ESTUDIO DE LA RESPUESTA INMUNE CELULAR EN RATONES INFECTADOS CON HERPES SIMPLEX-I Y TRATADOS CON EXTRACTOS DIALIZABLES DE LEUCOCITOS

Transcripción

1 ESTUDIO DE L RESPUEST INMUNE CELULR EN RTONES INFECTDOS CON HERPES SIMPLEX-I Y TRTDOS CON EXTRCTOS DILIZBLES DE LEUCOCITOS Responsable de proyecto: Dr. Rommel Chacón Salinas. RESUMEN Desde la década de los 40 s se sabe que los dializados de extractos leucocitarios (DLE) obtenidos a partir de donadores inmunes son capaces de transferir una respuesta inmune celular de forma antígeno (g) específica, a personas no reactoras. De aquí se hipotetizó la existencia de una substancia conocida como factor de transferencia (FT). La naturaleza química exacta y los mecanismos por los cuales actúa el FT son poco entendidos hasta la fecha, sin embargo han sido utilizados ampliamente en el área clínica, ya que la respuesta inmune que transfieren provee de beneficios a individuos que son susceptibles a padecer de infecciones causadas por gérmenes oportunistas, como virus, parásitos, bacterias y hongos. En virtud de ello, en el presente proyectos se pretende analizar la manera en que el FT actúa sobre células del sistema inmune y en particular cómo afecta a la respuesta inmune celular en un modelo murino de infección con herpes simplex tipo 1. Durante el desarrollo de este proyecto nos abocamos a obtener un abasto viral suficiente para realizar los diferentes ensayos, así como establecer un modelo de infección en ratones C57BL6 con el virus herpes simplex-i y a obtener los primeros extractos dializables de leucocitos de estos ratones. INTRODUCCION Los extractos dializables de leucocitos (DLE) son un conjunto de moléculas obtenidas a partir de la lisis de leucocitos y su posterior diálisis. Estos DLE han sido estudiados ampliamente debido a que presentan un grupo de moléculas conocidos como factores de transferencia (TFs), los cuales son sustancias inmunomoduladoras capaces de transferir la respuesta inmune celular en receptores no inmunizados a partir de su obtención de células de donadores sensibilizados. Los primeros estudios en los cuales se observó la activación de la inmunidad celular tras realizar la transferencia de algunos componentes sanguíneos fueron realizados por Landsteiner y Chase en los años 40 s, pero fue hasta los años 50 s que Lawrence denominó factores de transferencia a los componentes activos capaces de estimular de

2 manera favorable a las células del receptor. partir de estos experimentos, se definió la actividad de los TFs como antígeno-específica, es decir, que la reacción inmunológica que se desencadena en el receptor es específica contra el antígeno empleado para inmunizar al donador del cual se obtienen los TFs. Los TFs son moléculas obtenidas al realizar un extracto dializable de leucocitos (DLEs, dializable leucocitary extract) obtenidos de donadores inmunizados, cuya naturaleza química no ha sido del todo definida. Muchos modelos de estudio de los TFs han propuesto que su estructura química corresponde a la de un nucleopéptido, cuya especificidad se encuentra codificada en la porción peptídica. El peso aproximado de los TFs se estima entre 3.5 y 6 kda. Se han encontrado diversas aplicaciones clínicas de los TFs ya que, al activar los mecanismos de inmunidad en el receptor, le proveen efectos profilácticos y terapéuticos, muy importantes en pacientes con deficiencias inmunitarias que les hacen susceptibles a infecciones oportunistas. De hecho, se ha demostrado que los TFs son eficientes en el control de enfermedades donde la respuesta celular es el mecanismo de defensa primordial, como en infecciones virales (herpes labial, varicela), infecciones por bacterias intracelulares (tuberculosis, lepra) e infecciones parasitarias (leshmaniasis, toxoplasmosis). Muchos grupos de investigación han informado efectos benéficos en pacientes con infecciones recurrentes con Herpes simplex mostrándose en algunos casos la remisión total de las lesiones o una disminución considerable en la frecuencia y severidad de las manifestaciones clínicas. Hasta el día de hoy, no se han reportado efectos adversos después de la administración de los TFs. Estudios comparativos entre diferentes rutas de administración demuestran que los efectos de los TFs son los mismos independientemente de la vía utilizada. En vista de estas circunstancias en el presente trabajo decidimos evaluar si los extractos dializables de leucocoitos modifican en alguna medida el desarrollo de la respuesta inmune celular en un modelo murino de infección con herpes simplex-i.

3 METODOS Y MTERILES Propagación de HSV-1 El virus HSV-1 fue propagado en células Vero, para lo cual se tomó 0.1ml de la suspensión viral de un stock de HSV-1 y se utilizó una multiplicidad de infección (MOI) de Las células fueron incubadas a 37 C entre 24 y 48 horas. Una vez transcurrido este tiempo, las partículas virales fueron cosechadas mediante el proceso de congelación y descongelación (3 veces) cuando se observó un 80% a un 90% de efecto citopático (ECP) en la monocapa de células Vero. Los restos celulares fueron eliminados mediante centrifugación y las partículas virales fueron almacenadas en viales a -70 C. Titulación del virus por el método de DICT 50 Para la titulación del abasto viral, se utilizaron células Vero. Brevemente, las células Vero fueron dispersadas con una solución de tripsina-verseno, una vez que las células fueron desprendidas, las células fueron cuantificadas con ayuda de una cámara de Neubauer y se ajustó la suspensión celular a 1.25 x 10 5 células/ml. Finalmente se colocó 100µl de la suspensión celular ajustada en cada uno de los 96 pozos de la micro placa. Por otra parte, se prepararon diluciones con un factor de dilución de 10 del virus problema, desde 10-1 hasta 10-8, obteniendo un volumen final de 2ml en cada dilución Posteriormente se tomaron 100µl de cada dilución y se depositaron en cada uno de los pozos (ocho pozos por dilución). La microplaca fue incubada a 37 C en atmósfera húmeda con 5% de CO2. La formación de efecto citopático fue observado cada día por 7 días. INFECCION DE RTONES Balb-c Los ratones C57BL6 fueron infectados con diferentes cargas virales. Para ello la parte inferior del lomo de los animales fueron depilados y 24 horas después se les procvocó una irritación en la zona con ayuda de una navaja de bisturí sin filo. En esta zona se les colocó los virus en un volumen de 10 µl. Una vez realizada esta inoculación, los ratones fueron monitoreados cada 24 horas en cuanto a su peso y a la aparición de lesiones vesicualres en la zona de inoculación. Los grupos utilizados en el presente trabajo fueron: - Grupo Control: Inoculación intraperitonela diaria por cinco días con solución salinas estéril y al sexto día se infectó con HSV-1.

4 -EDL esp.: Inoculación intraperitoneal diaria por cinco días con EDL específico y al sexto día infección con HSV-1. -EDL no esp. : Inoculación intraperitoneal diaria por cinco días con EDL no específico y al sexto día infección con HSV-1. Evaluación de carga viral en el bazo De los diferentes grupos de experimentación, se colectaron los bazos en condiciones de esterilidad al día 14 post-infección. continuación el bazo fue disgregado haciéndolo pasar por medio de una jeringa de 1ml y recibiéndolo en medio de mantenimiento, de ahí tomar se tomaron alícuotas para hacer diferentes diluciones y se centrifugaron para mandar al fondo todo el material celular y se tomó el sobrenadante en donde permanecían las partículas virales. Se realizaron dos o tres diluciones decimales seriadas del virus, obteniendo un volumen final de 2 ml de cada dilución, se colocaron 15 ml de medio de mantenimiento en el contenedor y con una micropipeta multicanal ajustada a 100µl, se tomó el medio y fue depositado en ocho pozos de la microplaca, hasta llenar los 96 pozos de la microplaca. cada pozo de la primera fila (1-H1) se agregaron 100 µl de la dilución más alta, se mezcló el virus con el medio y se procedió a transferir 100 µl de la mezcla (virus-medio) de la hilera 1, a la hilera 2, mezclar y transferir 100 µl a la hilera 3, así sucesivamente hasta llegar a la hilera diez. En esta última después de mezclar se eliminó 100 µl por pozo. Finalmente, se tomó la suspensión celular y se depositó en cada uno de los ocho pozos de la microplaca, empezando por la hilera doce hasta llenar los 96 pozos de la microplaca. cada uno de de pozos de la hilera 11, se adicionaran 100 µl de la primera dilución del virus y sirvieron como testigos positivos. La hilera 12 quedará como testigo negativo. La placa fue incubada a 37 C en una atmósfera de CO 2 al 5%. Se observo diariamente el efecto citopático al microscopio, anotando el número de pozos que lo presentaban. Terminado el periodo de incubación se desarrollo el análisis matemático para la obtención del titulo de la carga viral en el bazo de cada ratón. Obtención de suero Cada ratón fue sangrado cada tercer día durante la infección. La sangre fue obtenida de la vena facial. Una vez obtenida la sangre, el suero fue separado de los demás componentes sanguíneos por centrifugación. Los sueros fueron alicuoteados y conservados en congelación a -70 o C hasta su uso.

5 Determinación de IFN-γ en el suero de ratones infectados con HSV-1 Para la determinación de IFN-γ se utilizó un kit comercial de Becton Dickinson (San Diego, C US). Los anticuerpos de captura se pegan a la placa toda la noche y se procede a la determinación de esta citocina al día siguiente según instrucciones del fabricante. Una curva estándar fue realizada al mismo tiempo que la determinación utilizando IFN-γ recombinante. Las muestras se leen a 450nm.

6 RESULTDOS En la primera parte del proyecto establecimos un modelo in vivo en donde se pudiera observar el efecto protector de los EDL en un proceso infeccioso. En primer lugar, observamos que la cepa ideal para la realización de este trabajo eran ratones de la cepa Balb-c. En ellos vimos la manifestación clínica clásica del proceso infeccioso, además de observar un efecto protector en cuanto al peso de los animales. continuación se decidió evaluar la escala clínica de la infección y observar como afectaban los EDL, tanto específico como no específico, el desarrollo de la infección (Figura 1). Como se puede observar en la figua 1, ambos EDL fueron capaces de disminuir la escala clínica de la infección en relación al grupo control. parentemente no hubo diferencia entre el grupo tratado con EDL específico y no específico. Como habíamos observado con anterioridad, los grupos de ratones que fueron tratados con los EDL sobrevivieron el curso de la infección, mientras que el grupo control sufrió la muerte de varios ratones en el transcurso de la infección. De esta manera, observamos que los EDL no son solo capaces de controlar el proceso infeccioso reflejado en una mayor sobrevida de los animales, una recuperación en el peso de los animales y ahora observamos un mejor desarrollo del proceso infeccioso reflejado en la escala clínica. CTRL EDL esp EDL no esp 4 E S C L C LI NI C DIS POST-INFECCION Figura 1. Desarrollo de la infección de HSV-1 en ratones tratados con Extractos Dializables de Leucocitos. Los ratones fueron tratados diariamente por cinco días previos a la infección con solución salina (ctrl.), Extracto Dializable de Leucocitos de ratones infectados con HSV-1 (EDL esp) y Extracto Dializable de Leucocitos de ratones no infectados (EDL no esp).

7 continuación se cuantificó la cantidad de partículas virales que llegaban al bazo. Previamente habíamos observado que los ratones que habían recibido tratamiento con EDL muy pocos ratones presentaban partículas virales infectivas en el bazo. Sin embargo, decidimos evaluar la cantidad de partículas virales que estaban llegando al bazo de los diferentes grupos de estudio (Figura 2). En general, se observó que al día 14 post-infección los ratones del grupo testigo presentaban una gran cantidad de partículas virales en el bazo (1 X 10 6 PFU/ml), en cambio los ratones que fueron tratados con los EDL mostraron una menor cantidad de partículas virales en el bazo, mientras que los ratones tratados con los EDL esp mostraron una carga de PFU/ml, los animales tratados con EDL no esp mostraron una carga de PFU/ml. De esta manera se notó que los EDL inhiben la invasividad de HSV-1, ya que todos los ratones fueron inoculados en la piel y los que presentaban una gran cantidad de partículas virales en el bazo eran solamente el grupo de animales tratados con solución salina. En cambio, los ratones que fueron tratados con ambos EDL mostraron una menor diseminación de las partículas virales de la piel al bazo. Interesantemente, este fenómeno fue observado inclusive con los EDL provenientes de ratones que no habían sido infectados con HSV-1. Esto nos sugiere que no solamente los factores específicos o TF presentes en los EDL son capaces de inhibir el proceso infeccioso, sino que existen otros mecanismos no específicos o de la inmunidad innata que son capaces de regular el proceso infeccioso C R G TESTIGOS EDL especifico EDL no esp Figura 2. Carga viral en bazo de ratones tratados con EDL e infectados con HSV-1. Los ratones fueron tratados diariamente por cinco días previos a la infección con solución salina (Testigos), Extracto Dializable de Leucocitos de ratones infectados con HSV-1 (EDL esp) y Extracto Dializable de Leucocitos de ratones no infectados (EDL no esp).

8 EL IFN-γ es una citocina que desempeña una función muy importante para el control de las infecciones virales. unque esta citocina puede ser producida tanto en la respuesta inmune innata como en la adaptativa, la mayor producción de esta citocina ocurre en esta última etapa de la respuesta. Por este motivo se evaluó la cantidad de IFN-γ que era producido por los animales infectados, y el efecto de los EDL en esta producción en el transcurso de la infección (Figura 3). Interesantemente vemos una inducción de producción de IFN-γ en todos los ratones tratados. Sin embargo, los animales que alcanzan la mayor producción de la citocina son aquellos que son estimulados previamente con los EDL específicos y que de manera importante son aquellos que alcanzan una menor carga viral en el bazo. De manera interesante, también se observa una producción importante de la citocina en los ratones tratados con EDL no específicos, aunque menor en comparación al grupo de animales tratados con EDL específico IFN-g pg/m NEGTIVO DLE no esp DLE esp Figura 3. Expresión de IFN-γ en ratones Balb-c tratados con EDL e infectados con HSV-1. Los ratones fueron tratados diariamente por cinco días previos a la infección con solución salina (Negativo), Extracto Dializable de Leucocitos de ratones infectados con HSV-1 (EDL esp) y Extracto Dializable de Leucocitos de ratones no infectados (EDL no esp).