Recombinación genética

Transcripción

1 Recombinación genética Intercambio de material genético entre cromosomas homólogos, permite que no quede fijado el contenido de alelos de cada cromosoma Variabilidad: Base de la evolución shuffling genetico : la recombinación permite separar mutaciones favorables de no favorables selección natural 1

2 Recombinación homóloga (o generalizada) 2 secuencias de DNA iguales o similares (homólogas) Ruptura de las dos moléculas de DNA Intercambio de fragmentos de DNA en cualquier punto de las moléculas homólogas de DNA. No hay cambio en la organización general del DNA 2

3 Recombinación sitio específica (o especializada) Entre secuencias específicas Requiere proteínas específicas que reconocen secuencias específicas y promueven recombinación Induce cambios en la organización del DNA 3

4 Recombinación Homóloga Ruptura de la doble hélice en 2 moléculas de DNA homólogas y unión cruzada Sitio de intercambio secuencias homólogas Heteroduplex en sitio de intercambio No hay alteración de la secuencia en el sitio de intercambio 4

5 Modelo de Holliday Formación del heteroduplex Migración de ramas (Branch migration) Resolución: clivaje a través del punto de ramificación 5

6 Modelos de inicio de la recombinación: Modelo de Holliday Modelo de Messelson- Radding 6

7 Modelos de inicio de la recombinación: Modelo de DSB 7

8 Conversión Génica No todos los eventos de recombinación llevan a la formación de estructuras de crossover Sin embargo, eventos de non-crossover (patch-like) pueden tener consecuencias genéticas Conversión génica En la conversión génica, un alelo se pierde y es remplazado por el alelo alternativo. 8

9 Funciones de la Recombinación homóloga en E.coli Reparación DSB Bloqueo de replicación Recombinación Conjugación Transducción Transformación 9

10 Generación de DSB en el DNA 10

11 Reparación de rupturas de doble cadena en E.coli 11

12 Recombinación homóloga en E.coli Al menos 25 tipos distintos de proteínas involucradas en recombinación homóloga en E.coli RecA, RecBCD, RecF, RecG, RecJ, RecN, RecO, RecQ, RecR, RuvAB, RuvC, PriA, SSB, DNA polimerasas, DNA topoisomerasas y DNA ligasas. Secuencia en cis Chi (hotspot de recombinación) GCTGGTGG Genoma de E.coli 1009 sitios (1/6kb) 12

13 Sistema RecBCD (E.coli) Esencial para el 99% de eventos de recombinación en DSB en E.coli Iniciación Procesamiento del DSB (RecBCD y RecQ) Formación del filamento infectivo (RecA) Apareamiento de homólogos e intercambio de cadenas Invasión de la doble hélice Extensión del heteroduplex Complejo de proteínas motoras RuvAB Resolución Endonucleasa RuvC (parte del complejo RuvAB) 13

14 Sistema RecBCD de recombinación homóloga (E.coli) 14

15 Annu. Rev. Genet : Gerald R. Smith 15

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17 Extensión del heteroduplex Complejo de proteínas motoras RuvAB 17

18 Distribución de sitios chi en el genoma de E.coli 18

19 Recombinación Homóloga (HR) en Eucariotas Como en procariotas HR es requerida para reparación y restablecimiento de una horquilla de replicación frenada en eucariotas. HR es crítica durante la meiosis para el apareamiento y alineamiento de los cromosomas homólogos. Sin HR y alineamiento correcto de los cromosomas no disyunción Control general de la recombinación: 1 o 2 cross-over / par de homólogos. Probabilidad de ningún cross-over < 0,1%. Frec. de recombinación no constante a lo largo del cromosoma Variabilidad Frec. de recombinación depende del largo de las regiones homólogas > 75pb 19

20 Meiosis- Profase I Leptotene Condensamiento de la cromatina Colocalización y coalineamiento de homólogos DS requeridos para el apareamiento Zigotene Inicio de la formación del complejo sinaptonémico Inicio de la recombinación Filamento infectivo Paquitene Intercambio de cadenas Unión de Holliday Complejo sinaptonémico completo. Nódulos de recombinación Diplotene Recombinación completa Disolución del complejo sinaptonémico Separación cromosomas Quiasmas Diaquinesis Desarrollo de microtúbulos del huso y unión a cinetocoro de homólogos 20

21 Complejo sinaptonémico 21

22 paquitene 22

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24 Recombinación homóloga en Eucariotas durante meiosis Factorias de recombinación : incluyen varias proteínas y se forman durante la meiosis. DSB al menos 10 genes requeridos: Spo11 endonucleasa Complejo MRX: RAD50, XRS2, MRE11 Homólogos de RecA : RAD51 y DMC1 (proteína meiótica) Rad52 interactúa con Rad51 y Dmc1 para antagonizar RPA (ss binding protein) y promover más eficientemente el ensamblado del filamento de Rad51-DNA en HR La proteína Mus81 parecería ser el análogo eucariota de la Resolvasa (RuvC) 24

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26 Iniciación de recombinación homóloga durante meiosis 26

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28 Procesamiento del DSB y formación del filamento infectivo 28

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31 Rad51 o Dmc1 Factores accesorios (Rad54, Rad54B, Rdh54, Hop2-Mnd1) 31

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37 Nature Reviews Molecular Cell Biology 10, (April 2009) 37

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39 RECOMBINACIÓN SITIO ESPECÍFICA Reacción entre dos sitios específicos Largo de sitios blanco 14-50pb Pueden ser secuencias homólogas o no Enzimas involucradas específicas (recombinasas) Integración del Fago lambda (Recombinasa= Int) Fago P1 (Recombinasa Cre / sitios loxp) Resolución de cointegrados (plásmidos multiméricos) Sistema de recombinación sitio específica Xer (Cromosoma Bacteriano). En E.coli: sitio blanco (dif, 28pb) + 2 recombinasas XerC y XerD. 39

40 Integración del genoma del Fago Lambda en el genoma de E.coli durante el ciclo lisogénico. Requiere secuencias específicas en el Fago Lambda y en el genoma bacteriano Requiere proteínas específicas del Fago y de la Bacteria Ruptura e integración sin síntesis de DNA Ruptura sitio específica (endonucleasa específica) e intercambio de cadenas unión de Holliday Migración de rama (región homóloga) y resolución 40

41 Int (fago) IHF (bact) Secuencias específicas attp (Fago ) POP 240pb attb (bacteria) BOB 23pb Proteínas específicas Int (fago) IHF (bacteria) 41

42 Recombinación sitio específica del fago lambda (sitios att) 2 Reacciones posibles: 1) attb x attp attl + attr (mediada por Int + IHF) 2) attl x attr attb + attp (mediada por Int + IHF + Xis) 42

43 attp POP aprox 240pb attb BOB aprox 23pb O = core 15pb attp 43

44 Integrative and excisive recombination of phage λ. Abbani M A et al. PNAS 2007;104: by National Academy of Sciences 44

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47 Sistema de recombinación basado en recombinación sitio específica del fago lambda (sitios att) cos Phage E. coli attp 232 bp x attb 21 bp The Gateway System relies on five sets of specific and non crossreacting att sequences Integration (Int, IHF) Excision (Int, IHF, Xis) The specificity is given by the 7 nucleotides of the Lysogen attl attr 96 bp 157 bp core region 47

48 BP Clonase enzyme mix (Invitrogen), LR Clonase mix (Invitrogen) 48

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51 Building a Gateway Entry Clone gene attb1 gene attb2 + attp1 ccdb Donor Vector attp2 attr1 ccdb attr2 + attl1 Entry Clone KanR attl2 KanR BP Clonase II 90-99% correct clones on Kan plates 51

52 Obtaining a Gateway Expression Clone gene attl1 gene Entry Clone ccdb ccdb attp1 attp2 attl2 attr1 attr2 Destination Donor + Vector + Vector attb1 Expression Clone AmpR attb2 KanR AmpR LR Clonase II KanR 90-99% correct clones on Amp plates 52

53 Cre lox Recombinación sitio específica del bacteriófago P1. Cre: Recombinasa sitio específica, producto del gen cre cataliza la recombinación entre 2 secuencias loxp de 34pb (involucrada en la resolución de dímeros de P1 durante la replicación). 53

54 Sistema Cre/LoxP 54

55 Recombinasa Flp /sitios FRT 55