EVALUACIÓN DE LA SEGURIDAD DEL MAÍZ ROUNDUP READY,EVENTO NK603

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1 Cuaderno Técnico nº 5 EVALUACIÓN DE LA SEGURIDAD DEL MAÍZ ROUNDUP READY,EVENTO NK603 Monsanto Agricultura España, S.L. Avda. de Burgos, 17-10ª plta Madrid Tel Fax

2 2002 Monsanto Agricultura España, S.L. Versión española revisada por J. Costa y C. Novillo Con la colaboración científica de la Dra. Montaña Cámara Hurtado Departamento de Nutrición y Bromatología II Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid Imprime: Artes Gráficas G3, S.A. Depósito Legal: 43711/2001

3 INDICE Resumen...3 Introducción...5 Caracterización molecular del maíz Roundup Ready NK Niveles de proteína CP4 EPSPS en las plantas de maíz NK Evaluación de la seguridad de las proteínas CP4 EPSPS en el maíz NK Análisis de composición y valor nutritivo del maíz NK Evaluación medioambiental del maíz NK Conclusiones...39 Referencias...40 Anejo 1. Sensibilidad de la flora arvense a algunos herbicidas del maíz...47 Anejo 2. Resumen de datos sobre glifosato de Monsanto...48 Anejo 3. Qué es la agricultura de conservación?...50

4 3 RESUMEN Mediante la utilización de modernas técnicas de biotecnología, Monsanto ha desarrollado la línea de maíz Roundup Ready con tolerancia al herbicida Roundup mediante la producción de la proteína CP4 5- enolpiruvilsikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), tolerante al glifosato. El glifosato, ingrediente activo del herbicida agrícola Roundup, elimina las plantas inhibiendo la enzima EPSPS. Esta enzima cataliza un paso fundamental en la ruta del ácido sikímico, dentro de la biosíntesis de los aminoácidos aromáticos en plantas y microorganismos. La inhibición de esta enzima por el glifosato da lugar a una deficiencia en el crecimiento de las plantas. Las proteínas CP4 EPSPS tienen una baja afinidad por el glifosato, en comparación con las enzimas EPSPS. Por lo tanto, cuando se trata a las plantas de maíz Roundup Ready con el glifosato, éstas siguen creciendo. La acción continua de la enzima CP4 EPSPS tolerante, proporciona a la planta los aminoácidos aromáticos necesarios. Los animales no presentan esta biosíntesis de aminoácidos aromáticos, lo que explica la acción selectiva del glifosato sobre plantas y la baja toxicidad del glifosato para mamíferos. Para obtener el maíz Roundup Ready evento NK603 se introdujeron dos copias del gen cp4 epsps en el genoma del maíz. El gen cp4 epsps, que deriva de la cadena CP4 de la bacteria común Agrobacterium spp., codifica la proteína natural EPSPS tolerante a Roundup. La seguridad del evento NK603 de maíz Roundup Ready para alimentación humana y animal se ha establecido basándose en: la evaluación de la actividad de la proteína CP4 EPSPS y su semejanza a proteínas EPSPS presentes en una serie de plantas, incluidas aquellas utilizadas en alimentación; la baja exposición a la proteína CP4 EPSPS en la dieta y su rápida digestibilidad; y que ninguna proteína EPSPS es tóxica o alergénica, como indican los estudios de seguridad realizados sobre las proteínas CP4 EPSPS. Se ha demostrado la equivalencia nutricional y composicional del maíz evento NK603, en comparación con el maíz convencional, mediante el análisis de los nutrientes principales, incluyendo proteínas, grasa, carbohidratos, humedad, aminoácidos, ácidos grasos y minerales. La equivalencia del valor nutritivo del maíz evento NK603 en comparación Roundup y Roundup Ready son marcas registradas de Monsanto.

5 4 CUADERNO TÉCNICO Nº5 5 con el maíz convencional se realizó mediante la evaluación del rendimiento en pollos broiler y ratas con estudios de alimentación que incluían evaluaciones clínicas e histológicas. El impacto medioambiental del maíz Roundup Ready es comparable al del maíz convencional. La germinación espontánea de maíz tolerante al Roundup es poco frecuente y fácil de controlar en los campos de cultivo. Los resultados de todos estos estudios demuestran que el maíz evento NK603 es equivalente al maíz tradicional en lo que se refiere a la seguridad de su uso como alimento o pienso y en cuanto a la seguridad para el medio ambiente. INTRODUCCIÓN La producción agrícola actual se basa en el cultivo de un número reducido de especies vegetales, domesticadas por el hombre a lo largo de muchos siglos. Esta domesticación consiste en una serie de cambios que el hombre ha seleccionado de forma empírica, seguidas de nuevas modificaciones buscadas y obtenidas mediante cruzamientos dirigidos, hibridaciones y mutaciones. En el caso del maíz, sabemos que procede del teosinte, una planta nativa de Centroamérica, y después de un largo proceso de modificación la longitud de la mazorca ha pasado de 2,5 cm a unos 30 cm y el número de granos de cada mazorca ha pasado de 60 a 500 (APBG, 2002). La producción eficiente de maíz depende actualmente de que el cultivo pueda crecer libre de la competencia de malas hierbas, y esto se consigue en la gran mayoría de los casos, gracias a la aplicación oportuna de herbicidas autorizados. Los herbicidas actualmente autorizados en España tienen que ser bien tolerados por el cultivo para que no disminuya la producción, pero por la misma razón, es frecuente que distintas especies de malas hierbas escapen a sus efectos (ver anejo 1). Por ello, es frecuente que el agricultor necesite aplicar mezclas de herbicidas autorizados y/o recurra a aplicaciones repetidas, antes de que el desarrollo de la vegetación espontánea perjudique el desarrollo del cultivo. Mediante la utilización de las modernas técnicas de biotecnología, Monsanto ha desarrollado líneas de maíz híbrido Roundup Ready con tolerancia al glifosato, ingrediente activo del herbicida Roundup, mediante la producción de proteínas 5-enolpiruvilsikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), que confieren tolerancia natural al herbicida glifosato. La enzima EPSPS está presente en la ruta del ácido sikímico para la biosíntesis de aminoácidos aromáticos en plantas y microorganismos. La inhibición de esta enzima por el glifosato da lugar a una deficiencia en la producción de aminoácidos aromáticos y a una inhibición del crecimiento de las plantas. La ruta de aminoácidos aromáticos no está presente en las formas de vida de los mamíferos, aves o fauna acuática, lo que explica la acción selectiva del glifosato en plantas y su baja toxicidad en mamíferos. El uso del herbicida Roundup en el control efectivo de las malas hierbas alrededor de las plantas de maíz que contienen el gen Roundup Ready, permite al agricultor controlar con gran eficacia las malas hierbas y beneficiarse de las favorables características

6 6 CUADERNO TÉCNICO Nº5 7 medioambientales y de seguridad de este herbicida (U.S. EPA, 1993; WHO, 1994; Giesy et al., 2000; Williams et al., 2000). La Agencia de Protección del Medio Ambiente Americana (EPA) ha clasificado al glifosato en la Categoría E (evidencia de no ser carcinogénico para humanos) (U.S. EPA, 1992). Además, la Organización Mundial de la Salud estableció en 1994 que el glifosato no es carcinogénico, mutagénico ni teratogénico (WHO, 1994). El maíz Roundup Ready ofrece a los agricultores una herramienta adicional para mejorar el control de las malas hierbas. El uso del maíz Roundup Ready ofrece: Control de un amplio espectro de malas hierbas. El herbicida Roundup controla gramíneas y dicotiledóneas, incluso las especies difíciles de eliminar (Franz et al., 1997). Excelente seguridad para el cultivo. Si se utiliza siguiendo las recomendaciones del etiquetado, el herbicida Roundup aplicado sobre los campos de maíz Roundup Ready controla las malas hierbas sin dañar el cultivo. Mínimo impacto medioambiental. El herbicida Roundup lleva utilizándose desde hace 30 años en diversas situaciones. El glifosato, ingrediente activo del herbicida Roundup, es conocido por no ser persistente, por presentar un bajo riesgo de contaminación de aguas subterráneas, y por no ser tóxico para aves, mamíferos, peces e invertebrados (Ahrens, 1994; Franz et al, 1997; Giesy et al, 2000). Flexibilidad para tratar las malas hierbas. Dado que el herbicida Roundup se aplica sobre el follaje de las malas hierbas, tras haber emergido el cultivo, sólo habrá que tratar cuando y donde la infestación llegue a un grado que amenace la producción. Altamente compatible con Control Integrado de Plagas y con las técnicas de conservación del suelo. Son muchos los beneficios que se derivan del uso de la agricultura de conservación (foto 1; anejo 3), destacando entre otros: mejora de la calidad del suelo, mejora de la infiltración del agua, reducción de la erosión del suelo y de la sedimentación de las fuentes acuíferas, disminución del arrastre de nutrientes y fitosanitarios a las aguas superficiales, mejora del hábitat silvestre, aumento de la retención de carbono en el suelo, reducción de la utilización de combustibles e impulso de las prácticas agrícolas sostenibles (Warburton y Klimstra, 1984; Edwards et al., 1998; Hebblethwaite, 1995; Reicosky y Lindstrom, 1995; Keeling et al, 1998; CTIC, 1998; CTIC, 2000). Control de malas hierbas a un coste asequible. El coste de controlar las malas hierbas con el herbicida Roundup es competitivo frente al de otros sistemas de control alternativos, especialmente si se considera la amplia eficacia de Roundup. Tanto los pequeños agricultores como las grandes explotaciones pueden beneficiarse del uso de esta tecnología. Un nuevo modo de acción herbicida para el control de malas hierbas de maíz en el periodo de cultivo. El herbicida Roundup sólo puede utilizarse en presiembra, y en algunos casos en precosecha, en aquellos cultivos que no dispongan de la modificación genética Roundup Ready. El uso de un herbicida con bajo riesgo para la seguridad humana. En las condiciones de uso actuales (aprobadas por las autoridades de registro), el herbicida Roundup presenta un riesgo mínimo para la salud humana (U.S. EPA, 1993;WHO, 1994;Williams et al, 2000). Foto 1. Campo de maíz en agricultura de conservación (Anejo 3).

7 8 CUADERNO TÉCNICO Nº5 9 El primer maíz Roundup Ready (Evento GA21) se comercializó en Estados Unidos en 1998 y en Canadá en Varios ensayos demostraron que el maíz Roundup Ready es equivalente al maíz convencional en términos de seguridad, valor nutritivo, composición e impacto medioambiental (Sidhu et al., 2000). El evento de maíz Roundup Ready GA21 utiliza la proteína mepsps para conferir la tolerancia al glifosato,mientras que el evento NK603 contiene la proteína CP4 EPSPS.Este nuevo evento NK603 se comercializó, tanto en Estados Unidos como en Canadá, en El evento NK603 se seleccionó en campos de ensayo según parámetros agronómicos y tolerancia al herbicida Roundup Ready. En estos ensayos de campo, establecidos desde 1997, que incluyen una gran diversidad de ámbitos geográficos no se han encontrado diferencias fenotípicas, excepto en la tolerancia al glifosato, lo que demuestra que el maíz evento NK603 y su progenie no presentan diferencia alguna con el maíz desarrollado por métodos tradicionales, excepto en la cualidad específica introducida. La utilización del herbicida Roundup en el maíz Roundup Ready favorece un mayor control de las malas hierbas por parte del agricultor y ofrece mayores beneficios medioambientales para la población. Este informe incluye una evaluación de la seguridad de las proteínas CP4 EPSPS que se encuentran en el evento NK603, basándose tanto en la caracterización y mecanismo de acción de estas proteínas,como en su comparación con las enzimas EPSPS que habitualmente se encuentran en una amplia gama de alimentos con un amplio historial de uso seguro. Además, se pueden comparar las proteínas CP4 EPSPS con las encontradas en la soja Roundup Ready y otros cultivos Roundup Ready, consumidos con seguridad por humanos y animales. Se llevaron a cabo estudios adicionales que proporcionaron datos que apoyan la seguridad de estas proteínas CP4 EPSPS, como (1) la ausencia de toxicidad aguda de las proteínas CP4 EPSPS, determinada en un estudio de alimentación de ratones, (2) la rápida digestión de estas proteínas en ácidos gástricos y fluidos intestinales simulados, (3) ausencia de parecido de las proteínas CP4 EPSPS con toxinas proteicas conocidas y (4) ausencia de potencial alergénico. Estos datos apoyan la evaluación de seguridad de las proteínas CP4 EPSPS y, junto con los otros análisis desarrollados sobre el evento NK603, demuestran la equivalencia de composición y valor nutritivo, y por lo tanto, apoyan la conclusión de que el maíz evento NK603 es tan seguro y nutritivo como el maíz comercial convencional. Estas evaluaciones fueron desarrolladas utilizando los principios establecidos por organismos internacionales independientes, tales como la Organización para la Cooperación y Desarrollo Económico (OCDE), la Organización Mundial de la Salud (WHO) y la FAO, Organización para la Agricultura y Alimentación (OCDE, 1993; WHO, 1995; WHO/FAO, 1996), y que están de acuerdo con la reglamentación específica de países como Estados Unidos, Canadá, Unión Europea y otros. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL MAÍZ ROUNDUP READY NK603. La genética del maíz ha sido ampliamente estudiada durante casi 100 años. Últimamente, la genética molecular ha permitido elaborar mapas genéticos más completos del maíz. Por este motivo, es uno de los cultivos mejor caracterizados. El maíz se ha empleado en la investigación de cultivos de tejidos, en la mejora vegetal usando marcadores moleculares, en el estudio de transposones para la identificación de genes, y en estudios de variabilidad genética. El maíz evento NK603 se obtuvo tras la introducción de dos secuencias codificadoras cp4 epsps, en tejido embrionario de maíz de una línea parental designada AW x CW, mediante aceleración de partículas (Klein et al.,1987; Gordon-Kamm et al., 1990). El fragmento de restricción Mlu I utilizado para la transformación contenía dos cassettes adyacentes de expresión génica en la planta, cada uno con una copia sencilla del gen cp4 epsps,y se obtuvo a partir del plásmido PV-ZMGT32 (Figura 1). En uno de los cassettes, la secuencia codificadora cp4 epsps está regulada por el promotor actina del arroz y por el intrón actina del arroz, y contiene la secuencia de poliadenilación nos 3. En el segundo cassette, la secuencia codificadora cp4 epsps está regulada por el promotor 35S mejorado del virus del mosaico de la coliflor CaMV con una región duplicadora mejorada, un intrón del maíz hsp70 y la secuencia de poliadenilación nos 3. En ambos cassettes, las secuencias codificadoras cp4 epsps están unidas a la secuencia del péptido de tránsito (CTP2) del cloroplasto, según las secuencias aisladas de la EPSPS de Arabidopsis thaliana. El CTP dirige la proteína CP4 EPSPS al cloroplasto, localización de la EPSPS en plantas y el lugar donde se desarrolla la biosíntesis de los aminoácidos aromáticos (Kishore y Shah, 1988). Los péptidos de tránsito CTPS suelen escindirse de la proteína madura una vez que la han conducido al cloroplasto (Della-Cioppa et al., 1986). Después de la modificación celular, se seleccionaron los transformantes capaces de sobrevivir y crecer en presencia de glifosato. A partir de los callos embriogénicos, se generaron plantas R0, introduciendo los callos en un medio que estimulaba la producción de vástagos y raíces.

8 10 CUADERNO TÉCNICO Nº5 11 Figura 1. Mapa del plásmido PV-ZMGT32 usado en la producción del maíz Roundup Ready evento NK603. Mi I 6856 Eco RI 6838 Eco RV 6828 Eco RI 6562 Sac I 6560 Nco I 8388 or NOS 3 nptii CP4 EPSPS CTP2 Nco I 4957 Xba I 4937 Sca I 4704 Mlu I 149 Eco RV 169 Eco RI 579 P-ract1 PV-ZMGT pb Z HSP70 intron ract1 intron CTP2 CP4 EPSPS NOS 3 e35s Sac I 1098 Eco RV 4010 Xba I 4232 Nco I 1607 Sac I 3210 Eco RI 3212 Fragmento de restricción usado en la transformación Los estudios moleculares demostraron que las plantas de maíz Roundup Ready contienen un único inserto de ADN. Este inserto de la variante NK603 está compuesto por: Una copia sencilla completa del ADN lineal del PV-ZMGT32 usada para la transformación; Los dos cassettes CP4 EPSPS, dentro del inserto, intactos; Fragmento de ADN con 217 pares de bases, que contiene un fragmento de la región mejoradora del promotor actina del arroz, inversamente unido en el extremo 3 del ADN insertado. La secuenciación del ADN insertado en el evento NK603 confirmó los datos moleculares que se detallan a continuación. La secuencia nucleotídica del inserto demostró que la región codificadora cp4 epsps regulada por el promotor actina del arroz era la esperada. Sin embargo, la región codificadora cp4 epsps regulada por el promotor E35S tenía dos nucleótidos cambiados, uno de los cuales provoca un cambio de leucina por prolina en la posición 214 de la proteína. La proteína CP4 EPSPS que contenía este cambio se denominó CP4 EPSPS L214P. El otro nucleótido cambiado no provocó ninguna modificación en la secuencia aminoacídica. Las técnicas de PCR y de secuenciación de ADN verificaron los extremos 5 y 3 del inserto en el maíz evento NK603. Asímismo se confirmó que las secuencias que flanqueaban a la secuencia del inserto pertenecían al maíz nativo. Mediante análisis western blot, se confirmó la expresión completa de la proteína CP4 EPSPS en las plantas de maíz NK603. Como se suponía, no existía diferencia alguna entre las dos proteínas CP4 EPSPS, estudiadas mediante análisis western blot usando los anticuerpos policlonales disponibles, ya que las dos proteínas son esencialmente idénticas. Estos datos apoyan la conclusión de que el inserto en el evento NK603 sólo codifica estas dos proteínas CP4 EPSPS completas. Además de los dos cassettes completos cp4 epsps, el evento de maíz NK603 posee un fragmento de 217 pares de bases de ADN que contiene parte de la región mejorada del promotor actina del arroz en el extremo 3 del ADN insertado, en dirección inversa a los cassettes cp4 epsps. Se llevaron a cabo análisis de transcripción inversa PCR-RT sobre la unión 3, entre el inserto NK603 y las secuencias genómicas adyacentes del maíz, para comprobar la actividad transcripcional. Los resultados de este análisis demostraron que la transcripción del ARNm se iniciaba en cualquiera de los dos promotores del inserto del NK603, procedía a través de la secuencia de poliadenilación del NOS 3 y continuaba en el ADN del genoma del maíz adyacente al extremo 3 del inserto. Este hecho no era inesperado ya que la terminación incompleta o la utilización de un lugar de terminación alternativo, con la consiguiente producción de múltiples transcritos, ha sido descrita para los genes endógenos de las plantas (Rothnie, 1996; Hunt, 1994; Gallie, 1993) y de maíz (Dean et al., 1986). Según la estructura de la secuencia codificadora cp4 epsps, los elementos genéticos de su alrededor y la naturaleza de la maquinaria de

9 12 CUADERNO TÉCNICO Nº5 13 producción de proteínas de la planta, cualquier transcrito mayor que el de la longitud completa podría producir una proteína CP4 EPSPS mayor que la propia proteína de longitud completa, o la propia proteína CP4 EPSPS completa. En el western blot no se detectaron proteínas CP4 EPSPS mayores de la longitud completa. Sólo se encontró una proteína CP4 EPSPS completa. Por lo tanto, se concluyó que en el evento de maíz NK603 sólo se producen proteínas EPSPS de longitud completa. Se ha comprobado que el inserto CP4 EPSPS tiene una herencia de tipo mendeliano, para un único loci. La estabilidad del inserto se ha demostrado durante más de nueve generaciones de cruzamientos y una de autopolinización. Además, la descendencia del maíz evento NK603 se ha comprobado en múltiples campos de ensayo en Estados Unidos desde 1997 y en la Unión Europea desde No se ha detectado ninguna inestabilidad en el inserto de ADN durante las pruebas de campo y producción comercial del evento NK603. NIVELES DE PROTEÍNA CP4 EPSPS EN LAS PLANTAS DE MAÍZ NK603. Se analizaron muestras de grano y forraje del maíz evento NK603, mediante ensayos ELISA (Harlow y Lane, 1988) y western blot (Matsudaira, 1987), métodos desarrollados y optimizados para estimar los niveles de proteínas CP4 EPSPS en forraje y granos de maíz. Los datos que se obtuvieron vienen representados en la Tabla 1. Se detectaron proteínas CP4 EPSPS en las muestras de maíz NK603, y como se esperaba, no se detectaron en las líneas de maíz testigo no modificado. La cantidad media de proteína CP4 EPSPS en el forraje de maíz fue de 25.6 µg/g peso fresco. La cantidad media de la proteína CP4 EPSPS en el grano de maíz del evento NK603 fue de 10.9 µg/g. Los bajos niveles de expresión de proteína CP4 EPSPS en el evento NK603 son suficientes para conferir tolerancia a los herbicidas Roundup Ready. Estos datos se refieren a una combinación de las proteínas CP4 EPSPS y CP4 EPSPS L124P, ya que ambas son indistingibles con los anticuerpos utilizados en estos ensayos. Tabla 1. Resumen de los niveles de proteína CP4 EPSPS medidos por ELISA en tejidos de maíz NK603 (µg/g peso fresco) Forraje a, c Grano b, c Parámetro (µg/g peso fresco) (µg/g peso fresco) Media Rango DS DS = Desviación típica. alímite de cuantificación = 0.05 µg/g peso fresco. blímite de cuantificación = 0.09 µg/g peso fresco. clos valores de todas las muestras testigo no-transgénicas estaban por debajo del límite de cuantificación del ensayo.

10 14 CUADERNO TÉCNICO Nº5 15 EVALUACIÓN DE LA SEGURIDAD DE LAS PROTEÍNAS CP4 EPSPS EN EL MAÍZ NK603. La evaluación de la seguridad de las proteínas CP4 EPSPS expresadas en el evento de maíz NK603 incluye: la caracterización de la proteína (demostrando la ausencia de similitudes con alergenos conocidos o toxinas); un largo historial de consumo seguro de proteínas similares; digestibilidad in vitro; y la ausencia de toxicidad oral aguda de las proteínas CP4 EPSPS, en ratones. La proteína CP4 EPSPS expresada en el evento de maíz NK603 es idéntica a la proteína encontrada en la soja, canola (colza de primavera) y algodón Roundup Ready, con un amplio historial de consumo seguro, tanto humano como animal. La proteína CP4 EPSPS L214P tan sólo difiere en un aminoácido en la posición 214. El estudio analítico detallado y un análisis tridimensional de las proteínas CP4 EPSPS y CP4 EPSPS L214P mostraron que las dos proteínas son estructural y funcionalmente equivalentes. Se demostró que la proteína CP4 EPSPS L214P tiene una actividad funcional equivalente a la CP4 EPSPS, que no hay similitud en la secuencia aminoacídica con toxinas y alergenos, que se digiere rápidamente in vitro y que su estructura tridimensional es prácticamente indistinguible de la proteína CP4 EPSPS. Caracterización de las proteínas CP4 EPSPS y CP4 EPSPS L214P e historial de consumo en el ámbito de la seguridad alimentaria. La proteína CP4 EPSPS que se produce en el maíz Roundup Ready, es similar, funcionalmente hablando, a diversas familias de proteínas EPSPS que se encuentran en alimentos y piensos derivados de plantas y de fuentes microbianas (Levin y Sprinson, 1964; Harrison et al., 1996). Para la síntesis de aminoácidos aromáticos se necesitan las proteínas EPSPS. La relación estructural entre proteínas CP4 EPSPS, CP4 EPSPS L214P y EPSPS encontradas en alimentos se demuestra mediante la comparación de las secuencias aminoacídicas con residuos activos de identidad conservados y la conformación estructural tridimensional basada en la similitud de las secuencias aminoacídicas; la equivalencia estructural y funcional de las proteínas CP4 EPSPS y CP4 EPSPS L214P se basó en la demostración de la aparición espontánea de residuos de prolina de forma natural en posiciones cercanas a la 214; además, la utilización de modelos de la estructura cristalina conocida por rayos X, demostró que la sustitución L214P no altera ni la estructura secundaria ni terciaria de la proteína CP4 EPSPS. También se comprobó la equivalencia en la actividad enzimática de ambas proteínas; generalmente el bucle variable que contiene la sustitución de la prolina no es relevante en la actividad enzimática de las proteínas EPSPS. Por otra parte, se ha comprobado que el dominio de la proteína CP4 EPSPS que contiene la sustitución de la prolina es muy heterogéneo con respecto a todas las proteínas EPSPS conocidas. Evaluación de la similitud de la secuencia de las proteínas CP4 EPSPS y CP4 EPSPS L214P con proteínas tóxicas conocidas. Los efectos potencialmente tóxicos de las proteínas pueden ser deducidos mediante la comparación de la secuencia de aminoácidos de la proteína introducida con la de las toxinas conocidas. Las proteínas homólogas derivadas de un ancestro común tendrán una alta similitud estructural en la secuencia de aminoácidos y a menudo, compartirán funciones comunes. Por lo tanto, el primer paso para evaluar la toxicidad potencial de las proteínas es valorar la similitud de la secuencia con las de toxinas conocidas. La homología se determina comparando el grado de similitud de aminoácidos entre proteínas, utilizando criterios establecidos (Doolittle, 1990). Cuando se ha identificado la homología con las toxinas conocidas, se evalúan las implicaciones estructurales y funcionales mediante experimentación. Cuando no existe homología se utiliza una evaluación general de toxicidad oral, como se describe a continuación. La evaluación bioinformática de las proteínas CP4 EPSPS y CP4 EPSPS L214P muestra que estas proteínas son sólo semejantes a las proteínas de la familia del género EPSPS, y no a otras toxinas o proteínas farmacológicamente activas identificadas en distintas bases de datos de secuencias proteicas, como PIR, EMBL, SwissProt y GenBank. Digestión de las proteínas CP4 EPSPS y CP4 EPSPS L214P en fluido gástrico e intestinal simulado. Para evaluar la susceptibilidad de las proteínas CP4 EPSPS y CP4 EPSPS L214P a la digestión proteolítica, se utilizaron mezclas de fluidos gástricos e intestinales simulados de mamíferos in vitro. Una rápida degradación de las proteínas se correlaciona con una exposición limitada en el tracto gastrointestinal, y por lo tanto, con una baja probabilidad de que estas proteínas puedan actuar como alergenos alimenticios. El método de preparación de las soluciones simuladas de digestión utilizadas se describen en la Farmacopea Americana (1995).

11 16 CUADERNO TÉCNICO Nº5 17 Las proteínas CP4 EPSPS se degradaron rápidamente en sus componentes en el sistema digestivo in vitro (Harrison et al., 1996). A partir de los datos obtenidos en los análisis western blot se ha demostrado que la proteína CP4 EPSPS deja de detectarse en el sistema gástrico al cabo de 15 segundos y en menos de 10 minutos en el sistema intestinal simulado. De igual modo, la proteína CP4 EPSPS L214P tuvo una vida media inferior a 15 segundos en el fluido gástrico simulado. Por ello, si quedase algo de proteína CP4 EPSPS después de haber pasado por el sistema gástrico, sería rápidamente degradada en el intestino. Es muy poco probable que las proteínas que se digieren rápidamente produzcan una nueva toxicidad o alergenicidad, y éstas son comparables a otras proteínas seguras de la dieta (Astwood et al, 1996; Astwood y Fuchs, 2000). Evaluación de la toxicidad oral aguda de la proteína CP4 EPSPS en ratones. Hay pocas proteínas que cuando se ingieren son tóxicas, y aquellas que si lo son, muestran una toxicidad de tipo agudo (Sjoblad et al., 1992). Para evaluar cualquier toxicidad potencial asociada a las proteínas CP4 EPSPS, se realizaron pruebas de administración oral aguda en ratones (Harrison et al., 1996). Se administraron dosis por vía oral de hasta 572 mg/kg de proteína CP4 EPSPS a ratones y no se encontraron efectos adversos relacionados con el tratamiento. Los resultados de este estudio demostraron que la proteína CP4 EPSPS no posee toxicidad aguda sobre mamíferos. Esta afirmación era la esperada, ya que la proteína CP4 EPSPS se degrada rápidamente en el tracto gastrointestinal in vitro y pertenece a una familia de proteínas con un amplio historial de consumo seguro. Evaluación de la alergenicidad potencial de las proteínas CP4 EPSPS y CP4 EPSPS L214P La mayoría de los alergenos alimentarios son proteínas naturales. A pesar de que ingerimos grandes cantidades de proteínas en la dieta cada día, apenas unas pocas de éstas provocan reacciones alérgicas (Taylor, 1992). Aunque no haya bioensayos predictivos disponibles para evaluar la alergenicidad potencial de las proteínas en humanos (U.S. FDA, 1992), la comparación con alergenos proteicos conocidos proporciona una base para la evaluación de la alergenicidad potencial.además, se han de tener en cuenta otros factores que contribuyen a la alergenicidad de las proteínas ingeridas por vía oral, como son la exposición, la estabilidad en la digestión, prevalencia de los alimentos, y el patrón de consumo (cantidades) de ciertos alimentos (Metcalfe et al., 1996; Kimber et al., 1999). La estabilidad de la digestión gastrointestinal, especialmente la estabilidad a las proteasas ácidas, como la pepsina estomacal, juega un papel fundamental dentro de la alergenicidad sistémica de ciertas proteínas alimentarias (Astwood et al., 1996; Astwood y Fuchs, 1996; Fuchs y Astwood, 1996; FAO, 1995; Kimber et al., 1999). Importantes alergenos proteicos tienden a ser estables a la digestión péptica y en las condiciones de ph ácido del estómago y si alcanzan la mucosa intestinal, pueden desencadenar una respuesta inmunitaria. Como se ha mencionado anteriormente, la evaluación in vitro de la digestibilidad de las proteínas CP4 EPSPS y CP4 EPSPS L214P determinó que estas proteínas se digerían rápidamente. Otro factor significativo que contribuye a la alergenicidad de ciertas proteínas es su alta concentración en los alimentos (Taylor et al., 1987;Taylor, 1992, Fuchs y Astwood, 1996). Muchos alergenos se encuentran en ciertos alimentos como componente proteínico mayoritario, llegando a representar del orden del 2-3% hasta el 80% del total de las proteínas presentes (Fuchs y Astwood, 1996). Las proteínas CP4 EPSPS se encuentran a niveles realmente bajos, representando aproximadamente un 0.01% del total de las proteínas presentes en el grano del maíz Roundup Ready,. También es importante establecer que las proteínas no representan por si mismas un alergeno previamente descrito y que no comparten segmentos con la misma secuencia de aminoácidos o estructuras con potencial reacción cruzada con un alergeno conocido. Una forma eficaz para evaluar si las proteínas añadidas son alergenos o pueden contener estructuras con reacción cruzada es comparar la secuencia de aminoácidos con todos los alergenos conocidos. Existen numerosas bases de datos, a disposición general, de las secuencias aminoacídicas relacionadas con alergias y enfermedad celíaca (GenBank, EMBL, PIR y SwissProt). Se comparó la secuencia de las proteínas CP4 EPSPS y CP4 EPSPS con las secuencias de las bases de datos, sin encontrar ninguna semejanza significativa con los alergenos conocidos (Astwood et al., 1996).

12 18 CUADERNO TÉCNICO Nº5 19 En resumen, basándose en estudios directos y en la ubicuidad y función conocida de las proteínas EPSPS, se ha demostrado que la proteína CP4 EPSPS no supone un riesgo en la cadena alimentaria. Los resultados muestran que no existen indicios de toxicidad en los ratones a los que se les administró proteína CP4 EPSPS por vía oral. Esta ausencia de toxicidad era esperable debido a la rápida degradación de las proteínas CP4 EPSPS y a la pérdida de actividad enzimática en los fluidos gastrointestinales simulados. Además, las proteínas CP4 EPSPS no presentan homologías con ninguna toxina proteica conocida ni con alergenos y se encuentran a concentraciones muy bajas en el maíz Roundup Ready. También cabe añadir que las proteínas CP4 EPSPS pertenecen a una familia de proteínas con un amplio historial de consumo seguro y, concretamente, la proteína CP4 EPSPS expresada en el maíz Roundup Ready evento NK603 también tiene un historial de consumo seguro, debido a la utilización de la soja Roundup Ready, que expresa la misma proteína de tolerancia a Roundup. Asimismo, se ha demostrado que la proteína CP4 EPSPS L214P es funcionalmente equivalente a la CP4 EPSPS, que no posee homologías con otras toxinas o alergenos conocidos y que se degrada rápidamente in vitro. De acuerdo con estos datos, se determinó que la proteína CP4 EPSPS L214P es equivalente, tanto funcional como estructuralmente, a la proteína CP4 EPSPS y por lo tanto es segura para el consumo humano y animal. ANÁLISIS DE COMPOSICIÓN Y VALOR NUTRITIVO DEL MAÍZ NK603 Aunque el maíz es una fuente ideal de energía, la población mundial consume poco maíz en grano o maíz procesado directamente, en comparación con el consumo de ingredientes alimentarios que tienen como base al maíz (Hodge, 1982; y Watson, 1988). El maíz es una excelente materia prima para la fabricación de almidón, no sólo por su precio y su disponibilidad, sino también porque es fácil extraer grandes cantidades con una gran pureza (Yerson y Watson, 1982). Casi el 25% del almidón de maíz se utiliza como tal, más del 75% del almidón se utiliza en la obtención de edulcorantes y productos de fermentación, entre los que se incluyen el jarabe de maíz con alto contenido en fructosa y el etanol (Watson, 1988; National Corn Growers Association, 1995). Además, a partir del germen se elabora comercialmente el aceite de maíz, que supone aproximadamente el 9% de la producción de aceite vegetal (Orthoefer y Sinram, 1987). Cada uno de estos ingredientes es un componente de muchos alimentos de los sectores de panadería, lácteos, bebidas, repostería y productos cárnicos. El consumo animal es, con mucha diferencia, el uso principal del maíz en los Estados Unidos, destinándose más de la mitad (50-60%) de la producción anual a pienso para el ganado vacuno, avícola y porcino (Hodge, 1982; U.S. Feed Grains Council, 1999; Watson, 1988). El ganado consume fácilmente el maíz y, debido a su alto contenido en almidón y bajo contenido en fibra, es una de las fuentes de energía más concentradas, conteniendo más nutrientes digeribles que cualquier otro grano para pienso. Análisis composicional. El análisis composicional es una de las partes más importantes del proceso de evaluación de la seguridad. Para evaluar si la composición del maíz Roundup Ready es sustancialmente equivalente a la del maíz convencional comercializado (exceptuando el carácter introducido), se han analizado y comparado la composición del grano y forraje a partir de muestras de ensayos en diferentes localidades de Estados Unidos y Europa. Se analizó la composición del maíz de grano y forraje producido en Kansas,

13 20 CUADERNO TÉCNICO Nº5 21 Iowa, Illinois, Indiana y Ohio en 1998 y en ensayos de campo en Italia y Francia en 1999, a partir de muestras de grano y forraje, tanto del maíz evento NK603, como del maíz testigo no modificado. En los ensayos de campo de Estados Unidos, las muestras de forraje y los granos de referencia incluyeron 19 variedades convencionales e híbridos comerciales (cinco híbridos por zona con un híbrido plantado en dos zonas). Las plantas de maíz que incluían el evento NK603 se trataron con el herbicida Roundup y se evaluaron cincuenta y un parámetros diferentes relativos a la composición. Estos análisis incluyeron: Composición centesimal: proteína, cenizas, grasa, carbohidratos y humedad tanto en el grano como en el forraje (Tablas 2 y 3); Fibra: fibra detergente ácido (FAD) y fibra detergente neutro (FND) tanto en el grano como en el forraje (Tablas 2 y 3); Minerales: fósforo, calcio, potasio, magnesio, cobre, hierro, manganeso y zinc en el grano (Tablas 2 y 3); Composición en aminoácidos: expresados cada uno según su porcentaje en la proteína total del grano (Tabla 4); Ácidos grasos: porcentaje de cada ácido graso en el grano (Tabla 5); Vitamina E, ácido fítico e inhibidor de la tripsina en el grano (Tabla 6); Metabolitos secundarios: ácido ferúlico, ácido p-cumárico y rafinosa (Tabla 6). Se llevaron a cabo análisis estadísticos de los datos utilizando un modelo de análisis de varianza mixto con una combinación de todas las zonas durante 1998 y una combinación de dos zonas con un diseño de bloques al azar para los estudios de Se evaluaron un total de 51 componentes (7 en el forraje y 44 en el grano) en las campañas 1998 y Los 44 componentes seleccionados del grano, resultaron de la diferencia entre los 59 componentes iniciales analizados menos los 16 componentes que se excluyeron, porque sus niveles estaban por debajo del límite de cuantificación. No se incluyeron en el análisis estadístico los datos de la composición de las líneas de referencia comerciales del estudio de Sin embargo, se determinaron los intervalos de tolerancia poblacionales para cada componente, calculando la media de los valores de referencia y la variación entre los valores, para estimar los límites superiores e inferiores para toda la población. Para cada componente, se calcularon los intervalos de tolerancia que se espera que contengan, con un 95% de confianza, el 99% de los valores expresados en la población de las líneas comerciales. Los resultados relativos a la composición que se obtuvieron de estos nueve ensayos de campo durante los dos años, muestran que el grano y forraje del maíz evento NK603 son comparables en su composición al maíz testigo y al maíz convencional. Con un nivel del 5% de significación, se espera que una de las veinte comparaciones entre el maíz evento NK603 y el maíz testigo sea significativamente diferente, simplemente por azar. Con la utilización de datos de varios años y la incorporación del maíz referencia en los ensayos de campo, se observa que las pocas diferencias estadísticamente significativas encontradas, son seguramente debidas al azar y sin relevancia biológica. Además, se ha comprobado que los valores de la composición del maíz evento NK603 se encuentran dentro del intervalo de confianza del 99% para las diecinueve variedades de maíz comercial no transgénico que se cultivaron en los ensayos de campo de Europa en 1999, dentro de los intervalos citados en la literatura del maíz no transgénico y dentro de los intervalos de los datos históricos. Estas comparaciones son importantes y relevantes, ya que es sabido que la composición de cualquier cultivo, incluido el maíz, varía como resultado de múltiples factores, incluyendo la variedad, las condiciones de crecimiento y los métodos de análisis. En las tablas 2 a 6 se comprueba que todos los valores de los componentes en el maíz evento NK603 se encontraban dentro del intervalo de la variabilidad natural encontrada en el maíz no transgénico.

14 22 CUADERNO TÉCNICO Nº5 23 Tabla 2. Contenido en fibra, minerales y composición centesimal del grano de maíz evento NK a 1999 b Componente c NK603 Testigo d NK603 Testigo d Híbridos Comerciales e Media Media Media Media Intervalo tolerancia f Bibliografía Historial g (Rango) h (Rango) h (Rango) h (Rango) h (Rango) h (Rango) (Rango) h Proteínas , ( ) k ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) l ( ) Grasa total j , 5.75 ( ) k ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) l ( ) Cenizas , 2.22 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) k ( ) FAD i , 4.71 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) k ( ) FND i , ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) k ( ) Carbohidratos , No indicado ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Humedad , 9.53 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) (7-23) k ( ) Calcio , ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) k ( ) Cobre , 3.16 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) (0.9-10) k no disponibles Hierro , ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) (1-100) k no disponibles Magnesio , 0.16 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) k no disponibles Manganeso , ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) (0.7-54) k no disponibles Fósforo , 0.42 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) k ( ) Potasio j , 0.45 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) k no disponibles Zinc , ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) (12-30) k no disponibles a Resultados de 6 localidades sin repeticiones y dos con repeticiones en U.S.; granos de maíz NK603 recolectados de plantas tratadas con el herbicida Roundup. b Resultados procedentes de dos localidades en la U.E. con repeticiones; granos de maíz NK603 recolectados de plantas tratadas con el herbicida Roundup. c Contenido porcentual sobre materia seca, excepto: humedad como porcentaje sobre peso; cobre, hierro, manganeso y zinc como mg/kg materia seca. d Híbrido testigo no-transgénico. e Híbridos comerciales; híbridos locales sembrados en cada localidad de la U.E. f Intervalo de tolerancia es aquel que incluye al 99% de la población de la línea comercial, los valores negativos se ajustan a cero. g Rango de los híbridos testigo sembrados por Monsanto en los ensayos de campo realizados en 1994 y h El rango incluye el valor máximo y mínimo para cada híbrido entre todos los lugares ensayados. i FAD = fibra ácido detergente; FND = fibra neutro detergente. j Diferencias estadísticamente significativas respecto al testigo a un nivel del 5% (p<0.05). k Watson, l Jugenheimer, Tabla 3. Contenido en fibra, minerales y composición centesimal del forraje procedente del maíz evento NK a 1999 b Componente c NK603 Testigo d NK603 Testigo d Híbridos Comerciales e Media Media Media Media Intervalo tolerancia f Historial g (Rango) h (Rango) h (Rango) h (Rango) h (Rango) h (Rango) h ProteíProteínas Cenizas , ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) , ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) FAD i , ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) FND i , ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Grasa total , 4.80 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Carbohidratos , ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Humedad , ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) a Resultados de 6 localidades sin repeticiones y dos con repeticiones en U.S.; forraje de maíz NK603 recolectados de plantas tratadas con el herbicida Roundup. b Resultado de dos localidades en la U.E. con repeticiones; forraje NK603 procedente de plantas tratadas con el herbicida Roundup. c Contenido sobre material seca, excepto humedad. d Híbrido testigo no-transgénico. e Híbridos comerciales, híbridos locales cultivados en cada localidad. f Intervalo de tolerancia es aquel que incluye al 99% de la población de la línea comercial, los valores negativos se ajustan a cero. g Rango de los híbridos testigo sembrados por Monsanto en los ensayos de campo realizados en 1994 y h El rango incluye el valor máximo y mínimo para cada híbrido entre todos los lugares ensayados. i FAD = fibra ácido detergente; FND = fibra neutro detergente.

15 24 CUADERNO TÉCNICO Nº5 25 Tabla 4. Composición en aminoácidos del grano de maíz evento NK a 1999 b Aminoácidos c NK603 Testigo d NK603 Testigo d Híbridos Com. e Media Media Media Media Interv. toleranc. f Bibliografía g Historial h (Rango) i (Rango) i (Rango) i (Rango) i (Rango) i (Rango) (Rango) i Alanina j , 8.35 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Arginina j , 5.03 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Ácido Aspártico , 7.61 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Cisteína/Cistina , 2.43 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Ácido Glutámico j , ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Glicina , 4.15 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Histidina j , 3.36 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Isoleucina , 3.97 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Leucina , ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Lisina j , 3.68 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Metionina j , 2.49 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Fenilalanina , 5.61 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Prolina , ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Serina , 5.19 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Treonina , 3.69 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Triptófano , 0.76 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Tirosina , 4.03 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Valina , 5.38 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) a Resultados de 6 localidades sin repeticiones y dos con repeticiones en U.S.; granos de maíz NK603 recolectados de plantas tratadas con el herbicida Roundup. b Resultados procedentes de dos localidades en la U.E. con repeticiones; granos de maíz NK603 recolectados de plantas tratadas con el herbicida Roundup. c Valores expresados como porcentaje del total de aminoácidos para su comparación estadística. d Híbrido testigo no-transgénico. e Híbridos comerciales; híbridos locales sembrados en cada localidad de la U.E. f Intervalo de tolerancia es aquel que incluye al 99% de la población de la línea comercial, los valores negativos se ajustan a cero. g Watson, Porcentaje sobre proteína total [10.1% proteína total (N x 6.25)]. h Rango de los híbridos testigo sembrados por Monsanto en los ensayos de campo realizados en 1993 y 1995, valores indican el porcentaje de proteína total. i El rango incluye el valor máximo y mínimo para cada híbrido entre todos los lugares ensayados. j Diferencias estadísticamente significativas respecto al testigo a un nivel del 5% (p<0.05). Tabla 5. Composición en acidos grasos del grano de maíz evento NK a 1999 b Acido Graso c NK603 Testigo d NK603 Testigo d Híbridos Comerciales e Media Media Media Media Intervalo tolerancia f Bibliografía g Historial h (Rango) i (Rango) i (Rango) i (Rango) i (Rango) i (Rango) (Rango) i Araquídico j , 0.64 (20:0) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) (0.1-2) ( ) Behénico , 0.24 (22:0) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) (no indicado) ( ) Eicosanoico , 0.42 (20:1) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) (no indicado) ( ) Linoleico , (18:2) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) (35-70) ( ) Linolénico , 1.72 (18:3) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) (0.8-2) ( ) Oleico j , (18:1) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) (20-46) ( ) Palmítico 9.13 j , (16:0) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) (7-19) ( ) Esteárico 1.92 j , 2.27 (18:0) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) (1-3) ( ) a Resultados de 6 localidades sin repeticiones y dos con repeticiones en U.S.; granos de maíz NK603 recolectados de plantas tratadas con el herbicida Roundup. b Resultados procedentes de dos localidades en la U.E. con repeticiones; granos de maíz NK603 recolectados de plantas tratadas con el herbicida Roundup. c Contenido de ácidos grasos expresados como porcentaje del total de ácidos grasos.aunque no se detectaron en la mayoría de las muestras analizadas, en este método también se analizaron los siguientes ácidos grasos: ácido caprílico (8:0), ácido cáprico (10:0), ácido laúrico (12:0), ácido mirístico (14:0), ácido miristoleico (14:1), ácido pentadecanoico (15:0), ácido pentadecenoico (15:1), ácido palmitoleico (16:1), ácido heptadecanoico (17:0), ácido heptadecenoico (17:1), ácido gamma linolénico (18:3), ácido eicosadienoico (20:2), ácido eicosatrienoico (20:3), y ácido araquidónico (20:4). d Híbrido testigo no-transgénico. e Híbridos comerciales; híbridos locales sembrados en cada localidad de la U.E. f Intervalo de tolerancia es aquel que incluye al 99% de la población de la línea comercial, los valores negativos se ajustan a cero. g Watson, Porcentaje sobre grasa total excepto para el ácido palmítico (16:1) que se expresa como % de ácidos grasos de los triglicéridos. h Rango de los híbridos testigo sembrados por Monsanto en los ensayos de campo realizados en 1993 y i El rango incluye el valor máximo y mínimo para cada híbrido entre todos los lugares ensayados. j Diferencias estadísticamente significativas respecto al testigo a un nivel del 5% (p<0.05).

16 26 CUADERNO TÉCNICO Nº5 27 Tabla 6. Acido fítico, inhibidor de tripsina, vitamina E y contenido en metabolitos secundarios del grano de maíz evento NK a 1999 b Componente NK603 Testigo c NK603 Testigo c Híbridos Comerciales d Media Media Media Media Intervalo tolerancia e Bibliografía f Historial g (Rango) h (Rango) h (Rango) h (Rango) h (Rango) h (Rango) (Rango) i Ácido Fítico , 1.18 (% peso seco) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) hasta 0.9% no disponible Inhibidor de tripsina , 3.63 (TIU/mg peso seco) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) no disponible no disponible Vitamina E , (mg/g peso seco) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) h Ácido Ferúlico no disponible no disponible no disponible (% peso seco) ( ) ( ) no disponible ( ) i Ácid p-cumárico no disponible no disponible no disponible (% peso seco) ( ) ( ) no disponible ( ) i Rafinosa no disponible no disponible no disponible (% peso seco) ( ) ( ) no disponible ( ) i a Resultados de 6 localidades sin repeticiones y dos con repeticiones en U.S.; granos de maíz NK603 recolectados de plantas tratadas con el herbicida Roundup. b Resultados procedentes de dos localidades en la U.E. con repeticiones; granos de maíz NK603 recolectados de plantas tratadas con el herbicida Roundup. c Híbrido testigo no-transgénico. d Híbridos comerciales; híbridos locales sembrados en cada localidad de la U.E. e Intervalo de tolerancia es aquel que incluye al 99% de la población de la línea comercial, los valores negativos se ajustan a cero. f Watson, g Rango de los híbridos control sembrados por Monsanto en los ensayos de campo realizados en 1993 y h El rango incluye el valor máximo y mínimo para cada híbrido entre todos los lugares ensayados. i Rango de trece híbridos comerciales cultivados en campos de ensayo de la compañía Monsanto o suministradas por los agricultores en El análisis de datos descrito muestra que el intervalo de tolerancia es una herramienta estadística muy útil que refleja la variabilidad natural de cualquier parámetro analizado, especialmente para los perfiles nutricionales de alimentos y piensos, determinados por su composición bioquímica. Desde la perspectiva de la evaluación de la seguridad, la evaluaciones bioquímicas descritas en este estudio proporcionan una medida robusta para evaluar los posibles efectos inesperados debidos a la inserción del gen cp4 epsps en el genoma del maíz. Estos análisis nutricionales muestran que la mejora genética del maíz convencional con el evento de maíz NK603 no produjo cambios significativos en los 51 componentes biológicos y nutricionales importantes. Los valores de todos los componentes evaluados fueron comparables a los encontrados en el grano y forraje de la línea testigo, a los publicados de los híbridos de maíz no transgénicos comercializados (Jugenheimer, 1976; Watson, 1987), a los intervalos de tolerancia determinados en las variedades comerciales, evaluadas en los ensayos de campo en 1999, o al intervalo de los valores testigo anteriormente encontrados en otros estudios. Basándose en el principio de equivalencia sustancial, acordado por la Organización Mundial de la Salud, la Organización para la Cooperación Económica y el Desarrollo (OCDE) y la Organización de Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO), estos datos sustentan la conclusión de que el maíz evento NK603 es tan seguro y nutritivo como las variedades convencionales existentes en el mercado hoy en día. Evaluación Nutricional y Toxicológica del Grano. Desde una perspectiva nutricional, la medida más sencilla e informativa de los efectos adversos (e.g. pleiotropía) debido a la inserción y/o expresión de genes introducidos, es la evolución del crecimiento de un animal alimentado con una dieta que incluye granos o fracciones de grano. Se llevaron a cabo dos estudios clave sobre alimentación animal, con una dieta que incluía granos enteros o molidos de maíz crudo evento NK603. Estos estudios tuvieron una duración de 42 días en pollos y de 90 días en ratas. Se confirmó la equivalencia nutricional y toxicológica del maíz evento NK603 con el convencional para la alimentación animal. Los pollos son muy sensibles a pequeños cambios de nutrientes en sus dietas, ya que su crecimiento es muy rápido. Los estudios con pollos, llevados a cabo por Monsanto, son capaces de detectar diferencias del 2-4%

17 28 CUADERNO TÉCNICO Nº5 29 en las medias de los parámetros analizados. En un estudio de 42 días, que abarca la vida completa de estos pollos, el peso de éstos se incrementó unas 50 veces, dando lugar a un indicador muy sensible de los cambios nutricionales en la alimentación. Este estudio se llevó a cabo para comparar el valor nutricional del maíz que incluía el evento NK603, el mismo maíz no modificado genéticamente y seis líneas de maíz comercializadas no modificadas, alimentando a cruces de pollos broiler Ross x Ross. El diseño de las dietas se basó en el análisis nutricional individual del grano de cada tipo de maíz, con el fin de dar las dosis necesarias para alcanzar las recomendaciones nutricionales (National Research Council, 1994). Entre los días 1 y 20, se alimentó a los pollos con una dieta inicial que contenía alrededor de un 55% de maíz p/p. Entre los días 20 y 42 se incremento esta dieta final hasta un 60% de contenido en maíz. Estas concentraciones de maíz administradas en la dieta se encuentran dentro del rango que utilizan los criadores de pollo en Estados Unidos. Los resultados de estos estudios fueron publicados por Taylor et al., Los resultados de todos los grupos se compararon utilizando métodos estadísticos convencionales, para detectar las diferencias de los distintos parámetros medidos. Todos los parámetros medidos fueron similares (P<0.05) tanto en el grupo de pollos broiler alimentados con maíz evento NK603, como los alimentados con este mismo maíz no modificado, o con los que lo hicieron con las seis líneas de maíz comercial. En todos los casos el peso en el día 0 y en el día 42, la ingesta total y la eficiencia del alimento fueron similares. Los pollos broiler alimentados con el maíz NK603 tuvieron una eficiencia alimentaria ajustada similar a los del grupo alimentado con el maíz testigo y a uno de las cinco líneas de referencia comercializadas (Tabla 7), mientras que las otras cuatro líneas de referencia del maíz comercializado tuvieron una eficacia ajustada menor (alrededor de un 2.3% más pobre que el evento NK603). No se vio afectado por la dieta ni el peso vivo, ni el peso refrigerado, ni la carne de pechuga, muslos y alitas (P<0.05). Los pesos de las pechugas y de la capa grasa de los pollos alimentados con el maíz evento NK603 fueron significativamente más bajos que los que lo hicieron con maíz de la línea no modificada o con las líneas de referencia. Sin embargo, estos valores seguían encontrándose dentro de la media de los valores obtenidos en otros estudios utilizando cadenas de pollos broiler Ross x Ross, y reflejados en la literatura (Esteve-García y Llaurado, 1997; Grey et al., 1983; y Peak et al., 2000). Tabla 7. Resultados en pollos broilers, composición de la pieza, composición en proteína y grasa de las pechugas y muslos (valores medios de machos y hembras), alimentados con maíz transgénico evento NK603, o con la línea testigo (B73HTXLH82) o con 5 híbridos de referencia. Línea de Maíz NK603 B73HT RX826 LH235 DK493 MON847 RX770 Tratamiento LSD 2 Rango Rango x x (T) 5.0% Historial 3,5 Bibliografía 4 LH82 LH185 SSD 1 Peso vivo (g/ ave) día NS NA NA Peso vivo (kg/gallinero) día NS NA NA Peso vivo (kg/ave) día NS a-f Peso vivo (kg/gallinero) día NS NA Ingesta alimento (kg/ave) NS NA NA Ingesta alimento (kg/gallinero) NS NA Eficiencia del alimento (kg/kg) NS a,b,c,d Eficiencia ajustada (kg/kg) c bc a bc ab ab ab * NA Composición de la pieza Peso vivo (kg) NS NA NA Peso refrigerado (kg) NS NA NA Peso refrigerado (% de peso vivo) NS NA a,c,d,e Peso capa grasa (kg) b a ab a a a a * a-f Peso capa grasa (% de peso vivo) 1.5 c 1.7a b 1.6 bc 1.7 a 1.7 a 1.7 ab 1.7 ab ** a-f Peso carne pechuga (kg) abcd d a ab abc bcd cd * NA a,b,d,e Peso carne pechuga (% p. refrigerado) NS NA a,d,e Peso muslo (kg) NS NA e,f Peso muslo (% de peso refrigerado) NS NA e,f Peso muslo (kg) NS NA f Peso muslo (% de peso refrigerado) NS NA f Peso alas (kg) NS NA f Peso alas (% de peso refrigerado) NS NA 8.40 f Análisis Pechuga Humedad (%) NS NA g Proteina (%, sobre fresco) NS NA g Grasa (%, sobre fresco) NS NA g Análisis Muslo Humedad(%) bc c ab a ab a bc ** NA g Proteína (%, sobre fresco) NS NA g Grasa (%, sobre fresco) NS NA g 1 SSD, diferencias estadísticamente significativas: NS, no significativas; *, P<0.05; **, P<0.01; medias de cada tratamiento individual con la misma letra en la misma fila indican que no existen diferencias significativas. 2 LSD, mínima diferencia significativa entre dos medias (P<0.05). 3 Estudios de Monsanto, días, numerados como XX (Ross x Arbor Acres) y XX (Ross x Ross). 4 a) Smith, et al., 1998 (Ross x Ross); b) Lei y Van Beek, 1997 (Ross x Ross); c) Farran, et al., 2000 (Ross); d) Esteve-Garcia y Llaurado, 1997 (Ross); e) Kidd y Kerr, 1997 (Ross x Ross); f) Peak, et al., 2000 (Ross x Ross, Cobb x Cobb, and Ross x Cobb); y g) Grey, et al., 1983 (Ross). 5 NA, no disponible.

18 30 CUADERNO TÉCNICO Nº5 31 En un estudio que se realizó en ratas, durante 90 días, se comparó el impacto de las dietas que contenían granos de maíz evento NK603 con su testigo no modificado genéticamente y con otras seis líneas de híbridos de maíz comercial con distintos fondos genéticos. Las ratas alimentadas con el maíz NK603, en cantidades acordes a unas especificaciones concretas para dietas certificadas, tuvieron respuestas similares a las ratas alimentadas con el testigo no modificado y a los otros híbridos comercializados. Las dietas con las que se alimentó a las ratas durante las 13 semanas fueron las siguientes: dieta con un contenido del 11 o 33% p/p de maíz NK603 o maíz testigo, o dieta con un 33% p/p de grano de maíz de referencia. Además, la comparación de los parámetros clínicos (hematológicos, bioquímicos, urológicos) y las evaluaciones patológicas, tanto a simple vista como microscópicas, de los animales alimentados con el maíz NK603 respecto a aquellos alimentados con el maíz no modificado o con los híbridos comerciales resultó similar. Los resultados de este estudio confirmaron por tanto la equivalencia nutricional del maíz procedente de los tres grupos definidos. La ausencia de diferencias biológicas relevantes durante todo el crecimiento, la eficacia alimentaria y los parámetros histológicos y clínicos estudiados, tanto en pollos como ratas, comparados con los resultantes cuando se utilizó grano de maíz testigo, no modificado, o de variedades comerciales confirman la equivalencia nutricional y composicional del maíz que contiene el evento NK603. Por otra parte, se ha comprobado la ausencia de efectos pleiotrópicos o no intencionados significativos y la ausencia de toxicidad de las proteínas CP4 EPSPS y CP4 EPSPS L214P. Tanto los estudios con pollos, como los llevados a cabo con ratas, confirman las conclusiones sobre la seguridad del maíz evento NK603 para la salud humana y animal y su equivalencia nutricional con otras variedades de maíz convencionales. EVALUACIÓN MEDIOAMBIENTAL DEL MAÍZ NK603 En las plantas mejoradas mediante biotecnología la evaluación medioambiental es una de las evaluaciones importantes que se realizan antes de su comercialización. Se evaluó si el maíz NK603 había aumentando su capacidad para convertirse en mala hierba y si se habían alterado sus interacciones con otras plagas conocidas y organismos no diana. Además, se evaluaron los posibles efectos negativos sobre la biodiversidad debido a polinizaciones cruzadas con especies silvestres. La información acerca de la biología y las propiedades agronómicas del maíz convencional sirve como referencia para establecer si en la planta modificada se han producido cambios significativos. Los estudios de nutrición y toxicidad, así como la información relativa al fenotipo conferido por la proteína introducida, proporcionan información importante para poder evaluar el potencial efecto medioambiental de la mejora. Maíz El maíz (Zea mays L.) es una de las pocas especies cultivadas que es originaria del hemisferio occidental. El maíz se cultiva en prácticamente todas las zonas del mundo y ocupa la tercera posición en cuanto a producción total, detrás del arroz (Oryza sativa L.) y del trigo (Triticum spp.). El origen del maíz ha sido extensamente estudiado y al parecer su domesticación se produjo en el sur de México hace más de años. Se han establecido diferentes hipótesis en cuanto al origen y genealogía del maíz (Mangelsdorf, 1974). En la actualidad, el maíz está altamente domesticado y no puede reproducirse sin la intervención del hombre, por lo que no se considera mala hierba. Existen evidencias que avalan las diferentes hipótesis pero la mayoría indican que el maíz desciende del teosinte (Galinat, 1988), el cual es una mezcla de 3 especies diferentes de Zea y 2 subespecies de Z. mays (Z. diploperennis, Z. perennis, Z. luxurians, Z. mays ssp. parviglumis, y Z. mays ssp. mexicana). El genoma del teosinte es muy parecido al del maíz, se cruza fácilmente con él, y presenta varios caracteres morfológicos similares a los del maíz.

19 32 CUADERNO TÉCNICO Nº5 33 A diferencia del maíz, el teosinte tiene un aspecto más herbáceo y tiene más hijuelos que las variedades de maíz modernas. Una de las características del teosinte es la caída de los granos al llegar a la madurez y la mayor dispersión de sus semillas, algo que no ocurre en las variedades de maíz modernas (Martinez-Soriano y Leal-Klevezas, 2000). Otra diferencia importante entre el maíz y el teosinte es la relativa a las inflorescencias femeninas o espigas. Las variedades de maíz actuales tienen de 1 a 3 ramas laterales que terminan en una espiga que contiene de 8 a 24 filas de granos con 50 semillas, y la espiga está encerrada en hojas modificadas o espatas. El teosinte también tiene ramas laterales pero terminan en espigas de 2 hileras de más de 12 granos cada una, teniendo cada grano la semilla encerrada en una gluma endurecida. El maíz no es sexualmente compatible con las especies silvestres relacionadas de EE.UU. y Europa ya que el teosinte no está presente en estas zonas geográficas. La distribución natural del teosinte está restringida a las zonas subtropicales con una estación seca y verano lluvioso situadas en la meseta central y en la zona escarpada del oeste de México, y Guatemala (Wilkes, 1972). Por ello, fuera de la meseta central y sur de México, Guatemala y Honduras, no existe posibilidad de cruce con especies silvestres relacionadas. Evaluación del herbicida Roundup La baja peligrosidad de la materia activa del herbicida Roundup para los aplicadores, consumidores o el medio ambiente ha sido reconocida previamente por las autoridades de España y otros países así como por la Organización Mundial de la Salud (Environmental Health Criteria nº 159). Después de una revisión liderada por Alemania, se ha ratificado que esta sustancia cumple los estrictos requisitos de la Directiva Europea 91/414 por lo que se incluye en el Anejo I (DOCE nº L 304/14-16 del 21/11/2001). Esto significa el reconocimiento de que los usos recomendados pueden realizarse sin daño para los aplicadores, consumidores o el medio ambiente. Esta inclusión es relevante para el maíz NK603 porque entre los usos autorizados se ha considerado la aplicación sobre el cultivo, en el caso de variedades de maíz genéticamente modificadas para tolerancia a este herbicida. Evaluación del comportamiento agronómico. El maíz evento NK603 ha sido ensayado en USA desde 1997 y en EU desde Fue comercializado por primera vez en USA y Canadá en la primavera del La aplicación de los herbicidas Roundup tras la aparición de la planta, a las dosis indicadas en las etiquetas permite el control de un amplio rango de malas hierbas, mono y dicotiledóneas, incluyendo amor del hortelano (Setaria spp.), cola de caballo (Echinochloa spp, Panicum spp.), abutilon (Abutilon theophrasti), bledos (Amaranthus spp.), juncia (Cyperus spp.) y corregüela (Convolvulus spp.). El maíz Roundup Ready NK603 es un cultivo seguro y sigue siendo susceptible a diferentes herbicidas alternativos, a las dosis indicadas en las etiquetas para el cultivo de maíz. La evaluación de las características agronómicas del maíz incluye el estudio de la emergencia de las plántulas, polinización, grado de crecimiento de las sedas, longitud de la espiga, altura de la planta, número de mazorcas caídas, periodo verde, humedad y peso del grano en el momento de la recolección y rendimiento. La evaluación estadística de estos datos demostró que el maíz evento NK603 es equivalente a las plantas testigo, no transgénicas, excepto por la longitud de la espiga y por el tiempo de crecimiento del 50% de las sedas. Las plantas de maíz evento NK603 tenían un valor medio para la altura de inserción de la mazorca de 0,99 m en comparación con los 1,02 m en las plantas testigo no transgénicas.además, el maíz evento NK603 tenía un periodo de 61.8 días para la aparición del 50% de las sedas en comparación con los 60.2 días de las plantas testigo no transgénicas. Estas pequeñas diferencias observadas en estos materiales no se consideran significativas ya que se encuentran dentro de rango de variabilidad biológica natural del maíz. Además, no se encontraron diferencias en cuanto a la forma ni rendimiento de la reproducción, diseminación del grano y supervivencia. La única diferencia entre el maíz evento NK603 y las otras variedades de maíz era la resistencia al glifosato. También se realizó un seguimiento para evaluar la susceptibilidad del maíz evento NK603 a enfermedades e insectos, en ensayos de campo realizados en USA durante 4 años (USDA, 2000). No se encontraron diferencias entre el maíz NK603 y las plantas testigo en cuanto a susceptibilidad a enfermedades o infestación por insectos. Desde su

20 34 CUADERNO TÉCNICO Nº5 35 comercialización, el maíz NK603 sigue demostrando no poseer características de mala hierba, ni tampoco puede atribuirse al inserto NK603 un efecto medioambiental no intencionado. Cuando se ha incorporado el evento NK603 a un alto número de híbridos de maíz, la mejora agronómica ha sido la esperada y la tolerancia al glifosato ha sido uniforme y constante en todas las nuevas variedades híbridas desarrolladas. Evaluación del efecto sobre organismos no diana. Los híbridos convencionales de maíz que se cultivan actualmente no son considerados como dañinos para otros organismos. No existen evidencias de que el maíz Roundup Ready sea diferente de otros tipos de maíz en lo que a esta característica se refiere. Las proteínas CP4 EPSPS, presentes en el maíz Roundup Ready en muy baja concentración, han sido bien caracterizadas y se ha demostrado que no son tóxicas en diversos estudios nutricionales y toxicológicos, citados anteriormente. Como se ha mencionado, la enzima EPSPS interviene en la ruta del sikimato para la biosíntesis de aminoácidos aromáticos en plantas y microorganismos (Levin y Sprinson, 1964; Harrison et al., 1996), y por lo tanto, está presente en alimentos obtenidos de las plantas. Las EPSPSs de varias bacterias presentan tolerancia al glifosato (Schulz et al., 1985). CP4 EPSPS por lo tanto es una de las diferentes EPSPSs que se encuentran en la naturaleza. Se considera que la EPSPS se encuentra de forma ubicua en la naturaleza, ya que está presente en todas las plantas y microorganismos. Por lo tanto, todos los organismos que han sido alimentados con plantas y/o microorganismos, han estado alguna vez expuestos a las proteínas EPSPS. Considerando la caracterización de las proteínas introducidas y los análisis de composición mencionados anteriormente, no cabría esperar ninguna interacción del maíz Roundup Ready con organismos no diana, como podría ocurrir con otros híbridos de maíz que son tratados con otros herbicidas. La tolerancia al glifosato pretende proteger al cultivo cuando los herbicidas Roundup son aplicados para controlar malas hierbas. Varias observaciones sobre el campo han confirmado que no existen diferencias entre el maíz testigo y el maíz Roundup Ready en cuanto a fenotipo, susceptibilidad a enfermedades y ataques, ó rendimiento, lo que indica que no se produce alteración en la interacción con organismos no diana, tanto beneficiosos como perjudiciales. En ensayos realizados en España se han medido las poblaciones de artrópodos comparando una variedad de maíz NK603 en siembra directa con su variedad isogénica bajo laboreo convencional. Las poblaciones de artrópodos fueron mayores en la parcela no labrada con rastrojos sobre el suelo, especialmente en los números de himenópteros, dípteros y arañas, mientras que las poblaciones de homópteros fueron menores y no se observaron diferencias en colémbolos (Rodríguez y Campos, 2002). Impacto sobre la biodiversidad A partir de los diferentes ensayos realizados y la experiencia comercial de EE.UU., no existen evidencias de que el maíz Roundup Ready, en comparación con otros tipos de maíz, tenga un impacto negativo sobre la biodiversidad. Se evaluó el posible efecto negativo considerando los efectos intencionados de la modificación genética realizada, además de los posibles efectos negativos resultantes de efectos no buscados. La modificación intencionada del evento NK603 fue la expresión de las proteínas CP4 EPSPS para conferir resistencia al glifosato. Se ha demostrado que las proteínas CP4 EPSPS son seguras tanto para consumo humano como animal. Además, las características agronómicas (discutidas anteriormente) demostraron que el maíz Roundup Ready tiene un comportamiento similar al de otros híbridos de maíz actualmente utilizados, con la excepción de la tolerancia al glifosato. El posible efecto negativo, resultante de efectos no intencionados, producidos por la modificación realizada ha sido establecido por: Observación de la interacción del maíz Roundup Ready y otros organismos en distintos ambientes y condiciones agronómicas; Análisis de la composición como indicación de posible modificación no intencionada en el grano y en la calidad del forraje; Estudios de confirmación alimentando animales con maíz crudo y procesado, no encontrándose efectos negativos en ninguno de ellos. Evaluación de la resistencia al glifosato Hasta el momento se han identificado más de 100 biotipos de malas hierbas resistentes a herbicidas; aproximadamente la mitad de ellos son resistentes a los herbicidas de la familia de la triazina (Holt y LeBaron, 1990;