METODOS IN VITRO PARA EL DIAGNOSTICO DE RESISTENCIA ANTIHELMINTICA

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1 METODOS IN VITRO PARA EL DIAGNOSTICO DE RESISTENCIA ANTIHELMINTICA *CUTULLÉ, Christian; *Eddi, C.; *Caracostantogolo, J.; *Castaño Zubieta, R. y *Schapiro, J. RESUMEN: Para diagnosticar resistencia antihelmíntica en nematodes gastrointestinales se usan métodos in vivo e in vitro. Los métodos in vitro presentan ventajas y desventajas con respecto a la prueba in vivo de reducción en el recuento de huevos (FECRT). Se han publicado numerosas variantes de métodos in vitro, en el presente trabajo se describen los más comúnmente utilizados: prueba de eclosión de huevos, parálisis de los huevos, parálisis larval, unión a tubulina y de desarrollo larval. Actualmente están desarrollándose técnicas de biología molecular que son métodos altamente sensibles para detectar bajas frecuencias de genes resistentes en poblaciones susceptibles de parásitos. Palabras claves: resistencia antihelmíntica, diagnóstico, in vitro. IN VITRO METHODS FOR ANTHELMINTIC RESISTANCE DIAGNOSTIC SUMMARY: In vivo e in vitro methods are used to diagnose anthelmintic resistance in gastrointestinal nematodes. The in vitro techniques have advantages and disadvantages in relation to the in vivo faecal egg count reduction test (FECRT). All over the world many in vitro methods were developed. In the present paper are described the most common utilized techniques: egg hatch assay (for benzimidazole and levamisole), tubulin binding assay and larval development assay. At the present, many molecular biology techniques are being developed. They are highly sensible methods capable of detecting low frequencies of resistant genes in susceptible parasite populations. Keywords: anthelmintic resistance, diagnostic, in vitro methods. * Instituto de Patobiología, INTA Castelar. Cátedra de Parasitología y de Enfermedades Parasitarias. Carrera de Veterinaria. Universidad del Salvador. Morón (1708) CC 77. Buenos Aires. Argentina 1

2 INTRODUCCIÓN: Vet. Arg. Vol XVI (157): El término resistencia antihelmíntica se refiere a la capacidad heredable de algunos parásitos nematodos para sobrevivir al tratamiento con drogas antihelmínticas a dosis terapéuticas 14. La resistencia ha sido reportada en muchos países afectando a rumiantes (ovinos, caprinos, bovinos), equinos y porcinos. En la especie ovina se presentan la mayoría de los casos de resistencia, siendo hasta el momento escasos los reportes en bovinos 12, 15. La intensificación de los sistemas de producción han conducido a una creciente dependencia en el uso de drogas antihelmínticas para efectuar un control efectivo de las parasitosis. El uso continuo e indiscriminado de los antiparasitarios y la falta de adecuadas medidas de manejo han contribuido a un rápido desarrollo de resistencia. Cuando la resistencia se produce al utilizar antihelmínticos de un mismo grupo químico o de un mismo mecanismo de acción se denomina resistencia colateral. Si se produce al utilizar dos ó más drogas con diferentes mecanismos de acción o de diferentes grupos químicos, se denomina resistencia cruzada o múltiple. En un estudio realizado en 1994, se determinó que la prevalencia de resistencia en Argentina 6 fue del 40 % para benzimidazol, 22 % para el levamisol, 11 % para la combinación de benzimidazol y levamisol y 6 % para ivermectina. La resistencia antihelmíntica es usualmente sospechada cuando un productor reporta una pobre respuesta clínica posterior al tratamiento antiparasitario. Esta falta de respuesta no es por sí misma indicativa de la existencia de parásitos resistentes dado que puede estar atribuida a una mala administración de las drogas antiparasitarias, subdosificación, mala elección del antihelmíntico o una rápida reinfección. Para realizar el diagnóstico de resistencia antiparasitaria se emplean métodos in vivo e in vitro. Como métodos in vivo se utilizan el test de reducción en el recuento de huevos por gramo de materia fecal (FECRT, Faecal Egg Count Reduction Test) o bien las pruebas de dosificación y necropsia post-tratamiento (CAT, Controlled Anthelmintic Test). Este último método es por lo general aplicado cuando existe un interés especial para confirmar resistencia. El costo de los animales involucrados en las necropsias, así como el recuento e identificación de los parásitos, desalientan esta metodología. La FECRT está ampliamente difundida y es de uso común en todo el mundo. Los métodos de laboratorio in vitro ofrecen ventajas y desventajas con respecto a los métodos in vivo. Las técnicas in vitro requieren de una considerable capacitación de los técnicos que efectúan esta metodología. Por otra parte, requieren que se trabaje con parasitaciones monoespecíficas a los efectos de no dificultar la interpretación de los resultados, lo que hace de por sí mucho más complejo la implementación de estos métodos para el diagnóstico de resistencia en el campo. Además, se requiere del mantenimiento en laboratorio, a modo de referencia, de una cepa susceptible y una resistente; en la práctica, la mayoría de las técnicas in vitro se llevan a cabo sólo para investigación. Por lo 2

3 general son menos costosas que las técnicas in vivo, ya que no requieren del mantenimiento y alimentación de animales para la realización de las pruebas. Se detallan a continuación las pruebas in vitro más empleadas: Prueba Eclosión de huevos Parálisis de los huevos Parálisis larval Unión a tubulina De desarrollo larval detecta resistencia a Benzimidazoles (BZD) Levamisol (LEV) / Morantel Levamisol (LEV) / Morantel Benzimidazoles (BZD) Todos los grupos químicos PRUEBAS IN VITRO: ECLOSION DE HUEVOS (EGG HATCH ASSAY): Esta prueba fue desarrollada para la detección de resistencia a los benzimidazoles (BZD). El test original fue descripto por Le Jambre 10 en 1976 y ha sido utilizado desde entonces con pocas modificaciones por muchos otros investigadores. Consiste en incubar huevos no desarrollados de nematodos en concentraciones seriadas de benzimidazoles por un tiempo prefijado y luego determinar la proporción que falla a la embrionación y/o eclosión. Para todos los métodos el porcentaje de huevos que desarrollan y/o eclosionan se corrige en base a la mortalidad natural en los controles no tratados y los datos se someten a análisis probit, para estimar la LC 50 (la concentración logarítmica de la droga que previene el 50 % de eclosión de los huevos). El cultivo de las larvas hasta el tercer estadío (L3) permite la identificación del género parasitario que sobrevive. Para poder calcular el porcentaje de resistencia, las líneas susceptibles de referencia deben ser analizadas en paralelo con las cepas resistentes sospechadas. La principal desventaja de ésta prueba como rutina diagnóstica es el requerimiento de huevos no desarrollados. Esto es porque los benzimidazoles sólo actúan sobre el huevo en la primera parte del desarrollo; cuando la embrionación ocurre, los huevos se vuelven menos susceptibles a éste grupo de antihelmínticos y se pueden obtener resultados falsos positivos. Si bien el test de eclosión de huevos descripto por Donald y col. 4 demostró ser tan sensible como otras técnicas in vitro para la determinación de resistencia a los benzimidazoles 7, existen dificultades en la comparación de resultados entre distintos laboratorios debido a las variaciones introducidas al método y al uso de diferentes cepas susceptibles como referencia. Una restricción del test es que los nuevos benzimidazoles, como por ejemplo el fenbendazole, son no convenientes para la realización de la prueba debido a su escasa solubilidad 9 y por lo tanto bajo poder ovicida. Esta es una importante consideración dado que esta nueva generación de benzimidazoles es la más usada por los productores. De todos modos, el uso de otros 3

4 benzimidazoles más solubles, particularmente tiabendazole, como droga de prueba en estos ensayos está justificada por la resistencia colateral que ocurre dentro de éste grupo de antihelmínticos. Otra consideración importante es si se cuentan los huevos embrionados y larvados o solamente las larvas para estimar los efectos de la droga. La mayoría de los investigadores cuentan solamente el número de larvas, lo cual es más rápido pero puede llegar a dar resultados erróneos. La prueba de eclosión de huevos se utiliza actualmente como método discriminante de resistencia a campo para los benzimidazoles. Presenta dificultades en la interpretación de resultados cuando están involucradas infecciones mixtas y requiere de huevos recientes (frescos, recién recolectados) o bien almacenados 2. El test es rápido, con resultados que pueden obtenerse en 1-3 días si la muestra inicial es adecuada en cantidad de huevos, y es simple a pesar de que requiere precisión técnica. Procedimiento de la técnica: - Ubicar los huevos de nematodos en una placa multipocillos. - Agregar las distintas diluciones de la droga. - Incubar a 22 ºC durante 48 horas. - Contar los huevos embrionados y/o larvados, comparando con un pocillo control no tratado. PARALISIS DE LOS HUEVOS (EGG HATCH ASSAY (LEV)): Este test explota la diferencia entre cepas resistentes y susceptibles evaluando la proporción de recuperación de la parálisis que ocasionan distintas concentraciones de levamisol (LEV) en larvas no eclosionadas 3. Al igual que para la prueba de eclosión de huevos para BZ, los huevos tienen que ser cultivados bajo condiciones altamente controladas para minimizar el desarrollo larval dentro de cada aislamiento. Se requiere de un período de incubación variable, dependiendo de las especies a analizar, para que los huevos desarrollen hasta el estadío pre-eclosión y estén completamente embrionados antes de agregar las diluciones de droga. El momento óptimo para agregar la droga sería de una hora antes del comienzo de la eclosión, que es cuando el primer estadío larval (L1) se vuelve transparente y se mueve activamente dentro del huevo 3. Es necesario determinar este momento crucial para cada especie y aun para cada ecotipo de especie. Como guía, puede decirse que se necesitan 16 horas de incubación a 26 ºC para que los huevos de T. colubriformis y H. contortus eclosionen y 15 horas para Ostertagia spp. No obstante, esto requiere un cuidadoso monitoreo y una serie de cultivos experimentales antes de que el momento óptimo de adición de la droga sea determinado con seguridad. En el caso que algunas eclosiones ocurrieran antes de la administración de la droga, es posible corregir esto en el análisis de los datos si la proporción de los huevos ya eclosionados es estimada al momento de la adición de la droga 3. Luego de la adición de la droga se requieren 6 horas de incubación y se concluye este 4

5 periodo por un golpe de freezer de 5 minutos. Para finalizar se debe poner una gota fría de formaldehído a cada pocillo y almacenar todo a 4 C. El enfriado previene que la larva se enrosque, lo cual hace que sea dificultoso distinguirla de las larvas no eclosionadas y el almacenamiento a 4 C es requerido porque toma algo de tiempo para el formaldehído ejercer su propio efecto tóxico. El formaldehído puede suplantarse por una gota de etanol 96º que mata a los huevos y a las larvas, previene que la larva se enrosque y no tiene los efectos carcinogénicos del formaldehído. Esta prueba también puede emplearse para evaluar resistencia al morantel, con la salvedad de que con concentraciones superiores a 64 µg / ml. de morantel ocurren efectos tóxicos no relacionados con resistencia. El test de eclosión de huevos (LEV) es preciso y sensible pero tiene dos puntos críticos a saber: el momento de la adición de la droga y de la terminación del experimento es crucial. Al igual que con la prueba de eclosión de huevos para benzimidazoles, las comparaciones de resultados entre los laboratorios no son válidas y existe dificultad en la interpretación cuando las poblaciones de nematodos son mixtas. El test es rápido y relativamente fácil de llevar a cabo. Procedimiento de la técnica: - Incubación de los huevos a 26 ºC hasta el período pre-eclosión. - Adición de la droga. - Incubación durante 6 horas. - Congelar por 5 minutos y adicionar una gota de formaldehído o etanol. - Almacenar a 4 ºC. - Proceder a su lectura. PARALISIS LARVAL (LARVAL MOTILITY ASSAY): Este fue el primer método desarrollado para detectar resistencia al levamisol y morantel 11. El principio de esta prueba se basa en determinar el porcentaje de parálisis de L3 después de haber sido expuestas 24 horas a diluciones seriadas de antihelmínticos. El test requiere de cepas susceptibles para ser testeadas en paralelo con la cepa sospechada resistente; de esta forma se realizan comparaciones y se llega a un resultado. El porcentaje de las larvas paralizadas es transformado a probits y proyectado como líneas probit de la dosis. La prueba tiene la gran ventaja de utilizar L3 que son fácilmente obtenidas de cultivos fecales. La L3 es un estadío robusto, fuerte en el ciclo de vida de los nematodos y se almacenan bien por largos períodos de tiempo. En suma, este test es relativamente fácil de llevar a cabo. De todos modos, esta técnica tiene una serie de desventajas: ocurre una dosis-respuesta atípica, por lo que altas concentraciones de levamisol son menos efectivas para inmovilizar a las larvas que las bajas concentraciones. Otra desventaja es que es una prueba subjetiva en juzgar si la larva está paralizada o no, y el ensayo no puede ser preservado para ser contado más tarde. 5

6 Además, el test es críticamente tiempo dependiente. Se recomienda 24 horas como el tiempo óptimo de incubación 11, si se incuba por períodos más largos se produce un rápido cambio en el porcentaje de motilidad larval entre las cepas susceptibles y resistentes. UNION A TUBULINA (TUBULIN BINDING ASSAY): Este ensayo está basado en la diferente unión de los benzimidazoles a la tubulina 9 obtenida de nematodos susceptibles y resistentes. En este ensayo se produce un extracto crudo de tubulina de parásitos adultos, larvas infectivas o huevos y que son incubados con benzimidazol marcado con tritio hasta alcanzar un equilibrio. La droga libre es entonces removida con carbón vegetal, dejando el complejo benzimidazol tritiado-tubulina para ser estimado con un espectrofotómetro de centelleo líquido. La concentración proteica -tubulina- (µg/ensayo) es comparada contra la cantidad de benzimidazol tritiado unido. Los extractos de tubulina de parásitos resistentes unen sustancialmente menos droga (benzimidazol) que los parásitos susceptibles. El grado de unión es dependiente de la estructura particular del benzimidazol. Dado que el ensayo de unión a tubulina está basado en cambios bioquímicos de los parásitos, superó muchos de los problemas inherentes en otros ensayos in vitro. Puede ser relacionado a condiciones de campo y debido a que está estandarizado, se pueden comparar resultados entre laboratorios con más confianza que otras técnicas in vitro. Cuando se cuenta con abundantes nematodos para estudiar este procedimiento es bastante rápido, sensible y seguro. De todos modos, confiar en un ensayo para un solo sitio de acción cuando la resistencia está determinada poligénicamente, lo cual parece ser el caso de la mayoría de los reportes de resistencia antihelmíntica esta abierto a la crítica 10. Se sugiere que más de un mecanismo de resistencia puede estar involucrado, especialmente si diferentes ecotipos de un mismo parásito están siendo investigados. Además, este test necesita el uso de un costoso aparato de laboratorio y para trabajar con isotopos radioactivos se requiere de facilidades de laboratorio aprobadas y de personal especialmente entrenado. Además es una técnica que consume bastante tiempo para su realización. Las pruebas de reducción en el conteo de huevos (FCRT/RCH), eclosión de huevos y unión a tubulina son similares en cuanto a sensibilidad para detectar resistencia a los benzimidazoles. PRUEBAS DE DESARROLLO LARVAL (LARVAL DEVELOPMENT ASSAY): En esta prueba los huevos de nematodos se incuban hasta el tercer estadío larval en una placa multipocillos que contiene medio nutritivo para el 6

7 desarrollo de los huevos y distintas concentraciones de antihelmínticos; existiendo además un pocillo control que contiene solamente medio nutritivo. Los huevos son incubados 7 días a 26 ºC; éste es el tiempo por el cual la mayoría de los huevos eclosionan y llegan a L3. Pasado este tiempo se adicionan unas pocas gotas de iodo (solución de lugol) y se procede a la lectura comparando el desarrollo alcanzado en el pocillo control con el resto de los pocillos 5. La ventaja de esta técnica es poder evaluar distintos grupos de antihelmínticos en forma simultánea: benzimidazol, levamisol, combinación de benzimidazol y levamisol y avermectinas/milbemicinas. Junto con la prueba de eclosión de huevos, es la técnica in vitro más utilizada para diagnosticar resistencia a campo. Las desventajas son que requiere un cuidadoso monitoreo de la placa que se manda a incubar hasta la terminación de la prueba y que requiere de huevos libres de desechos orgánicos por lo que el aislamiento de los huevos es uno de los puntos más críticos de la prueba. Otras técnicas in vitro que están desarrollándose actualmente son las técnicas de biología molecular 13, 16. Las técnicas de PCR (polimerase chain reaction) y de RT-PCR (reverse transcriptase polimerase chain reaction) son pruebas altamente sensibles que utilizan respectivamente pequeñas cantidades de ADN y ARN, para detectar bajas frecuencias de genes resistentes en poblaciones susceptibles de parásitos. Empleando la técnica de PCR, Kwa y col. 1, 8 detectaron diferencias genéticas en el isotipo 1 del gen β tubulina entre poblaciones parasitarias susceptibles y resistentes a los benzimidazoles. El uso de esta tecnología permitirá un diagnóstico precoz, un mejor monitoreo de la resistencia antihelmíntica y la aplicación de mejores medidas de manejo para combinar con el uso de antihelmínticos eficaces. CONCLUSIONES: Tanto la prueba de eclosión de huevos como la de parálisis de huevos no permiten hacer comparaciones entre laboratorios. La prueba de unión a tubulina requiere de un laboratorio de gran infraestructura y de personal especialmente entrenado. A pesar de que se necesitan varios días para la realización de la prueba de desarrollo larval, es sin duda la técnica más conveniente de los métodos in vitro desarrollados hasta el momento ya que permite evaluar distintas drogas, incluso combinaciones de las mismas, en forma simultánea. Las pruebas in vitro son más apropiadas para utilizar en laboratorios o centros de investigación. No son prácticas para detectar resistencia a campo dado que tienen muchos requerimientos técnicos. La prueba de reducción en el recuento de huevos (FCRT) sigue siendo hasta el momento la prueba más conveniente para la detección de resistencia antihelmíntica a campo. Las pruebas in vitro más utilizadas a campo para diagnosticar resistencia son la prueba de eclosión de huevos (para benzimidazoles) y la prueba de desarrollo larval. 7

8 El desarrollo y posterior uso de las técnicas de biología molecular para entender el mecanismo de resistencia a los antihelmínticos constituye la herramienta actual más moderna y sensible para detectar resistencia. Hasta el presente su uso está limitado a la investigación. BIBLIOGRAFÍA: 1. BORGSTEEDE, F. H. M.; ROOS, M. H.; SMITH, G. and PRICHARD, R. K. (1996). Workshop summary: anthelmintic resistance. Vet. Parasitol. (64): COLES, G. C.; BAUER, C.; BORGSTEEDE, F. H. M.; GEERTS, S.; KLEI, T. R.; TAYLOR, M. A. and WALLER, P. J. (1992). World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (W. A. A. V. P.) methods for the detection of anthelmintic resistance in nematodes of veterinary importance. Vet. Parasitol. (44): DOBSON, R. J.; DONALD, A. D.; WALLER, P. J. and SNOWDON, K. L. (1986). An egg-hatch assay for resistance to levamisole in trichostrongyloid nematode parasites. Vet. Parasitol. (19): DONALD, A. D.; WALLER, P. J.; DOBSON, R. J. and ALEXSEN, A. (1980). The effect of selection with levamisole on benzimidazole resistance in Ostertagia spp. of sheep. International Journal of Parasitology (10): DrenchRite user manual. A larval development assay for the detection of anthelmintic resistance. Standard operating procedures A product of CSIRO Research. Horizon Technology Pty Limited. pp EDDI, C.; CARACOSTANTOGOLO, J.; PEÑA, M.; SCHAPIRO, J.; MARANGUNICH, L.; WALLER, P. J. and HANSEN, J. W. (1996). The prevalence of anthelmintic resistance in nematode parasites of sheep in Southern Latin America: Argentina. Vet. Parasitol. (62): JOHANSEN, M. V. (1989). An evaluation of techniques used for the detection of anthelmintic resistance in nematode parasites of domestic livestock. Vet. Research Communications (13): KWA, M. S. G.; VEENSTRA, J. G. and ROOS, M. H. (1994). Benzimidazole resistance in Haemonchus contortus is correlated with a conserved mutation at amino acid 200 in β-tubulin isotype 1. Molecular and Biochemical Parasitology (63): LACEY, E. and PRICHARD, R. K. (1986). Interactions of levamisoles (BZ) with tubulin from BZ-sensitive and BZ-resistant isolates of Haemonchus contortus. Molecular Biochemistry in Parasitology (9):

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