MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA GENERAL Y ALIMENTARIA

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1 Fundación H. A. Barceló Facultad de Medicina 2do.AÑO MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA GENERAL Y ALIMENTARIA Módulo 2 Introducción al estudio de Microorganismos involucrados en Enfermedades Transmitidas por alimentos. UNIDAD 3: Generalidades sobre Virus. Agentes Infecciosos no convencionales. Docentes Dra. Susana Carnevali de Falke Dra. Maria Claudia Degrossi 1

2 OBJETIVO Diferenciar entre virus y otros microorganismos. Diferenciar entre virus, virión, viroide y prión. Describir la estructura viral y diferenciar entre virus envueltos y desnudos. Entender los mecanismos de multiplicación de los virus animales y bacterianos y sus diferencias. Describir como se cultivan los virus. Comprender la taxonomía viral. Comprender la importancia de los bacteriófagos en la industria de los alimentos y su participación en la virulencia de las bacterias. Describir las Enfermedades Espongiformes Transmisibles tanto en animales como en el hombre. Comprender el mecanismo de infección a través de priones y sus distintas vías. Diferenciar entre Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob y la nueva variante. EJES TEMÁTICOS Generalidades. Características de los virus. Tamaño. Huéspedes. Estructura viral. Multiplicación de los virus. Cultivo de virus. Taxonomía viral. Virus bacterianos Agentes infecciosos no convencionales. Encefalopatías Espongiformes Transmisibles. Virus y viroides vegetales GENERALIDADES Los virus son pequeñas partículas de un tamaño comprendido entre nm, que únicamente pueden ser visualizadas mediante el microscopio electrónico. Los virus ocupan una posición única en biología. Poseen genes, se replican, desarrollan y se adaptan a sus huéspedes particulares, habitats bióticos y nichos ecológicos. Sin embargo los virus no pueden capturar y almacenar energía libre y no son funcionalmente activos fuera de la célula huésped. 2

3 La Comisión Internacional de Taxonomía de Virus (International Committee on Taxonomy of Viruses - ICTV) describe a los virus como: Biosistemas elementales que poseen algunas de las propiedades de los sistemas vivos tales como la presencia de un genoma y que son capaces de adaptarse a cambios del ambiente. Características de los virus Son entidades simples y acelulares, Tienen un solo tipo de ácido nucleico (ADN o ARN), Contienen una cubierta proteica que rodea al ácido nucleico, Pueden tener una envuelta (constituída por lípidos, carbohidratos y proteínas), Poseen pocas o ninguna enzima, Son parásitos intracelulares obligados, Se apoderan de la maquinaria metabólica de la célula huésped para producir más partículas víricas. Tamaño: existen considerables variaciones en cuanto al tamaño de los diferente virus tal como se aprecia en la Figura 1. Huéspedes: Los virus pueden elegir como huésped células de organismos procariotas o eucariotas: Pueden infectar animales, plantas, bacterias (en este caso se denominan bacteriófagos), insectos, hongos. Muestran especificidad hacia el huésped, atacando generalmente a una especie o a veces a ciertas variedades seleccionadas de cultivos 3

4 (plantas), razas (animales) o cepas (bacterias) dentro de una especie. En el hombre, algunos virus sólo atacan a un tipo particular de células. La especificidad está determinada por la presencia de receptores apropiados. En algunos casos los virus cruzan la barrera entre especies. Nos referiremos particularmente a los virus animales y a los bacteriófagos. ESTRUCTURA VIRAL La partícula viral completa se denomina virión, le permite al virus transportarse de una célula a otra. Consiste en: Ácido Nucleico. Puede ser: DNA o RNA; mono o bicatenario; lineal o circular. En algunos virus puede estar segmentado Cápside. Cubierta proteica que envuelve al ácido nucleico para protegerlo. La cápside puede tener tres formas básicas, dependiendo cómo se ordenen las moléculas de proteínas, o unidades de la cápside, denominadas capsómeros: Helicoidal forman cilindros proteicos huecos, que pueden ser rígidos o flexibles, Poliédrica o icosaédrica Compleja pueden tener paredes complejas de múltiples capas rodeando al ácido nucleico (poxvirus) o poseer colas y otras estructuras (muchos bacteriófagos) Los capsómeros pueden estar formados por un solo tipo de proteínas o pueden haber diferentes tipos entre los distintos capsómeros. Cubiertas o envueltas: Presente sólo en algunos tipos de virus. Consiste en una combinación de proteínas, lípidos y carbohidratos. En algunos virus pueden provenir de la membrana de la célula huésped; en otros sus proteínas pueden estar codificadas en parte 4

5 por el genoma vírico y en parte ser componentes normales de la membrana de la célula huésped. La envuelta puede estar o no recubierta de espículas, glicoproteínas complejas que se proyectan hacia fuera en la superficie de la envuelta. Le confiere características especiales, como asociarse a la célula huésped o poder utilizarlas en la identificación de los virus (hemaglutinación). La presencia o no de envueltas permite diferenciar entre: Virus desnudos Virus envueltos MULTIPLICACIÓN DE LOS VIRUS Si bien el virión puede tener algunas enzimas necesarias para su replicación y genes que codifican para componentes estructurales, es el huésped quien le suministra todo lo demás. Esto le permite producir componentes que luego de ensamblados en la estructura adecuada producirán nuevos viriones que escaparán de la célula para infectar otras. En consecuencia, para poder multiplicarse los virus necesitan infectar una célula huésped y adueñarse de su maquinaria biosintética. Una vez dentro, cualquiera sea el tipo de célula huésped elegida, los virus, tanto animales como bacteriófagos, siguen el mismo proceso básico de reproducción viral, que esencialmente consta de las siguientes etapas: Fijación o adsorción: La partícula vírica se adhiere a la célula huésped a través de la interacción de un sitio de fijación del virus con un sitio receptor complementario de la célula huésped. Por ejemplo, en bacterias pueden ser los flagelos o las fimbrias, o componentes de la pared celular o proteínas transportadoras. En los virus animales el sitio de fijación varía de un virus a otro y los sitios receptores son en general proteínas y glicoproteínas de la membrana plasmática. Penetración: La partícula vírica libera su material genético dentro de la célula huésped. Este mecanismo es diferente para virus animales y bacteriófagos. 5

6 Biosíntesis: en esta etapa se produce ácido nucleico y proteínas víricas, para lo cual es necesario un RNA mensajero que sea específico del virus. El modo exacto por el que el virus logra esta síntesis de mrna depende del tipo de virus y de la estructura de su genoma. Maduración: el ácido nucleico y la cápside se ensamblan para formar nuevos viriones. Liberación: los viriones se liberan de la célula huésped. Esto puede ocurrir dependiendo del tipo de virus de diversas maneras: Por lisis de la célula huésped Por gemación: ocurre en los virus con envuelta. La gemación no resulta siempre en muerte celular. Los virus desnudos son liberados a través de ruptura de la membrana plasmática, por lo cual generalmente se produce la muerte celular. Existen diferencias en el modo en que entran y salen de la célula huésped los virus animales y bacteriófagos. CULTIVO DE VIRUS Debido a que los virus son incapaces de replicarse en forma independiente, no pueden ser cultivados de la misma forma que los organismos procariotas (bacterias) o eucariotas. Por lo tanto para su estudio, los virus se cultivan de diversas maneras según su origen. La inducción puede ponerse en marcha por condiciones ambientales. Cultivo de bacteriófagos. El fago se incuba en una suspensión bacteriana que se coloca en forma de capa fina sobre una capa de agar. Tras varios ciclos de multiplicación, se destruyen las células bacterianas infectadas, produciendo placas. Cada fago infecta una bacteria y libera más viriones, que infectan las células de los alrededores y así sucesivamente. Este proceso continúa hasta que la bacteria deja de crecer, impidiendo la multiplicación de los fagos. Cuando todas las células de la región que rodeaba el sitio original de la infección han sido destruidas, se produce una placa o calva de lisis. Por cada virión se producirá una placa. La concentración de la suspensión vírica, se mide en unidades formadoras de placa (UFP) Cultivo de virus animales. Puede hacerse en: Animales vivos ratones, conejos o cobayos. Huevos embrionados. La suspensión viral o del tejido infectado es inyectado en el huevo, a través de un orificio en la cáscara. Dado que hay varias membranas en el huevo 6

7 donde el virus puede desarrollarse, se busca la localización adecuada a los fines que se persigue. El crecimiento vírico puede estar seguido de la muerte del embrión o por la formación en las membranas de las típicas pústulas o lesiones que resultan del crecimiento vírico. Cultivos celulares. TAXONOMÍA VIRAL Debido a la escasez de conocimientos sobre su historia evolutiva, la clasificación de los virus no sigue los lineamientos generales que rigen la de los organismos eucariotas o procariotas. En un principio las propiedades clínicas y patogénicas de los virus, así como sus características ecológicas y de transmisión fueron utilizadas para clasificarlos. Estos parámetros son aún de importancia y son utilizados por el International Code of Diseases. Actualmente la Comisión Internacional de Taxonomía de Virus (ICTV), acepta categorías taxonómicas y sufijos que las identifican, como se indica a continuación: Especie: es un grupo de virus que comparten la misma información genética y el nicho ecológico (rango de huéspedes) Género virus Subfamilia virinae (cuando la compleja relación entre los miembros de una familia así lo exige) Familia viridae Orden - virales No se usan epítetos específicos para los virus, designándolos con nombres descriptivos comunes, por ejemplo virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). Criterios para la Clasificación de Virus. Actualmente los criterios primarios utilizados para diferenciar órdenes, familia y género de virus y para diferenciar entre especies según Van Regenmortel son las siguientes: El tipo y organización del genoma viral (número de genes y mapa genómico) La estrategia utilizada por el virus para su replicación (ej. localización intracelular en la replicación viral; mecanismo de liberación) La estructura del virión (tipo de ácido nucleico (DNA o RNA) 7

8 Conformación del ácido nucleico (número de cadenas, sentido del ARN, segmentación) Simetría de la cápside (icosaédrica, helicoidal) y número de capsómeros en los virus icosaédricos Diámetro del virión Ausencia o no de envuelta y sensibilidad al éter Naturaleza del huésped Tipo de enfermedad que causa y modo de transmisión Tropismo celular y tisular Características antigénicas del virión y respuesta inmune que activa (propiedades inmunológicas) Por ejemplo dentro de la familia Picornaviridae (transmitidos generalmente por vía fecal/oral y rutas aéreas) se encuentra el género Enterovirus (tracto alimentario) que incluye al Poliovirus. Dentro de esta familia también se incluye al Virus de la Hepatitis A. VIRUS BACTERIANOS El estudio de los bacteriófagos reviste significación por su implicancia en numerosos aspectos. Han tenido importancia crítica en el desarrollo de la Biología Molecular, utilizándose actualmente como vectores de clonación, entre otras aplicaciones en este campo. Por otro lado y como veremos mas adelante, los bacteriófagos se utilizan como indicadores de la presencia de enterovirus en aguas residuales y lodos. También constituyen una alternativa eficaz a los antibióticos para el tratamiento de enfermedades bacterianas y herramientas para combatir patógenos en alimentos. A este respecto pueden visitar la siguiente página: Importancia de los bacteriófagos en la industria de los alimentos. La industria láctea utiliza las fermentaciones lácticas para conservar el alimentos y además para conferir a los productos aromas, sabores y texturas deseables. Uno de los problemas más graves a los que se enfrenta, es el ataque de sus cultivos iniciadores o starters por bacteriófagos. Esto puede tener una enorme importancia económica ya que el proceso de fermentación puede retrasarse o detenerse, afectando las características organolépticas del producto elaborado. 8

9 Los fagos en la virulencia: lisis y lisogenia. Algunos bacteriófagos son capaces de integrarse en el cromosoma bacteriano durante largos periodos de tiempo y su material genético se multiplica al mismo tiempo que lo hace el DNA de la bacteria huésped. A esta situación se le conoce como estado de lisogenia, al fago que posee esta propiedad se le denomina fago atemperado o profago y a la bacteria que presenta esta característica biológica se le llama bacteria lisogénica. En contraste, el fago lítico se limita a multiplicar su ácido nucleico, una vez que infecta a la bacteria, para producir nueva descendencia fágica que finaliza con la destrucción de la célula bacteriana y la consecuente liberación de la progenie. Los fagos atemperados contienen algunos genes que pueden expresarse en la bacteria lisogénica y así contribuir a su virulencia y, en algunos casos ser los únicos responsables de la misma. Algunos ejemplos que ilustran esta situación son los casos de la escarlatina y la toxina diftérica. Por otro lado, como veremos más adelante, las toxinas de Clostridium botulinum y Vibrio cholerae son codificadas por fagos. AGENTES INFECCIOSOS NO CONVENCIONALES Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (EET). Las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (EET) pertenecen a un amplio grupo de enfermedades neurodegenerativas en animales y en el hombre, que presentan las siguientes características: Período de incubación largo (meses a años). Enfermedad progresiva y siempre fatal. Alteración espongiforme del SNC. Transmisibles. Ausencia de respuestas inflamatorias e inmunes. Ocurrencia en varias especies que incluyen al ser humano. ENCEFALOPATÍAS ESPONGIFORMES TRANSMISIBLES EN ANIMALES Denominación Huésped EEB Encefalopatía Espongiforme Bovina Ganado vacuno Caquexia Crónica del Ciervo (Chronic Wasting Ciervos, Venados y Alces Disease) Encefalopatía de los ungulados exóticos Antílope FSE Encefalopatía Espongiforme Felina Gatos Scrapie Ovejas y Cabras Encefalopatía Transmisible del Visón Visón 9

10 ENCEFALOPATÍAS ESPONGIFORMES TRANSMISIBLES EN HUMANOS Denominación Características CJD Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob Demencia progresiva presenil y movimientos involuntarios. Se manifiesta alrededor de los 60 años. Su período de incubación es largo, pero la evolución clínica de la enfermedad es breve. FFI Insomnio Fatal Familiar Enfermedad genética autosómica dominante. Profunda atrofia del tálamo. La demencia y los movimientos involuntarios conllevan un progresivo insomnio. Síndrome de Gerstmann-Sträussler-Scheinker Enfermedad Genética. Se manifiesta a edad más temprana que CJD generalmente entre 40 y 50 años. Ataxia y problemas motores. a duración de la enfermedad es mas larga que Kuru en la ECJ oscilando entre 2 y 10 años. Por canibalismo. Ataxia cerebelar, temblores y demencia. El período de incubación puede superar los treinta años, sin embargo, la muerte se suele producir en menos de dos años a partir de la aparición de los primeros síntomas. Nueva variante de CJD (vcjd) Afecta menores de 45 años. Placas amiloideas. 1. Agente etiológico: Las EET son causadas por unas pequeñas partículas proteicas infecciosas, carentes de ácido nucleico llamada priones. Fueron descubiertas y aisladas en 1982, por Standley Prusiner. Esto causó gran desconcierto en la comunidad científica ya que estaba en clara contradicción con el Dogma Central de la Biología. En 1983 se identificó la proteína de los priones, y se la denominó PrP ( Prion Protein''). Prusiner sugirió que una colección de enfermedades cerebrales, algunas genéticas, algunas infecciosas y otras esporádicas, son todas ellas el resultado de un proceso común. En reconocimiento al mérito científico de su teoría de los priones, Prusiner recibió el Premio Nobel de Medicina en La enfermedad es causada por la transformación de una proteína celular (PrP c ) propia de las células normales, en una forma infecciosa denominada PrP sc (sc significa scrapie). 10

11 La proteína prion (PrP) es codificada por un gen localizado en el cromosoma 20 en los humanos que se expresa en las células nerviosas y células de estirpe linfoide y cuya presencia es indispensable para el desarrollo de las formas hereditarias o transmisibles de EET. La PrP c, isoforma celular de la proteína prión (PrP), es una glicoproteína que se mantiene unida a los fosfolípidos de la membrana celular. Existe en la mayoría de las células, aunque predomina en las células del SNC. Posee una estructura rica en hélices alfa y pobre en láminas beta. Durante la enfermedad se produce un cambio conformacional dando lugar a la isoforma PrP sc que tiene mayor cantidad de láminas beta. Esto produce un cambio drástico en sus características físicoquímicas y biológicas. Los priones infectivos son altamente resistentes al calor, las radiaciones ionizantes o ultravioletas y a todo método convencional de desinfección y esterilización. Son resistentes a los procesos digestivos y son preservados por la refrigeración y la congelación. La isoforma PrP sc sustituye a las isoformas normales y se acumula en los tejidos afectados en forma de agregados insolubles (en ocasiones fibrillas amiloides) que son resistentes a la acción de las proteasas, conduciendo a la muerte celular. Esto le da a los tejidos la apariencia de una esponja, de allí el nombre de la enfermedad: encefalopatía espongiforme. Con el paso del tiempo, desde algunos meses hasta varios años, esta destrucción de células nerviosas comienza a manifestarse clínicamente a través de diferentes síntomas e indefectiblemente termina con la muerte del individuo. A pesar de la conformación espacial diferente de ambas proteínas, no existen diferencias en su secuencia de aminoácidos. De allí que no provoquen ninguna respuesta del Sistema Inmune del organismo al no reconocerlas como extrañas. Esto explica la dificultad de desarrollar una prueba de diagnóstico in vivo o de vacunas para prevenir este mal. Las causas que provocan el error en el plegamiento de la PrP c definen las formas descritas de las enfermedades producidas por priones: Formas Esporádicas. Son las que aparecen sin causa aparente y para las que no hay explicación en la actualidad. Formas Infecciosas. Se explican por la interacción de la PrP sc sobre la PrP c lo que provoca su transformación a PrP sc. 11

12 Formas Hereditarias. Provocadas por alteraciones genéticas heredables que facilitan el plegamiento erróneo de la PrP c. 2. EEB Encefalopatía Espongiforme Bovina. Si bien el origen de esta enfermedad en las vacas es objeto de debates, los estudios epidemiológicos y el conocimiento acumulado hasta la fecha, permiten deducir que la aparición de BSE se originó en la exposición de los bovinos a una fuente común, la harina de carne y huesos suministrada como fuente de proteína en alimentos balanceados, contaminada con el agente del Scrapie de las ovejas. Los cambios en el procesamiento de las harinas al eliminar la utilización de solventes y la supresión de etapas del proceso que incluían tratamientos térmicos para inactivar el agente del Scrapie, permitió posiblemente el incremento en los títulos del agente infeccioso en los productos proteínicos obtenidos. 3. Nueva variante de la Enfermedad de Creutzfeld-Jacob (vcjd). La alarma sobre esta enfermedad se produjo cuando en 1996 se encontraron evidencias de relación epidemiológica de la EEB con la denominada nueva variante de Creutzfeldt Jacob (v-ecj), transformándose en una zoonosis de importancia en salud pública. Esto originó una crisis de confianza frente al consumo de carne de bovinos y desestabilizó especialmente en Europa el comercio y consumo de este alimento básico, a la vez, que ha causado pánico entre los consumidores del mundo entero. A diferencia de la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, la nueva variante tiene un inicio más temprano (entre 16 y 48 años), afecta el sistema nervioso central y daña la función cerebral. Generalmente comienza con depresión, hay signos psiquiátricos, inestabilidad, dificultad para caminar, movimientos involuntarios, postración y muerte. La principal vía de transmisión es la oral digestiva, aunque se consideran como posibles también la transmisión iatrogénica, la materno fetal, por el contacto a través de piel o mucosas y transfusional. Transmisión por el consumo de alimentos: La enfermedad se contrae cuando una persona ingiere productos de bovinos infectados por EEB. 12

13 VIRUS Y VIROIDES VEGETALES 1. Virus de las plantas. Los virus originan gran variedad de enfermedades en las plantas y daños serios en los cultivos. Algunos ejemplos son enfermedades causadas por el virus del mosaico del tabaco, el virus del mosaico de las judías (en habas), el virus enano amarillo de la papa, entre otros. Afectan el desarrollo de la planta causando, por ejemplo, cambios de color o crecimiento deforme. Tienen una estructura similar a los virus animales. 13

14 Dado que los vegetales tienen paredes celulares rígidas que los virus no pueden atravesar, utilizan para su ingreso mecanismos diferentes a los ya vistos para virus animales y bacterianos, tal como se aprecia en la figura Viroides. Son agentes infecciosos de plantas, causando serios problemas económicos. Son pequeñas moléculas de RNA monocatenario que contienen entre 246 a 401 nucleótidos. La forma extracelular de un viroide es el RNA desnudo, sin cápsida de ningún tipo. Esta molécula de RNA no contiene genes que codifique proteína, por lo que el viroide depende totalmente de las funciones del huésped para su replicación. Las infecciones causadas por viroides, como las que se aprecian en la Figura 8, ocasionadas por el viroide del tubérculo ahusado de la papa, o el viroide de la piel cicatrizada de la manzana, producen importantes pérdidas económicas que pueden llegar a ser devastadoras. 14

15 LECTURA OBLIGATORIA Capítulo 13 Virus, viroides y priones del libro Introducción a la Microbiología de Tórtora- Funke-Case. Encefalopatías Espongiformes Transmisibles. Accesible en: BIBLIOGRAFÍA 1. Büchen-Osmond C. (2003). Taxonomy and Classification of Viruses. In: Manual of Clinical Microbiology, 8th ed, Vol 2, p , ASM Press, Washington DC 2. Ingraham, J. L.;Ingraham, C.A. Introducción a la Microbiología (Vol I y II), Editorial Reverté, Barcelona, España 3. Madigan M.T., Martinko J.M.,Parker J. Brock. Biología de los Microorganismos Ed. Pearson Alhambra. 10ª. Edición. 4. Mossel, D. A. A.; Moreno, B.; Struijk C. B. Microbiologia de los Alimentos Editorial Acribia. 2ª. Edición. 5. Prescott,L.M.; Harley,J.P.; Klein, D.A. Microbiología. 1999, McGraw Hill-Interamericana. Madrid, España 6. Tortora, G.J., Funke, B. R., Case, C.L. Introducción a la Microbiología Editorial Médica Panamericana, 9ª.Edición. 7. van Regenmortel, M.H.V.; Mahy, B. W.J. Emerging Issues in Virus Taxonomy. Emerging Infectious Diseases Vol. 10, No. 1, January ACTIVIDADES 1. Distinga y compare desde el punto de vista estructural y del hospedador entre: virión, prion, viroide, bacteriófago. 2. Señale las principales diferencias entre la taxonomía bacteriana y la de los virus. Qué criterios se emplean en esta última? 3. Distinga entre: cápside y envuelta; fago lítico y atemperado; virus desnudo y envuelto. 4. Qué similitudes y diferencias encuentra Ud. entre las diferentes etapas de la replicación de virus animales y virus bacterianos. 5. Cómo se estudian los virus animales? Y los bacterianos? Qué es una calva de lisis? 15

16 6. Cuál es la importancia de los fagos en la industria alimentaria? Y cómo alternativas al uso de antibióticos? 7. Vibrio cholerae solo es capaz de causar enfermedad cuando es lisogénica. Qué significa esto? 8. Respecto a las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles: Cuál fue el evento que desató la investigación sobre el mal de las vacas locas en humanos? Cuáles son las hipótesis propuestas? Distinga y compare entre CJD y vcjd respecto al origen, vía de transmisión e importancia epidemiológica. Investigue qué actividades realizan SENASA y ANMAT para su prevención y control. 16