Í N D I C E. Dr. López-García, JS 1. Dr. Rivas, L 2. Dra. García-Lozano I 3. Doctor en Medicina y Cirugía. Hospital Central de Cruz Roja (Madrid).

Transcripción

1 Í N D I C E 1. Introducción 3 2. Estructura del epitelio corneal y limbal 3 3. Mecanismos de renovación del epitelio corneal 4 4. Mecanismos de reparación de la superficie ocular 6 5. Síndrome de insuficiencia limbal Etiología Patogenia Diagnóstico Clasificación Tratamiento 14 Bibliografía 18 Dr. López-García, JS 1. Dr. Rivas, L 2. Dra. García-Lozano I 3. (1) Doctor en Medicina y Cirugía. Hospital Central de Cruz Roja (Madrid). (2) Doctor en Biología. Hospital Ramón y Cajal. (Madrid). (3) Licenciada en Medicina y Cirugía. Instituto de Ciencias Visuales (INCIVI). (Madrid). Institución responsable: Hospital Central de Cruz Roja. Madrid. Correspondencia: Dr. López García JS. Servicio de Oftalmología Hospital Central de Cruz Roja Avenida Reina Victoria, Madrid Tel.: / Fax: Dirección de docsantilopez@hotmail.com Laboratorios Thea publica íntegramente los manuscritos recibidos de sus legítimos autores, sin introducir modificaciones en los mismos, y por ello no se hace responsable de las opiniones e informaciones contenidas en los artículos. Nº:24 I N N O V A C I Ó N

2 1. INTRODUCCIÓN Podemos definir el síndrome de insuficiencia limbal como la incapacidad de las células madre limbales (CML) para mantener la integridad del epitelio corneal. Puede ser producido por diversas etiologías que, actuando por diferentes mecanismos patogénicos, tienen en común una disfunción de estas células ya sea de forma cuantitativa o cualitativa. Debido a la interdependencia que existe entre los distintos componentes de la superficie ocular, resulta difícil encontrar, en la práctica clínica, casos en los que la insuficiencia limbal se exprese de forma pura, siendo común que ésta se asocie a otras manifestaciones. Por otro lado, es también habitual que estas otras alteraciones puedan repercutir sobre la actividad de las CML alterando su funcionalidad. La interdependencia de las distintas estructuras y su correcta integración son fundamentales para mantener la integridad de la superficie ocular (1). 2. ESTRUCTURA DEL EPITELIO CORNEAL Y LIMBAL El epitelio corneal es estratificado no queratinizado y presenta entre 5 y 7 capas celulares. Podemos distinguir en él tres tipos de células: células basales, alares y superficiales. Las células basales se disponen en una sola capa de células cilíndricas sobre la membrana basal a la que se unen a través de hemidesmosomas. Éstos se fijan a las fibras de anclaje de la membrana basal compuesta por colágeno tipo VII y que, a su vez, penetran en la estructura del estroma donde se unen a placas compuestas por colágeno de tipo IV y VII. Son células mitóticamente activas cuyo núcleo se dispone perpendicular a la superficie y ricas en filamentos de actina que parece desempeñar un papel muy importante en la migración celular (2). Las células alares se disponen en unas tres a cinco capas de células que se van haciendo más planas cuanto más superficial es su localización. Su núcleo se dispone paralelo a la superficie. Las células de la capa más superficial presentan un aspecto plano y hexagonal con numerosas microproyecciones y un glicocáliz que intensifica la adherencia con la película lagrimal. A nivel periférico podemos encontrar, entre las células epiteliales, otras como melanocitos y células dendríticas presentadoras de antígenos (células de Langerhans) (3). Las células epiteliales son ricas en tonofilamentos, responsables del mantenimiento de la forma celular. Por otro lado, estas células están interdigitadas y fuertemente adheridas entre sí, ya sea a través de moléculas adherentes como la cadherina e integrina, o por

3 microestructuras como desmosomas, uniones estrechas (tigh junctions) y uniones comunicantes (gap junctions) que tienen también un papel de comunicación y formación de barreras. Estas uniones proporcionan estabilidad al epitelio, resistencia a las agresiones mecánicas y un efecto barrera (4). Fig. 1. Epitelio limbocorneal. Está formado por unas capas celulares. Se puede apreciar como es un epitelio de transición entre el epitelio conjuntival y el epitelio corneal. Fig. 2. Empalizadas de Vogh en la zona limbal inferior. La membrana basal es producida por las células basales y está constituida por colágeno tipo IV y glicoproteínas como laminina y fibronectina. Su espesor varía con la edad. El limbo esclerocorneal es la zona de transición entre la conjuntiva, la esclera y la córnea. A nivel limbal, el estroma corneal pierde su transparencia y el epitelio presenta el máximo grosor de la superficie ocular con hasta 12 capas celulares (Fig. 1). Este epitelio se proyecta entre las papilas subepiteliales apareciendo como líneas blanquecinas orientadas de forma radial que se denominan empalizadas de Vogt (Fig. 2). 3. MECANISMOS DE RENOVACIÓN DEL EPITELIO CORNEAL El limbo tiene una gran importancia en la regeneración del epitelio de la córnea, ya que a este nivel se encuentran las CML responsables de la renovación del epitelio corneal (5). Estas CML se dividen por mitosis en otras células con gran capacidad mitótica denominadas células amplificadoras transientes las cuales, después de varias divisiones, inician su diferenciación hacia células alares y superficiales, migrando de forma centrípeta y hacia la superficie desde el epitelio limbal, en lo que se ha denominado hipótesis XYZ (6). Según esta teoría, la masa epitelial descamada que se vierte a la lágrima sería compensada por un continuo movimiento centrípeto desde la periferia hasta el centro de la córnea (7). Clásicamente, se han localizado estas CML en las empalizadas de Vogt (8). Cuando una célula madre se divide, una de ellas mantiene su condición de célula madre y la otra, después de algunas mitosis, inicia la diferenciación (9). Esta forma de división permite la renovación celular, así como la autoperpetuación de la célula madre (10). La existencia de estas CML permite mantener la integridad de un epitelio corneal con fenotipo constante, evitando la invasión de células procedentes de la conjuntiva.

4 El epitelio de la córnea normal se regenera de forma continua. Las células más superficiales del epitelio se pierden por apoptosis y se van descamando periódicamente. La vida media de las células epiteliales se estima entre 3 y 7 días. Las células madre, células troncales o células stem han irrumpido en el mundo científico de tal forma que hoy resulta imposible sustraerse al impacto que están causando en la biología y en la biomedicina (11). Cierto número de células embrionarias diseminadas por diferentes órganos y tejidos permanecen después del nacimiento. Estas células son capaces de responder a estímulos regenerativos, iniciando un proceso de auto-renovación que dará lugar a linajes especializados, propios del tejido en el que se encuentran. Éstas son las que han sido llamadas células madre del adulto o somáticas. El camino de diferenciación implica la expresión de determinadas moléculas y su regulación está controlada por varios factores como el factor de transcripción Sp 1 (12). Las células madre, independientemente de su localización, presentan una serie de características como una vida larga, un potencial ilimitado para dividirse, un ciclo lento de división, poca o nula diferenciación y estar ubicadas en sitios protegidos (13). Estas células son influenciadas por distintos factores séricos, como el ácido retinoico, que estimulan su división (14, 15). De la misma forma, proteínas pertenecientes a la familia TGF-beta participan en la regulación celular, la proliferación y la diferenciación del epitelio corneal (16). Al contrario de lo que ocurre con las células madre hematopoyéticas en las que existen marcadores específicos para su identificación, las CML sólo son demostrables por evidencias indirectas (17). Desde hace unos años se han propuesto numerosas moléculas como marcadores de CML, aunque su importancia real en la identificación de estas células sigue siendo controvertido (18). Así, las células basales del limbo presentan una mayor expresión que las células basales de la córnea de marcadores como p63, ABCG2, K19, Vimentina, aenolasa, KGF-R e Integrina a9, casi todos ellos marcadores de células indiferenciadas. Algunos autores consideran que el ABCG2 parece el marcador más idóneo para identificar CML, ya que éste sólo se observa en pequeños grupos de células basales del limbo (18). Por el contrario, en estudios realizados en cultivos celulares, la mayoría de las células epiteliales expresaron el factor de transcripción p63 (19). La falta de un marcador único que identifique estas células ha hecho que se traten de identificar mediante combinaciones de marcadores. Así, Arpitha et al. (20) sugieren que las CML son unas células pequeñas con una gran relación núcleo-citoplasma y que expresan altos niveles de p63. Otros, como Chen Z et al, piensan que las CML serían unas células que expresan p63 en el núcleo, ABCG2 en el citoplasma y a9 integrina en las membranas (21). Pajoohesh-Ganji et al. (22) sugieren que las CML son unas células que presentan un ciclo lento con retraso en la captación de marcadores como el BrdU y que expresan altas concentraciones de integrinas beta 1 y beta 4 y una baja concentración de a9 integrina. En condiciones normales, las células transientes más primitivas pueden mantener y regenerar el epitelio corneal. En estudios con timidina tritiada se ha visto que las célu-

5 las basales corneales pueden ser suficientes, por sí solas, para mantener el recambio del epitelio corneal en condiciones fisiológicas (23). 4. MECANISMOS DE REPARACIÓN DE LA SUPERFICIE OCULAR En la superficie ocular, sobre todo a nivel corneal, encontramos unos complejos sistemas de reparación que son el resultado del importante nivel de organización y diferenciación de estos tejidos. Los mecanismos de reparación se activan de forma inmediata tras la agresión y tienen como misión la reepitelización de la córnea, así como la correcta restauración de su estructura y organización. La fuente celular para la regeneración epitelial variará dependiendo del grado de lesión. Un defecto epitelial importante requiere de una adecuada capacidad regenerativa del limbo, así como una membrana basal íntegra (24, 25). En casos de agresiones graves con destrucción del limbo esclerocorneal y de la población de CML, el epitelio conjuntival es la única fuente de reepitelización de la córnea (26). En estos casos se produce una conjuntivalización del epitelio corneal que clínicamente se caracteriza por un retraso de la reepitelización, presencia de neovascularización superficial, defectos epiteliales recurrentes y persistentes y la aparición de células caliciformes en la citología de impresión corneal (27) (Fig. 3). En aquellos casos en los que la destrucción limbal no es completa, puede observarse el fenómeno de transdiferenciación conjuntival, en el que un epitelio inicialmente conjuntivalizado se transforma, de forma progresiva, en un epitelio con características corneales (28). Este fenómeno de transdiferenciación conjuntival se debe a la acción lenta de las CML supervivientes más que a características propias de las células conjuntivales ya que, en cultivos de células conjuntivales sobre membrana amniótica, se ha demostrado que éstas no tienen capacidad para transformarse en células corneales (29). Esta diferenciación a epitelio de fenotipo corneal se ve dificultada por la deficiencia local de vitamina A y por la neovascularización. Fig. 3. Citología de impresión corneal. Se aprecia una metaplasia escamosa grado 3-4 con presencia de células caliciformes. El daño sobre el epitelio conjuntival se traduce en la formación de cicatrices en la conjuntiva bulbar y tarsal. Esta retracción conjuntival favorece la desaparición de los pliegues conjuntivales (30), así como la destrucción del margen palpebral y queratinización

6 conjuntival. La aparición de complicaciones como triquiasis, entropion o simbléfaron dificultan el posterior manejo clínico de estos pacientes (31). En cuanto a la reparación del estroma limbocorneal, en condiciones normales existe un equilibrio entre la producción de colágeno por los queratocitos y su eliminación por unas enzimas denominadas metaloproteinasas (MMP). La producción de estas enzimas está muy regulada por sus inhibidores (TIMPs), induciéndose su expresión cuando existe inflamación o daño tisular (32). Se conocen tres tipos de metaloproteinasas: la MMP-1 o colagenasa tipo 1, la MMP-3 o estromelisina y la gelatinasa. Todas ellas se secretan como proenzimas y requieren zinc como cofactor (33). La MMP-1 es producida principalmente por los queratocitos y degrada el colágeno tipo I, II y III. En condiciones normales su presencia es indetectable en la córnea, sin embargo se ha demostrado un aumento en la expresión de esta enzima durante los procesos de reparación corneal (34). La MMP-3 presenta una intensa actividad proteolítica frente a la caseína, fibronectina y proteoglicanos. La gelatinasa presenta más selectividad por la gelatina y colágeno tipo IV, V y VII. Existen dos tipos de gelatinasas: La MMP-2 más activa frente al colágeno tipo IV, mientras que la MMP-9 es más activa frente al colágeno tipo V. 5. SÍNDROME DE INSUFICIENCIA LIMBAL Fig. 4. Insuficiencia limbal grave con conjuntivalización del epitelio corneal. La afectación por distintas enfermedades de las CML, o del microambiente que las rodea, reduce o anula la capacidad proliferativa del epitelio corneal. Las CML suponen la única fuente de células epiteliales con fenotipo corneal, tanto para la renovación fisiológica de la córnea como para la reparación de eventuales defectos en su superficie. La incapacidad, en estos casos, para conservar un epitelio corneal estable conduce al crecimiento de células epiteliales de estirpe conjuntival sobre la superficie de la córnea (conjuntivalización), lo que constituye el hallazgo más característico de insuficiencia limbar (Fig. 4). La citología de impresión corneal nos permite diagnosticar esta conjuntivalización, que viene determinada por la presencia de células caliciformes y de células epiteliales que captan marcadores de estirpe conjuntival (CK19 +), con ausencia o disminución de células epiteliales fenotípicamente corneales (CK12+ o CK3+). El proceso de conjuntivalización se asocia a destrucción de la membrana basal con la aparición de vascularización superficial, crecimiento de tejido fibroso, inflamación

7 crónica, hiperemia conjuntival, queratinización y gran inestabilidad e irregularidad de la superficie ocular que, a nivel clínico, se traduce en defectos epiteliales persistentes o recurrentes, con opacidad corneal progresiva que conducen a la pérdida de visión. Los síntomas incluyen lagrimeo, dolor, disminución de visión, fotofobia y blefaroespasmo, siendo frecuentes las sobreinfecciones bacterianas y el riesgo de perforación ocular ETIOLOGÍA La insuficiencia limbal puede estar producida por enfermedades inflamatorias (síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide ocular cicatricial), traumáticas (quemaduras químicas o térmicas), congénitas (aniridia), iatrogénicas (postcirugía) o idiopáticas (35, 36, 37). Se trata de diversas entidades que afectando de forma distinta a la superficie ocular van a tener en común la producción de una disfunción limbal ya sea por afectación directa de las CML o de su microambiente. Podemos dividir las enfermedades que cursan con insuficiencia limbal en dos grupos: Un primer grupo con afectación de las CML por agentes exógenos que incluye quemaduras térmicas y químicas, crioterapia o cirugías con extensa manipulación del limbo, fármacos, enfermedades inflamatorias (síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide ocular cicatricial, síndrome de Lyell, acné rosácea, etc.), lentes de contacto, infecciones repetidas de la superficie ocular, radiación y aplicación de antimetabolitos como mitomicina C o 5-fluoruracilo. Las agresiones externas son la causa más frecuente de insuficiencia limbal (Fig. 5). En un segundo grupo incluiríamos enfermedades con afectación limbal intrínseca de distintos orígenes como la aniridia congénita, eritroqueratodermia congénita, neoplasia endocrina múltiple, queratopatía neurotrófica, idiopática (Fig. 6). Fig. 5. Quemadura por alcali. Fig. 6. Queratopatía asociada a la aniridia congénita.

8 La presencia de células de estirpe conjuntival sobre la superficie corneal se considera la confirmación de una deficiencia de CML. Se ha supuesto que este proceso se debe a la invasión conjuntival de la córnea, sin embargo recientes estudios aportan explicaciones alternativas. La actividad de las CML está controlada tanto por factores intrínsecos como por factores extrínsecos que forman el microambiente o nicho de la célula madre (38, 39). Estas células presentan una importante plasticidad y pluripotencialidad, por lo que su destino puede modificarse dependiendo del microambiente que las rodea. Así, en cultivos de células madre embrionarias podemos modificar la diferenciación celular dependiendo del tipo y la concentración de citoquinas en el medio de cultivo o del tejido en el que se implanta (40). Por otro lado, existen factores derivados de fibroblastos con capacidad para inducir diferenciación en células progenitoras al alterar el microambiente de las células madre (41). Se cree que en estados de deficiencia de CML con inestabilidad de la superficie ocular y continuos esfuerzos reparativos se produce una alteración del nicho de CML que favorece la diferenciación hacia líneas de estirpe conjuntival PATOGENIA La patogenia del síndrome de insuficiencia limbal está muy clara en el caso de los procesos que actúan de forma exógena como traumatismos, quemaduras o procesos inflamatorios o iatrogénicos. Aquí, se produce una destrucción de CML que disminuye la población de éstas y altera su normal funcionamiento. El daño sobre las células madre no se produce sólo por el agente agresor, sino que también los fenómenos inflamatorios y, en ocasiones, la terapia empleada pueden favorecer la destrucción celular. En el caso de quemaduras químicas además del daño directo, creado por los agentes químicos, se produce una isquemia y una intensa reacción inflamatoria que aumenta el daño sobre las CML. En los procesos en los que se produce un daño agudo sobre las CML, la adecuada actuación terapéutica puede reducir considerablemente el daño sobre esta población celular. En estos casos podemos tener inicialmente una importante afectación limbal con conjuntivalización del epitelio corneal por destrucción de CML y disfunción de las supervivientes, pero con el adecuado tratamiento, y el tiempo necesario, se irá produciendo un proceso de transdiferenciación conjuntival por el que el epitelio de la córnea se irá transformando en un epitelio fenotípicamente corneal por la recuperación de estas CML. En este sentido, tenemos que decir que se precisa de un importante daño sobre la población de CML para que la lesión sobre la superficie corneal sea definitiva. En estudios de experimentación llevados a cabo en conejos sometidos a resecciones de limbo se observó que con sólo un tercio de limbo conservado la superficie corneal era capaz de mantenerse estable en condiciones fisiológicas (42). Hasta un 75% de los conejos con ese nivel de deficiencia fueron capaces de resolver, sin secuelas, 2 episodios consecutivos de defecto epitelial central traumático. Algunos autores atribuyen estos hallazgos al papel de las células transientes

9 amplificadas presentes en la periferia corneal, las cuales podrían mantener una renovación corneal normal en presencia de una población reducida de CML. En el caso de procesos inflamatorios como el penfigoide ocular cicatricial, la inflamación crónica de la conjuntiva produce una cicatrización y la aparición de retracciones que origina simbléfaron, entropion, ectropion con lagoftalmos y triquiasis. Esto suele conllevar un parpadeo anormal con gran exposición de la superficie ocular y, como consecuencia, una disminución de las secreciones lagrimales acuosa y mucosa produciéndose un síndrome de ojo seco grave, que puede llegar a la queratinización de los epitelios corneal y conjuntival (43). En el caso de etiologías intrínsecas, como la aniridia congénita, parece que la causa de la disfunción limbal se encuentra más en una alteración en el microambiente que en una disminución de las CML. En modelos experimentales de aniridia realizados en animales no se ha podido demostrar una alteración en el compartimento proliferativo utilizando como marcador el factor de transcripción p63, sugerido como marcador de células madre epiteliales, ni tampoco se obtienen resultados concluyentes con marcadores de proliferación celular como el BrdU (44, 45, 46). El gen PAX6, responsable de la enfermedad, se encuentra contenido en una región del ADN considerada de extraordinaria importancia filogenética y se considera un importante regulador en la morfogénesis ocular que controla los procesos de proliferación, diferenciación y apoptosis celular en el desarrollo normal del ojo DIAGNÓSTICO El diagnóstico de insuficiencia limbal grave es sencillo, sobre todo si existe un antecedente traumático o una enfermedad hereditaria conocida. Sin embargo, nos pueden pasar fácilmente desapercibidos casos leves o moderados de insuficiencia limbal. En estos casos la fluorofotometría o los estudios mediante citología de impresión pueden detectar la deficiencia limbal incluso en estadios subclínicos (47). Fig. 7. Exploración con lámpara de hendidura. Se aprecian los neovasos superficiales así como la presencia de fibrosis subepitelial y erosiones epiteliales. La exploración con lámpara de hendidura nos servirá para poder observar las principales alteraciones derivadas del fallo limbal como: aumento del espesor corneal, neovascularización y fibrosis subepitelial, pérdida de la transparencia corneal, inestabilidad de la película lagrimal, alteraciones epiteliales como erosiones recurrentes o defectos epiteliales persistentes, conjuntivalización, inflamación crónica, hiperemia conjuntival, signos de ojo seco y queratinización (Figs. 7 y 8). 10

10 Fig. 8. Exploración con lámpara de hendidura (tinción con fluoresceína). Se aprecia la inestabilidad de la lágrima y los trastornos en la captación de fluoresceína. La superficie ocular reacciona frente a cambios ambientales o frente a estímulos internos mediante el proceso de metaplasia escamosa. La metaplasia escamosa es un proceso utilizado por lo epitelios húmedos para superar temporalmente las agresiones a que se ven sometidos. En el ojo, este proceso está basado tanto en los cambios morfológicos de las células secretoras (células caliciformes) como en los de las células epiteliales. Se trata de una transición patológica y reversible del epitelio normal estratificado no queratinizado a un epitelio queratinizado. En los casos graves este proceso va acompañado por una queratinización de la superficie ocular con infección y pérdida visual. Los pacientes presentan frecuentes molestias subjetivas debidas a la existencia de una película lagrimal inestable. En la conjuntiva, la metaplasia escamosa está acompañada por una disminución en el número de las células caliciformes (48). Clínicamente el proceso de queratinización es fácilmente reconocido mediante biomicroscopía, pero la metaplasia escamosa, previa a la queratinización, puede pasarnos desapercibida en los estadios iniciales. En estos casos, la citología de impresión aporta una estimación del grado de afectación de la superficie ocular, permitiendo un mejor abordaje terapéutico de la enfermedad (49). La citología de impresión nos permite estudiar las capas celulares más superficiales del epitelio córneal y conjuntival, que son recogidas mediante la aplicación de papeles de filtro. Como herramienta de diagnóstico, la citología suple cada vez más frecuentemente a la biopsia. Se trata de una técnica mínimamente invasiva, de fácil realización y que puede ser repetida a lo largo del tiempo, permitiendo el diagnóstico y seguimiento de una larga lista de alteraciones de la superficie ocular (50). La citología de impresión respeta la morfología de la superficie ocular, manteniendo la disposición bidimensional de las células en el epitelio sin alterar la morfología de éstas. Mediante citología se puede realizar un diagnóstico diferencial entre distintas enfermedades que cursan con alteración de la película lagrimal o del epitelio de la superficie ocular (51). La aplicación más común de la citología de impresión es valorar el grado de metaplasia escamosa conjuntival en pacientes con clínica de ojo seco (52). Este grado de metaplasia nos informa del estado de la superficie ocular y, por tanto, de la severidad de la enfermedad. Existen diversos sistemas de graduación de la metaplasia escamosa (53, 54). Estos sistemas se basan en la disminución de la densidad de células caliciformes, el aumento del tamaño de las células no secretoras, el incremento de la estratificación celular, los cambios metacromáticos en la tinción citoplasmática, la separación celular, 11

11 los cambios morfológicos del núcleo, el incremento de la relación N:C y la aparición de queratinización. La clasificación de la metaplasia escamosa de Murube y Rivas en 2003, al contrario que otros sistemas de graduación, incluye los cambios inducidos a nivel corneal, lo que consideramos de gran importancia, ya que el epitelio corneal posiblemente se trate del componente más importante de la superficie ocular (52). La citología de impresión también nos permite estudiar la superficie ocular después de intervenciones como trasplante de limbo y trasplante de membrana amniótica (55, 56). Asimismo, la citología nos posibilita estudiar el fenotipo epitelial mediante estudios histoquímicos. El epitelio de la córnea y de la conjuntiva tienen distintos linajes celulares. Así lo confirman numerosas evidencias como las características bioquímicas (contenido de glucógeno, inmunoglobulina A, etc.), la presencia de células caliciformes o la expresión de distintas citoqueratinas (57, 58). Se conocen 20 tipos de citokeratinas que se dividen en dos grupos dependiendo de que sean ácidas y pequeñas (CK9-CK20) o básicas o neutras y grandes (CK1-CK8). La mayoría de las células epiteliales pueden expresar cualquier citokeratina, sin embargo algunas de ellas son más específicas y selectivas de un determinado tipo celular. Así, las células del epitelio conjuntival presentan la citoqueratina CK19 a la que se une el anticuerpo monoclonal de ratón A53-B/A2 anti-humano, mientras que las células epiteliales corneales y limbales presentan la citoqueratina CK3 y la citoqueratina CK12 a las que se unen el anticuerpo monoclonal de ratón AE5 y el AM5, que son marcadores específicos del epitelio corneal (59). Las córneas de los pacientes con deficiencia de CML presentan una disminución de las citoqueratinas CK3 y CK12 y un aumento de la citoqueratina CK19 (60). Fig. 9. Biopsia limbocorneal. Podemos apreciar una adecuada regeneración estromal pero una deficiente regeneración epitelial en un paciente con insuficiencia limbal tratado con trasplante de membrana amniótica. La biopsia proporciona la mejor información morfofuncional del estado de la superficie ocular. También es la única manera de observar directamente el estado de la capa mucínica de la película lagrimal, íntimamente relacionada con el glicocáliz, así como la regeneración del estroma tras determinados procesos terapéuticos (Fig. 9). Sin embargo, no se trata de una prueba diagnóstica que utilicemos de rutina al ser una prueba invasiva que sacrifica tejido limbal. La biopsia también nos sirve para el estudio del índice mitótico en el limbo de los pacientes con insuficiencia limbal. Para ello, podemos utilizar estudios con timidita tritiada o un análogo suyo como el anticuerpo monoclonal biotinizado bromodieoxuridina (BrdU) que se incorpora al ADN vivo durante la fase S del ciclo mitótico. 12

12 5.4. CLASIFICACIÓN Debido a la estrecha relación entre las estructuras que forma la superficie ocular, resulta difícil poder clasificar el síndrome de insuficiencia limbal por la heterogeneicidad de sus mecanismos etiopatogénicos y por que, frecuentemente, se asocian otros signos y síntomas debidos a otros procesos no relacionados inicialmente con la deficiencia limbal pero que acaban por influirla. Por otro lado, la clasificación de la deficiencia limbal es importante para evaluar y comparar la situación inicial y el éxito o fracaso de un tratamiento. Revisando la bibliografía, encontramos varios intentos de clasificar la insuficiencia limbal. Así, autores como Holland utilizan una clasificación en la que consideran dos parámetros: por un lado, la cantidad de células madre afectadas y por otro el grado de inflamación. Según la afectación de CML distingue entre un estadio I, si éstas están reducidas en menos de un 50%, y un estadio II, cuando la afectación es superior al 50%. Según el grado de inflamación conjuntival distingue entre una conjuntiva normal no inflamada (grado A), una conjuntiva con una inflamación resuelta (grado B) y una conjuntiva inflamada (grado C). El éxito de los procedimientos quirúrgicos depende del grado de inflamación y del grado de deficiencia de CML. Así, el mejor pronóstico lo tenemos en los estadios 1-A y el peor en los estadios 2-C (tabla 1) (61). Estadio I (<50%) Estadio II (>50%) Grado A normal iatrogénica l. de contacto Aniridia Grado B infl. Resuelta Q. A antigua Q.A antigua grave Grado C inflamada Q.A aguda SSJ, POC leves Q.A aguda SSJ, POC grave (SSJ) Síndrome de Stevens-Johnson. (POC) Pénfigo Ocular Cicatricial. (QA) Quemadura por álcali Mackman et al. clasifican la gravedad de la deficiencia limbal asociada a aniridia en cuatro estadios: en el estadio 0 no se observa afectación ocular; en el estadio 1A existen áreas discontinuas de distrofia superficial constituidas por un pannus que se extiende desde el limbo pero no afecta al centro corneal; en el estadio 1B, el pannus periférico afecta a los 360º sin afectar al centro corneal, y en el estadio 2 la afectación periférica es como en 1B pero con afectación del centro de la córnea y cicatrización estromal (62). Nosotros utilizamos una clasificación de la insuficiencia limbal en la que consideramos tanto síntomas y signos clínicos como alteraciones citológicas observadas mediante citología de impresión. Mediante anamnesis y exploración clínica diferenciamos cuatro grupos dependiendo de que los pacientes no manifiesten trastornos clínicos relacionados con la deficiencia limbal o éstos sean leves, moderados o graves. Se considera que un paciente presenta clínica de insuficiencia limbal leve (estadio 1) cuando el paciente refiere un máximo de dos episodios de úlceras recurrentes o erosiones recidivantes en los últi- 13

13 mos 6 meses y leve fotofobia y epífora. A la exploración con lámpara de hendidura, estos pacientes no presentan alteraciones significativas, salvo que coincidan con algún periodo de actividad. El pannus, cuando existe, es leve y no pasa más de 1 mm de la arcada límbica y muestran leves trastornos en la captación de fluoresceína. Se considera que un paciente presenta clínica de insuficiencia limbal moderada (estadio 2) cuando el número de episodios de erosiones recidivantes o úlceras recurrentes es igual o superior a 3 episodios en los últimos 6 meses y en la exploración con lámpara de hendidura se observa una inestabilidad permanente de la película lagrimal y un pannus vascular, acompañado o no de tejido fibroso subepitelial, que afecta a menos de la mitad periférica de la córnea. La fotofobia, epífora y ojo rojo son la norma. Se considera que un paciente presenta clínica de insuficiencia limbal grave (estadio 3) cuando en la exploración con lámpara de hendidura el paciente presenta una vascularización corneal que afecta al centro de la córnea, así como clínica de erosiones corneales e inestabilidad de la película lagrimal permanentes. La fotofobia, epífora y ojo rojo son la norma, así como la pérdida de visión por afectación del eje visual. En el estadio 0 incluimos a pacientes con procesos etiológicos susceptibles de insuficiencia limbal que no manifiestan clínica relacionada con ella TRATAMIENTO Hasta hace unos años, el manejo de la deficiencia limbal era el tratamiento de soporte con lubricantes tópicos, lentes de contacto terapéuticas o tarsorrafia, y cuando se desarrollaba opacidad corneal grave se recurría a la queratoplastia lamelar o penetrante con muy malos resultados por recurrencia de las alteraciones corneales prequirúrgicas sobre el injerto (63). En tanto que el síndrome de insuficiencia limbal está relacionado con una posible deficiencia de CML o una disfunción de éstas por alteraciones en el microambiente que las rodea, el tratamiento de ésta debe ir encaminado a repoblar el limbo esclerocorneal de CML y/o a restaurar el microambiente, garantizando así su expansión y supervivencia (64). Este nuevo enfoque terapéutico, así como la valoración global de la afectación de la superficie ocular y la estrecha interrelación que existe entre las distintas estructuras que la componen, ha mejorado considerablemente el manejo terapéutico de estos pacientes. En el tratamiento de la insuficiencia limbal se han utilizado distintos recursos como: Lágrimas artificiales. La intensidad de la terapia lagrimal sustitutiva variará según la gravedad del proceso, si bien ésta no tiene ningún efecto sobre la actividad de las CML si suele mejorar sintomáticamente las molestias derivadas de la sequedad ocular que frecuentemente acompaña a estos procesos (62). Suero autólogo. El tratamiento con suero autólogo se ha mostrado como un arma terapéutica de gran interés en el manejo de distintas patologías que afectan a la su- 14

14 perficie ocular (65, 66, 67). El efecto beneficioso del suero autólogo está relacionado con la presencia en éste de numerosos factores activos como factores de crecimiento epitelial, fibronectina, vitamina A, factor transformador de crecimiento de fibroblastos, antiproteasas y anticolagenasas, así como distintos factores neuronales como la sustancia P (68, 69, 70). En este sentido, el suero autólogo ejercería un efecto similar al producido por la membrana amniótica contribuyendo a mejorar el microambiente y facilitando los distintos mecanismos implicados en la renovación y mantenimiento celular de los epitelios de la superficie ocular (71). Trasplante de membrana amniótica. La membrana amniótica (MA) y el corion forman las membranas ovulares. Histológicamente, la MA está constituida por un epitelio formado por una sola capa de células cuboideas, una membrana basal y una matriz estromal compuesta por un estrato compacto, una capa de fibroblastos y una capa esponjosa. La utilidad terapéutica de la MA se deriva de sus propiedades mecánicas y, sobre todo, biológicas. Así, el epitelio produce varios factores de crecimiento (72). La membrana basal es muy similar en composición a la membrana basal de la córnea, actuando como sustrato y favoreciendo la migración y adhesión de las células epiteliales. Además, facilita la proliferación de las células progenitoras del epitelio corneal, promueve la diferenciación epitelial de éstas y previene la apoptosis (73, 74). La matriz estromal tiene propiedades que reducen la formación de tejido de granulación y la cicatrización, favorece la supresión del factor de crecimiento transformante y de la activación de los queratocitos, disminuye la neovascularización y la inflamación y contiene varios inhibidores de proteasas y factores antivirales (75, 76). La MA proporciona una barrera efectiva en los procesos de reparación de la superficie ocular, protegiendo del traumatismo palpebral e incluso de los abundantes mediadores de la inflamación presentes en la película lagrimal. Este efecto barrera contribuye también a la reducción de la inflamación que encontramos tras la implantación de este tejido. Es importante señalar que la inflamación produce retrasos en la epitelización. Las aplicaciones clínicas de la MA en oftalmología son múltiples. El trasplante de membrana amniótica (TMA) ha sido utilizado tras quemaduras de la superficie ocular (77), deficiencia limbal inducida por 5-fluoracilo en cirugías de glaucoma (78), tras cirugías de pterigion recidivado (79), en la reconstrucción conjuntival de pacientes con penfigoide ocular cicatricial y de pacientes con síndrome de Stevens-Johnson (80, 81), y en el tratamiento de la queratopatía asociada a la aniridia (82). La MA se ha utilizado también como sustrato para cultivar células del epitelio corneal y conjuntival (83). El TMA ofrece grandes ventajas clínicas ya que mejora significativamente el medioambiente en la matriz extracelular de las células epiteliales limbares. Esto la hace 15

15 muy útil en el manejo de pacientes con insuficiencia limbal parcial en donde el aporte de los distintos factores va a favorecer el desarrollo y expansión de las CML supervivientes. Sin embargo, el tratamiento mediante TMA en estos pacientes ofrece sólo resultados transitorios como hemos podido demostrar en pacientes con aniridia (82). Trasplante de limbo. El trasplante de limbo está indicado en aquellos casos en los que existe una conjuntivalización del epitelio corneal y no se regenera un epitelio con características fenotípicas corneales (84). El tejido trasplantado se puede obtener del mismo paciente (trasplante autólogo) o de otras personas (trasplante heterólogo o allotrasplante). Estos segundos pueden ser de donantes vivos con mayor o menor compatibilidad HLA, o de cadáver, aprovechando el anillo limbar que se desecha tras la queratoplastia (85). Debido a que este tejido trasplantado está en contacto con tejidos vascularizados, cuando no es posible el trasplante autólogo es aconsejable buscar un familiar directo, con la mayor compatibilidad HLA posible, con el fin de reducir los problemas derivados del rechazo inmunológico y la necesidad de emplear medicación inmunosupresiva (86). La inflamación y la mala vascularización producen daño en el tejido trasplantado, contribuyendo al fracaso de éste. En los casos de afectación unilateral el trasplante autólogo de limbo consigue los objetivos antes descritos sin los riesgos de rechazo inherentes al alotrasplante. Es fundamental, en estos casos, realizar un estudio exhaustivo del ojo donante, incluyendo citología de impresión, que nos permita descartar una insuficiencia limbar preclínica que pueda descompensarse tras la resección del injerto. En los casos de afectación bilateral se realiza un allotrasplante de limbo (ATL), obteniendo el injerto de familiares sanos con alta compatibilidad HLA o de tejido limbar de cadáver. La combinación del ATL y del TMA incrementa el beneficio de cada una de ellas por separado (87). Trasplante de células madre. Las investigaciones más recientes aportan avances para el tratamiento de los casos de insuficiencia limbar con trasplante de CML cultivadas sobre membrana amniótica (88, 89). La principal ventaja de esta técnica es que podemos obtener tejido suficiente para producir en cultivos un epitelio estratificado, bien diferenciado y partiendo de una muestra mínima de tejido donante de apenas 1 mm 2. Hasta el momento se han obtenido resultados muy diversos con esta técnica y algunos autores describen un fracaso total, al cabo de varios meses de ella, mientras que otros obtienen buenos resultado (90). También se han realizado trasplantes de células madre cultivadas procedentes de mucosa oral (91). 16

16 A pesar de los buenos resultados obtenidos, en la práctica existen importantes cuestiones sin resolver en torno a los principios de esta técnica. La incógnita fundamental es la confirmación de la presencia de células madre en los epitelios cultivados, ya que, hasta el momento, no existe un método seguro para identificarlas y distinguirlas de otras células más maduras con menos capacidad regenerativa. Además, se precisan estudios sobre supervivencia, movilidad y adherencia de las células epiteliales una vez trasplantadas en el ojo receptor. El tratamiento de la insuficiencia limbal será por tanto dependiente del grado de afectación del limbo. Así, en casos leves o subclínicos de insuficiencia limbal el tratamiento con lágrimas artificiales será suficiente. En los casos de insuficiencia limbal moderada tendremos que recurrir al tratamiento con suero autólogo o al trasplante de membrana amniótica, mientras que en los casos de insuficiencia limbal grave es obligatorio el aporte de CML por cualquiera de las técnicas antes mencionadas. Pero además, en estos pacientes dada la interrelación que existe entre las distintas estructuras que forman la superficie ocular y considerando que, en muchas ocasiones, la insuficiencia limbal es una consecuencia más de los procesos etiológicos responsables de la afectación de la superficie ocular, hemos de tratar también el resto de secuelas. Así, frecuentemente tendremos que realizar amplias reconstrucciones de la superficie ocular, cirugías sobre párpados, queratoplastias, trabeculectomías, además de tratamiento con corticoides o inmunosupresores para tratar los distintos procesos de base. Todas estas consideraciones hacen que el manejo terapéutico de estos pacientes represente un importante reto para el oftalmólogo, ya que no sólo hemos de tratar las distintas alteraciones sino que hemos de establecer un correcto orden de prioridades en su realización. 17

17 BIBLIOGRAFÍA 1. Tseng SC, Tsubota K. Important concepts for treating ocular surface and tears deisorders. Am J Ophthalmol 1997; 124: Gipson IL, Anderson RA. Actin filaments in normal and migrating corneal epithelial cell. Invest Ophthalmol Vis Sci 1977; 16: Arffa RC. Anatomía. En Robert C. Arffa. Grayson. Enfermedades de la córnea. Madrid. Harcourt Brace España, S.A. 1999; pp Durán de la Colina JA. Anatomofisiología de la córnea. In Juan A. Durán de la Colina. Complicaciones de las lentes de Contacto. LXXIV ponencia oficial de la Sociedad Española de Oftalmología. Madrid. Tecnimedia editorial, S.L. 1998; pp Zieske JD, Bukusoglu G, Yankarchas MA. Characterization of a potential marker of corneal epithelial stem cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 1992; 33: Thoft RA, Friend J. The X, Y, Z hypothesis of corneal epithelial maintenance. Invest Ophthalmol Vis Sci 1983; 24: Sharma A, Coles WH. Kinetics of corneal epithelial maintenance and graft loss: a population balance model. Invest Ophthalmol Vis Sci 1989; 30: Davenger M, Evensen A. Role of the pericorneal papillary estructure in renewal of corneal apithelium. Nature 1971; 229: Beebe Dc, Masters BR. Cell lineage and the differentiation of corneal epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 1996; 37: Kruse FE. Stem cell and corneal epitjelial regeneration. Eye 1994; 8: Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999; 284: Adhikary G, Crish JF, Gopalakrishnan R, Bone F, Eckert RL. Involucrin expression in the corneal epithelium: an essential role for Sp 1 transcription factors. Invest Ophthalmol Vis Sci 2005; 46: Dua HS, Azuara-Blanco A. Limbal stem cells of the corneal epithelium. Surv Ophthalmol 2000; 44: Kruse FE, Tseng SC. Serum differentialy modulates the clonal growth and differentiation of cultured limbal and corneal apithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci 1993; 34: Kruse FE, Tseng SC. Retinoic acid regulated clonal growth and differentiation of cultured limbal and peripheral corneal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci 1994; 35: You L, Kruse FE, Pohl J, Volcker HE. Bone morphogenetic proteins and growth and differentiation factors in the human cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci 1999; 40: Wolosin JM, Schtte M, Zieske JD, Budak MT. Changes in connexin 43 in early ocular surface development. Curr Eye Res 2002; 24: Schlotzer-Schrehardt U, Kruse FE. Identification and characterization of limbal stem cells. Exp Eye Res 2005; 81: Salehi-Had H, Alvarenga LS, Isseroff R, Schwab IR. Factors modulating p63 expression in cultured limbal epithelial cells. Cornea 2005; 24: Arpitha P, Prajna NV, Srinivasan M, Muthukkaruppan V. High expression of p63 combined with a large N/C ratio defines a subset of human limbal epithelial cells: implications on epithelial stem cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 2005; 46: Chen Z, Sun HM, Yuan XY. Identification of human corneal epithelial stem cells. Zhonghua Yan Ke Za Zhi 2005; 41: Pajoohesh-Ganji A, Pal-Ghjosh S, Simmens SJ, Sep MA. Integrins in slow cycling epithelial cells at the limbus in the mouse. Stem Cells Haddad A. Renewal of the rabbit corneal epithelium as investigated by autoradiography after intravitreal injection of 3H-thymidine. Cornea 2000; 19: Lehrer MS, Sun TT, Lavker RM. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. J Cell Sci 1998; 111: Stramer BM, Zieske JD, Jung JC, Austin JS, Fini ME. Molecular mechanisms controlling the fibrotic repair phenotype in cornea: implication for surgical outcomes. Invest Ophthalmol Vis Sci 2003; 44: Huang AJW, Tseng SC. Corneal epithelial wound healing in the abscense of limbal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci 1991; 32: Saika S, Kobata S, Hashizume N, et al. Epithelial basement membrane in alkali-burned corneas in rats. Immunohistochemical study. Cornea 1993; 12:

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