algunas de ellas. mover 16

17 El sistema esquematizado en la Fig , funciona del siguiente modo: 1- El cambio conformacional producido en el receptor por la unión de la HORMONA constituye la primera señal, que se transmite a moléculas de proteínas G. a. Existen receptores y proteínas G estimuladores (Rs y Gs) e inhibidores (Ri y Gi). b. Cuando el receptor ocupado por la hormona es de tipo estimulador (Rs), interactúa con una proteína Gs. En cambio los receptores acoplados a proteínas Gi transmiten una señal inhibitoria. c. Mientras el receptor está vacío, el heterotrímero de la protyeína G se mantiene inactivo, con su subunidad α ligada a GDP. 2- La interacción con el complejo HR produce modificaciones en la proteína G, en la cuál la subunidad α se desprende del GDP y fija GTP procedente del citosol. La unión de GTP disocia la subunidad α del dímero βγ. El complejo α s- GTP tiene capacidad para activar la adenilato ciclasa. En el caso de receptores acoplados a proteína Gi se desprende α i- GTP, de acción inhibotoria sobre esta enzima. El dímero βγ también puede cumplir, per se, acciones de transmisor de señales. 3- La adenilato ciclasa activada cataliza la formación de AMPc a partir de ATP y eleva la concentración de ese segundo mensajero en la célula. 4- La subunidad α posee actividad GTPasa, promueve la hidrólisis del GTP y queda unido GDP, por lo cuál vuelve a asociarse con el dímero βγ para reconstituir la proteína G inactiva y deja de actuar sobre la adenilato ciclasa. Modo de acción del AMP cíclico: El AMPc difunde en la célula y estimula la proteína quinasa A. La proteína quinasa A (dependiente de AMPc) en ausencia de AMPc se encuentra inactiva, formando un tetrámero constituido por dos subunidades llamadas catalíticas (C) y dos monómeros reguladores (R). Cuando aumenta el nivel de AMP cíclico en la célula, dos moléculas del nucleotido se fijan a sitios de unión específicos en cada una de las subunidades reguladoras; se produce un cambio conformacional que las obliga a desprenderse de las catalíticas. Las subunidades C libres tienen actividad enzímatica. La unidad catálitica de la proteína quinasa A transfiere fosfato de ATP a restos serina o treonina de proteínas que, al ser fosforiladas, adquieren nuevas propiedades. El AMPc es un mensajero plurivalente que provoca respuestas muy distintas en diferentes células. Aunque la respuesta varía según el tejido considerado, en todos los casos la acción del AMPc se realiza a través de reacciones en cascada iniciadas con la activación de la proteína quinasa A, que cataliza la adición de fosfatos a diversas proteínas. La fosforilación de enzimas (modificación covalente) promovida por la proteína quinasa A dependiente de AMPc, produce según los casos, estimulación o inhibición y constituye un importante mecanismo regulador del funcionamiento de vías metabólicas. También interviene como modulador de la actividad de sistemas de transporte de membrana. A nivel de núcleo puede influir sobre la transcripción; en efecto, existen secuencias específicas en el ADN, llamadas elementos de respuesta dependiente de AMPc. 17

18 Fosfodiesterasa. El AMPc es un regulador muy potente y las células deben controlar su concentración. En la mayoría de los tejidos existe la fosfodiesterasa, enzima que cataliza la hidrólisis de la unión del fosfato al carbono 3 en el AMPc y lo convierte en AMP (adenosina-5 -monofosfato) inactivo. Las fosforilaciones promovidas por proteína quinasa normalmente son revertidas por proteínas fosfatasas, algunas asociadas a receptores transmembrena, otras libres en el citosol. 2. Sistema del fosfatidilinositolbifosfato El fosfatidilinositol (PI) es un componente de membranas celulares, ubicado preferentemente sobre la cara interna. El PI es fosforilado en los carbonos 4 y 5 del inositol por transferencia de fosfatos desde ATP, para formar fosfatidilinositol- 4,5-bifosfato (PIP 2 ). Esta molécula integra un sistema de transmisión de señales. La unión del ligando específico a un receptor de siete pasos transmembrana produce un cambio conformacional de la porción citosólicadel receptor que lo capacitapara interactuar con una proteína Gq. La subunidad αq reemplaza GDP por GTP y se libera el dímero βγ. El complejo αq-gtp estimula la fosfolipasa C (forma β). Esta enzima cataliza la hidrólisis de fosfatidilinositol-4,5-bifosfato de la membrana para generar diacilglicerol e inositol- 1,4,5-trifosfato (IP 3 ), las dos moléculas actúan como segundos mensajeros. Otra fosfolipasa C, la forma γ, se asocia con receptores proteína-tirosina quinasa (ver más adelante). 18

19 mover La fig presenta un esquema del sistema de fosfatidilinositol-4,5-bifosfato: 1- El IP 3 liberado en el citosol se fija a receptores de membrana del reticulo endoplásmico (RE). Estos receptores son proteínas tetraméricas con múltiples dominios transmembrana que forman canales de Ca La unión de IP 3 produce apertura del canal y liberación de Ca++ almacenado en las cisternas del RE. 19

20 3- Este aumento brusco de calcio en el citosol es un factor determinante de diversas respuestas celulares. 4- La acción del IP 3 es determinada por fosfatasas. Este es rápidamente desfosforilado sucesivamente a IP 2, IP e inositol, por fosfomonoesterasas específicas. 5- El diacilglicerol que queda en lamembrana funciona también como un segundo mensajero. Su acción se ejerce a través de la activación de proteína quinasa C, localizada en la membrana. Esta enzima fosforila proteínas vinculadas a procesos de multiplicación celular y factores de transcripción. Algunos miembros de3 la familia de proteina quinasa C requieren Ca++ y DG para su activación. 6- La estimulación de la proteína quinasa C por DG es interrumpida por hidrólisis de este compuesto. En la reacción generalmente se libera araquidonato, precursor de eicosanoides. La estimulación persistente de la proteína quinasa C promueve el desarrollo de tumores. Lípidos en sistemas de transmisión de señales Fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato. Es otro segundo mensajero de naturaleza lipídica, generado a partir de fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PI-4,5-P 2 ) por acción de la fosfatidilinositol-3 quinasa (PI3K). Esta enzima es activada en respuesta a la estimulación de receptores de superficie por distintas hormonas, neurotransmisores y factores de crecimiento. El PI-3,4,5,P 3 induce la activación de proteína quinasa B, componente importante de sistemas de señales dependientes de INSULINA y factores de crecimiento. 20

21 3. Señal del calcio. Normalmente la concentración intracelular de Ca++ es muy baja (alrededor de 10-7 M), unas diez mil veces inferior a las concentraciones habituales en el espacio extracelular. Distintos estímulos pueden hacer aumentar la concentración de Ca++ en el citosol, este puede ingresar desde el espacio extracelular, mitocondrias y retículo endoplásmico, en estas dos últimas organelas el ión se almacena. La elevación de niveles de Ca++ puede ser provocado por liberación de inositol-1,4,5-trifosfato, por AMPc y CMPC. El ión Ca++ se convierte así en un mensajero final de distintos sistemas de transmisión de señales. El ión Ca++ en el citosol se une a proteínas específicas. Una de estás proteínas fijadoras, la más conocida es la calmodulina. Esta proteína de 17kDa, de carácter acídico, se encuentra en todos los tejidos. Posee cuatro sitios de fijación de Ca++. En ambos extremos de la molécula tiene dominios globulares, cada uno de los cuales presenta dos motivos que fijan Ca++, compuesto por manos EF. Entre estos extremos se extiende un largo segmento en hélice α. Cuando se une a Ca++, la calmodulina sufre cambios conformacionales y adquiere capacidad para regular la actividad de numerosas proteínas blanco, incluidas diversas proteínas quinasas. Que integran cascadas de fosforilación. Estas fosforilaciones modifican la actividad de enzimas, canales de iones y factores de transcripción. 4. Sistema Ras y quinasas MAP. Esta vía de transmisión de señales pone en acción una cascada de proteína quinasas muy importante en la regulación de numerosas funciones celulares. Todos sus componentes son proteínas, no se generan segundos mensajeros de molécula pequeña. 21

22 Cuando un receptor proteína- tirosina quinasa o asociado a proteína-tirosina quinasa es activado por su ligando, se fosforilan restos tirosina en el dominio citoplasmico y se crean sitios de unión para proteínas con dominios SH2, como las Grb (de Growth factor receptor binding protein ) por ejemplo: Grb se asocia a otra llamada Sos. El complejo Grb-Sos fijado al receptor en un lugar próximo a la cara interna de la membrana plasmática interactua con proteínas Ras, esta esta inactiva y es estimulada al asociarse con Grb-Sos. Ras. Designadas así por su homología con prot. Del sarcoma de rata. Proteínas Ras. Son moléculas monoméricas de alrededor 21kDa. Que fijan nucleotidos de guanina (GDP y GTP) y tienen actividad GTPasa. Están ancladas en la faz citosólica de la membrana plasmática por una cadena isoprenoide farnesilo unida a un resto cisterna pro xomo al C Terminal. Ras fijada a GDP es inactiva; su interacción con Grb-Sos. Promueve el cambio de GDP por GTP y determina su estimulación. La misma molécula Ras tiene capacidad para autorregularse, ya que cataliza la hidrólisis de GTP a GDP + Pi y completa el ciclo de activación e inactivación. Nótese la similitud entre Ras y la subunidad α de las proteínas G. La estimulación de Ras inicia una cascada de fosforilaciones en restos serina-treonina de proteínas. Las enzimas activadas en cadena son llamadas genericamente quinasas MAP ( de mitogen activated protein). La primera es MAPKKK (MAP quinasa, quinasa, quinasa) capaz de fosforilar y activar a una segunda MAPKK y esta a una tercera MAPK, responsable de la fosforilación de la proteína efectora, que adquiere así la capacidad para influir sobre la proliferación y diferenciación celular. Existen diversas vías iniciadas por Ras; las quinasas participantes en cada una de ellas son identificadas con distintas siglas. En la Fig se observa qu comienza con la activación por Ras-GTP de la proteína raf (una MAPKKK), la cuál fosforila y estimula a una MAPKK llamada MEK es una quinasa dual, transfiere fosfato a restos serina-treonina y también tirosina; activa a miembros de la familia de quinasas reguladas por señales extracelulares denominadas ERK (una MAPK). Estas quinasas fosforilan una variedad de proteínas blanco que incluyen otras proteína quinasas y factores de transcripción en el núcleo. Entre los genes cuya actividad es incluida por estas vías se cuentan los llamados inmediatos tempranos, la mayoría de los cuales codifica factores de transcripción que influyen sobre otros genes y modifican su expresión. Estas proteinas Ras están vinculadas con las funciones de proliferación y diferenciación celular. El interés en las proteínas Ras se incrementó notablemente al comprobarse que alrededor del 30% de los cánceres humanos están asociados a mutaciones en el gen ras. Está lo convierten en un encogén y por lo general se ve efectada la actividad GTPasa de la proteína y esta queda permanentemente activada, esto provoca descontrol en la proliferacíon celular y transformación maligna. Las proteínas Ras forman una familia de 50 miembros. 22

23 5. Sistema JAK-STAT. Produce una conexión más directa entre el complejo ligando-receptor y los efectores. Las proteínas STAT (de signal transducers and activators of transcription ) contienen dominios SH2. En células no estimuladas, las proteínas STAT se encuentran en el citosol. La unión de algunas hormonas y citoquinas a receptores asociados a tirosina quinasa tipo Janus (JAK) en el dominio citoplásmico del receptor activa a la quinasa y genera fosfotirosinas, a las cuales se fijan proteínas STAT por sus dominios SH2. La subsiguiente fosforilación de STAT promueve su dimerización y traslación hacia el núcleo, donde estimula la transcripción de sus genes blanco. La hormona de crecimiento, la prolactina, varias citoquinas que controlan la producción de células de la sangre y el interferón γ utilizan esta vía. 23

24 Ejemplo: INSULINA La insulina es una hormona de naturaleza proteínica. Es la primera proteína cuya secuencia de aminoácidos se determinó con exactitud. La molécula esta constituida por dos cadenas polipéptídicas (cadena A 21AA y cadena B con 30AA) y tiene una masa cercana a 6000 Da. Ambos polipéptidos están unidos por dos puentes disulfuro extendidos desde las cisternas 7 y 20 de la cadena A y las cisternas 7 y 19 de la cadena B respectivamente. Entre dos cisternas de la cadena A ubicadas en 6 y 11 se establece un puente disulfuro intracatenario. La presencia de estas uniones disulfuro son indispensables para la actividad biológica de la hormona. Existen diferencias entre la estructura primaria de las insulinas de distintas especies; sin embargo todas muestran la misma actividad cuando son administradas a individuos de una especies distinta. De hecho la insulina porcina se utilizó mucho tiempo en la terapeutica. La síntesis de insulina humana a partir de sus aminoácidos constituyentes fue en su momento una verdadera hazaña. En la actualidad se produce insulina humana mediante tácnicas de ADN recombinante. Biosíntesis. En el reticulo endoplásmico rugoso (RE) de las células β del páncreas se sintetiza preproinsulina, proteína precursora de 111AA. Está penetra a la cavidad del RE e inmediatamente pierde el peptído líder, de 26AA ene el estremo N-terminal. Se forma la proinsulina, de 85AA y alrededor de 9000Da, prácticamente sin actividad hormonal. Los primeros 30AA corresponden a la cadena B y los últimos 21 a la cadena A de la insulina. Entre ambos segmentos se extiende un trozo de 34AA, que comprende el péptido C o de coneccción. Secreción. La proinsulina es englobada en vesículas y transportadas al aparato de Golgi, donde sucesivas hidrólisis, catalizadas por peptidasas, liberan insulina activa, el peptido de conexión y dos peptidos ubicados el los extremos del peptido C. Los segmentos separados de la proinsulina quedan dentro de vesículas secretorias, en las cuales la insulina forma dímeros y hexámeros con zinc. La excreción del contenido de las vesículas al espacio extracelular se realiza por exocitosis. El estímulo más eficaz para la síntesis y secreción de la insulina es el aumento de la glucemia. Degradación. La insulina tiene una vida media menor de 10 minutos en el hombre. La hormona es degradada en hígado, riñon y otros órganos. 24

25 MECANISMO DE ACCIÓN DE LA INSULINA MECANISMO DE ACCIÓN. La insulina actúa previa unión a receptores específicos en la membrana plasmática de las células efectoras. El receptor de insulina es una glicoproteína integral de membrana, de una masa aproximada a 400kDa. Es un heterotetrámero de dos subunidades α y dos β, todas ellas glicosiladas y unidas entre sí por puentes disulfuro. Las subunidades α se encuentran en el lado externo de la membrana; a ellas se une la insulina. Las subunidades β atraviesan la doble capa lipídica y emergen a ambos lados de está. En su porción citosólica se encuentra el sitio activo de proteína-tirosina quinasa. Esta enzima se mantiene inactiva mientras el receptor no está ocupado. Los receptores de la insulina se encuentran en todos los tejidos de mamíferos. Su número varía desde 40 por célula en glóbulos rojos hasta en hepatocitos y adipocitos. 25

26 Cuando la insulina se fija al sitio de unión del receptor en las subunidades α, produce un cambio conformacional que se transmite a las subunidades β y activa a la tirosina quinasa. El receptor activado adquiere capacidad para autofosforilarse y catalizar la fosforilación de restos tirosina de otras proteínas. Las mejores caracterizadas de estas proteínas son los sustratos del receptor de la insulina (IRS), del cual se han identificado cuatro. La actividad de tirosina quinasa del receptor inducido por la unión de la insulina inicia una cascada de fosforilaciones. Las fosfotirosinas de IRS fijan otras proteínas poseedoras de dominios SH2, entre ellas fosfatidilnositol 3-quinasa y Grb-2. La figura presenta algunos de los sistemas de señales activados por insulina. Una de las más importantes vías de señales puestas en marcha a partir del complejo insulina-receptor es la que comprende a la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K). La PI3K activada por su interacción con la proteína IRS cataliza la adición de un resto fosfato en la posición 3 del inositol de (PI-4,5-P 2 ) para formar PI-3,4,5-P 3. Este compuesto atrae proteínas que tienen dominio PH (de plekstrin homology ) y al unirse favorece su activación. Una de las más importantes proteínas activadas por esta vía es la proteína quinasa B (PKB). Esta proteína activada fosforila diversas proteínas efectoras; esta acción promueve modificaciones de la actividad de enzimas o de la expresión génica. Algunas de las acciones mediadas por esta vía son: ACTIVACIÓN DEL TRANSPORTE DE LA GLUCOSA. Las fosforilaciones catalizadas por la PKB son el factor principal determinante de la translocación de transportadores GLUT4 desde vesículas intracelulares hacia la membrana plasmática. Esta acción es notable en músculo y adipocitos. SINTESIS DE GLUCÓGENO. La glucógeno sintasa (GS) es la principal enzima reguladora de la glucogenogénesis. La PKB inactiva a una de las enzimas que fosforilan a la GS, la glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK3). Esto ayuda a mantener desfosforilada, es decir activa a la GS. GLUCOLISIS. La PKB activa por fosforilación a la fosfofructoquinasa 2, enzima que cataliza la formación de fructosa-2,6-bifosfato a partir de fructosa-6-p. La F-2,6-bisP es un poderoso efector positivo de la fosfofructoquinasa 1, importante enzima regulatoria de la vía glucolítica. CONVERSION DE LA GLUCOSA EN ACIDOS GRASOS GLUCONEOGÉNESIS. El PI (3,4,5) P 3 inhibe la glucosa-6-fosfatasa. ACCIONES SOBRE LA ACTIVIDAD GÉNICA MEDIADA POR LA VÍA PI3K a) Inducción de la expresión de la inducción de hexoquinasa en músculo b) Represión de la transcripción del gen que codifica para fosfoenolpiruvato carboxiquinasa. c) Activación de la síntesis de glucosa-6-p deshidrogenasa, enzima de la vía pentosa fosfato. METABOLISMO DE TRIACILGLICEROLES. La insulina tiene efecto antilipolítico, pues inhibe la lipasa sensible a hormona en tejido adiposo por activación de la fosfodiesterasa que hidroliza AMPc. La fosfodiesterasa es una de las proteínas blanco de la PKB 26

27 SISNTESIS DE PROTEÍNAS. El sistema de señales IRS-PI3K participa en la regulación del transporte de aminoácidos, transcripción de genes y traducción de ARNm DIABETES Mellitus: Es una condición patológica caracterizada por hiperglucemia y glucosuria persistentes, además de un complejo cuadro de síntomas resultantes de un serio desequilibrio metabólico general. Es producida por deficiencia absoluta de insulina, como en la forma clínica dependiente de insulina o Tipo I, a la llamada Diabetes Juvenil en la cual hay incapacidad para sintetizar insulina. Existe otra forma no insulino dependiente o Tipo II que se manifiesta en personas adultas, en la cual la producción de insulina puede estar reducida, normal o incluso aumentada. En este tipo hay resistencia de los tejidos efectores a la insulina. En la mayoría de los casos reside en los receptores que presentan disminución de la capacidad para transmitir señales, debida a distintas causas La siguiente muestra las alteraciones mas importantes en la diabetes mellitus. 27

28 REGULACIÓN DE LA SINTESIS Y DEGRADACIÓN DE GLUCÓGENO ACCIONES REGULATORIAS DE LA SÍNTESIS Y DEGRADACIÓN DEL GLUCÓGENO Referencia: Capitulo 3. Metabolismo de hidratos de carbono. Capitulo 18. Regulación del metabolismo. Química Biológica. Antonio Blanco 28