Control biológico de los patógenos Fusarium circinatum y Sphaeropsis sapinea mediante la utilización de especies fúngicas antagonistas

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1 eman ta zabal zazu Universidad del País Vasco Euskal Herriko Unibertsitatea Control biológico de los patógenos Fusarium circinatum y Sphaeropsis sapinea mediante la utilización de especies fúngicas antagonistas 1

2 Equipo participante: Miren K. Duñabeitia Aurrekoetxea 1 Eugenia Iturritxa 2 Carmen Gonzalez Murua 1 Unai Ortega Lasuen 1 Joseba Sanchez Zabala 1 Kepa Txarterina Urkiri 3 Juan Majada Guijo 4 1 Departamento de Biología Vegetal y Ecología. Facultad de Ciencia y Tecnología. UPV/EHU. Apdo Bilbao. 2 NEIKER-Tecnalia. Granja Modelo Arkaute, NI Km 355. Apdo Vitoria. 3 BASALAN, Diputación Foral de Bizkaia. Avda. Madariaga 1-1ª Plta, Dpto Bilbao. 4 SERIDA. Estación Experimental La Mata, Sección Forestal. Apdo Grado, Asturias. Fdo.: M.K. Duñabeitia Aurrekoetxea 2

3 INTRODUCCION Fusarium circinatum y Sphaeropsis sapinea son dos especies patógenas causantes de la enfermedad del chancro resinoso que afecta principalmente a las coníferas del género Pinus, siendo Pinus radiata una de las especies más sensibles. En la lucha por la erradicación o control de dichas especies, la utilización de técnicas de control biológico como alternativa a los productos químicos puede ser una herramienta de gran interés. El biocontrol actualmente ya ocupa un lugar importante dentro de las prácticas de manejo de enfermedades de las plantas causadas por los patógenos fúngicos del suelo, principalmente de los géneros Rhizoctonia, Sclerotium, Pythium, Phytophthora y Fusarium entre otros. En esta línea de investigación el primer paso que hay que dar es el de la selección de potenciales bioantagonistas que puedan ser utilizados como controladores biológicos, para lo cual es necesario realizar ensayos in vitro que orienten respecto a su capacidad antagónica y permitan que posteriormente puedan ser formulados y utilizados en pruebas de campo. Las especies del género Trichoderma poseen buenas posibilidades en este sentido como hiperparásitos competitivos que producen metabolitos antifúngicos y enzimas hidrolíticas a los que se les atribuyen los cambios estructurales a nivel celular, tales como vacuolación, granulación, desintegración del citoplasma y lisis celular. Asimismo, el empleo de especies ectomicorrícicas puede ser también una herramienta importante ya que se han descrito diferentes mecanismos de protección mediante los que estos organismos son capáces de hacer frente a los agentes patógenos, entre los cuales se encuentra el de la antibiosis. Objetivo Estudiar in vitro el posible efecto antagonista que puedan tener diferentes especies fúngicas frente a los patógenos Sphaeropsis sapinea y Fusarium circinatum, con el fin de seleccionar candidatos para su utilización en el control biológico de la enfermedad del chancro resinoso. 3

4 MATERIAL Y METODOS Los agentes patógenos se han aislado de rodales de Pinus radiata del País Vasco y se han identificado, en el caso de la cepa de Sphaeropsis sapinea como M1/100107, morfotipo A, VCG H y, en el caso de la cepa de Fusarium circinatum como M3/070505, tipo de apareamiento MAT1-2, VCG. En el caso de Trichoderma se ha testado una cepa salvaje aislada de una plantación de Pinus radiata e identificada como Trichoderma harzianum T31/ y la cepa comercial distribuida por Agromed bajo la denominación de Tricofag R16 Agromed. Diferentes muestreos por rodales de coníferas de Bizkaia y otras provincias limítrofes permitieron la recolección de carpóforos de macromicetos en buen estado de conservación, que fueron trasladados al laboratorio para intentar aislarlos en cultivo puro. Para el aislamiento en cultivo puro, las especies fúngicas recolectadas en campo se sembraron en placa Petri sobre medio de cultivo MMN sólido (Fig.1). Los aislamientos considerados positivos pasaron a formar parte de la colección de cultivos puros, manteniéndose viables mediante resiembras periódicas a medio fresco. No todas las especies recogidas y sembradas en cultivo puro dieron resultados positivos. Además, algunas de las especies que si se han aislado con éxito, presentan tasas de crecimiento bajas, lo que hace que se necesite un periodo de tiempo mas largo para poder realizar test de antagonismo in vitro. Por todo ello, de entre todas las especies de la colección de cultivos puros, se seleccionaron las 5 siguientes: 4

5 Especie Lactarius quieticolor Rhizopogon luteolus Suillus luteus Scleroderma polyrhizum Xerocomus badius Rodal de Procedencia Pinus radiata, Leioa (Bizkaia) Pinus radiata, Zalla (Bizkaia) Pinus sylvestris, Guardo (Palencia) Pseudotsuga menziesii, Amorebieta (Bizkaia) Pinus radiata, Zalla (Bizkaia) S. luteus L. quieticolor X. badius S. polyrhizum R. luteolus 5

6 Figura 1. Cepas de Rhizopogon luteolus y Suillus luteus aislados en cultivo puro crecidos durante 18 días en medio MMN. La evaluación se ha realizado mediante emparejamientos dobles del tipo cepa ectomicorrícica-patógeno y Trichoderma-patógeno, así como emparejamientos triples cepa ectomicorrícica-trichoderma-patógeno, con el fin de analizar posibles sinergias entre los hongos ectomicorrícicos y las diferentes cepas de Trichodermas hacia los patógenos. Especie micorrícica 18 días en oscuridad 23ºC Especie patógena Trichoderma 3 días en oscuridad 23 ºC Hongo micorrícico-patógeno Hongo micorrícico-trichoderma Trichoderma-Patógeno Hongo micorrícico-patógeno-trichoderma Análisis de Área y Biomasa 6

7 Las tasas de crecimiento de cada una de las especies fúngicas implicadas en los ensayos es muy diferente, siendo las especies ectomicorrícicas las que mas lento crecen. Por ello, en la placa Petri se sembró inicialmente la especie ectomicorrícica, que se dejó crecer durante 18 días en la cámara de incubación a 23 ºC en oscuridad. Transcurrido este tiempo se sembró el hongo patógeno, de forma que ambos micelios quedaban enfrentados y separados entre si unos dos centímetros. En el caso de Trichoderma, debido a que su tasa de crecimiento es muy elevada, la siembra se realizó de forma simultanea, enfrentando los micelios de esta especie con los de Sphaeropsis o Fusarium. Asimismo, cuando se trataba de emparejamientos triples, a los 18 días de iniciar el cultivo con el hongo ectomicorrícico se realizaba también de forma simultanea la siembra de Trichoderma y del patogeno. Una vez enfretados de dos en dos, o de tres entres, se dejaron crecer durante 3 días en la cámara de incubación a 23ºC y en oscuridad. En todos los casos, se dejó una tanda de placas en las que cada una de las especies ensayadas (micorrícicas, de Trichoderma y patógenas) creció sola, considerando este tratamiento como el Control, con el cual comparar todas las combinaciones ensayadas. La evaluación de la respuesta de las diferentes especies se ha realizado en base al crecimiento que presenta cada uno de ellas. Para ello se ha determinado, en primer lugar, y en cada una de las placas, el área ocupada por el micelio. Posteriormente se ha calculado la biomasa desarrollada mediante la extracción de la colonia de la placa y el secado en estufa a 80 ºC durante 48 horas. 7

8 RESULTADOS Y DISCUSION La presencia de Trichoderma o de la especie ectomicorríca produce un descenso significativo del crecimiento de Sphaeropsis sapinea, tanto en área como en biomasa, variando el grado de inhibición en función de la especie testada (Fig. 2). En presencia de L. quieticolor se observa la menor disminución (45%), aumentando a mas de un 60% en presencia de R. luteolus y S. polyrhizum. La presencia de Trichoderma reduce el crecimiento del patógeno entre un 70 y un 80%, siendo un 10% más efectiva la cepa salvaje. S. luteus y X. badius son dos especies a destacar por ser las que mayor efecto inhibitorio han producido en el crecimiento de S. sapinea, con una disminución superior al 80% en área y al 90% en biomasa. 100 Disminucion del crecimiento (%) Area Biomasa 0 Lq Rl Sl Sp Xb TC TN Figura 2. Efecto de la presencia de L. quieticolor (Lq), R. luteolus (Rl), S. luteus (Sl), S. polyrhizum (Sp), X. badius (Xb), Trichoderma cepa salvaje (TN) y cepa comercial (TC) en el área y la biomasa de Sphaeropsis sapinea, expresado como porcentaje de disminución, con respecto al control. 8

9 Sphaeropsis sapinea Control Trichoderma comercial (TC) y salvaje (TN) L. quieticolor R. luteolus S. polyrhizum S. luteus X. badius Figura 3. Crecimiento de la cepa de Sphaeropsis sapinea en medio MMN, sola (Control), en presencia de Trichoderma, tanto comercial como salvaje, y en presencia de las cinco cepas ectomicorrícicas testadas. 9

10 La presencia combinada de Trichoderma y una especie ectomicorrícica produce un significativo descenso del crecimiento del patógeno (Fig. 4), siendo mas patente este incremento del efecto antagónico en el caso de L. quieticolor (con un 40 a 50% y 70 a 80% en area y biomasa, respectivamente) y de R. luteolus (60% y 80%-90% en área y biomasa), especies que son las que menos afectan al patógeno cuando no se testan de forma combinada. Destacan las combinaciones con las especies S. polyrhizum, S. luteus y X. badius, con descensos superiores al 90% tanto en área como en volumen, inhibición que llega a ser casi total en el caso de Suillus y Xerocomus. Micorrícico Micorricico + TC Micorricico + TN Disminucion el área (%) Disminución en biomasa (%) Lq Rl Sl Sp Xb Figura 4. Efecto de la presencia de L. quieticolor (Lq), R. luteolus (Rl), S. luteus (Sl), S. polyrhizum (Sp.) y X. badius (Xb) en el crecimiento de Sphaeropsis sapinea, comparado con el efecto de la presencia combinada de esa especie y la cepa comercial (TC) o salvaje de Trichoderma (TN). 10

11 L. quieticolor R. luteolus S. polyrhizum S. luteus X. badius Figura 5. Efecto de la presencia combinada de Trichoderma y una especie ectomicorrícica en el crecimiento de la cepa de Sphaeropsis sapinea. 11

12 Con respecto a Fusarium circinatum, la presencia de Trichoderma o de la especie ectomicorríca produce un efecto negativo en su crecimiento, si bien se observa una gran variabilidad en el grado de inhibición producido en función de la especie testada (Fig. 6). Trichoderma afecta igual al área y a la biomasa de Fusarium, aunque difieren en su efectividad, observándose un descenso del 50% con la cepa salvaje frente a un 25% con la comercial. Las cepas ectomicorrícicas afectan a la biomasa en mayor medida que al área. L. quieticolor y R. luteolus son las especies que menos afectan al patógeno, poco más de un 10% en área y 40% en biomasa. Con S. polyrhizum la inhibición aumenta a un 40% en área y 65% en biomasa. S. luteus y X. badius muestran los resultados más prometedores, al disminuir en un 70% el área y en casi el 90% la biomasa producida por Fusarium. 100 D ism in ucio n de l cre cim ie n to (% ) Lq Rl Sl Sp Xb TC TN Area Biomasa Figura 6. Efecto de la presencia de L. quieticolor (Lq), R. luteolus (Rl), S. luteus (Sl), S. polyrhizum (Sp), X. badius (Xb), Trichoderma cepa salvaje (TN) y cepa comercial (TC) en el área y la biomasa de Fusarium circinatum, expresado como porcentaje de disminución, con respecto al control. 12

13 Fusarium circinatum Control Trichoderma comercial (TC) y salvaje (TN) L. quieticolor R. luteolus S. polyrhizum S. luteus X. badius Figura 7. Crecimiento de la cepa de Fusarium circinatum en medio MMN, sola (Control), en presencia de Trichoderma, tanto comercial como salvaje, y en presencia de las cinco cepas ectomicorrícicas testadas. 13

14 La combinación de Trichoderma con una especie ectomicorrícica produce un incremento significativo del grado de inhibición del patógeno (Fig. 8), siendo más patente este incremento del efecto antagónico en el caso de L. quieticolor (40-50% y 70-80% en área y biomasa) y de R. luteolus (60% y 80%- 90% en área y biomasa), especies que son las que menos afectan al patógeno cuando no se testan de forma combinada. Micorrícico Micorricico + TC Micorricico + TN Disminución en biomasa (%) Disminución en área (%) Lq Rl Sl Sp Xb Figura 8. Efecto de la presencia de L.quieticolor (Lq), R. luteolus (Rl), S. luteus (Sl), S. polyrhizum (Sp) y X. badius (Xb) en el crecimiento de Fusarium circinatum, comparado con el efecto de la presencia combinada de esa especie y la cepa comercial (TC) ó salvaje de Trichoderma (TN). 14

15 Destacan las combinaciones con las especies S. polyrhizum, S. luteus y X. badius, con descensos superiores al 90% tanto en área como en biomasa, inhibición que llega a ser casi total en el caso de Suillus y Xerocomus. L. quieticolor R. luteolus S. polyrhizum S. luteus X. badius Figura 9. Efecto de la presencia combinada de Trichoderma y una especie ectomicorrícica en el crecimiento de la cepa de Fusarium circinatum. 15

16 La presencia de la cepa ectomicorrícica produce un efecto antagónico en Trichoderma que ralentiza su crecimiento, siendo la cepa comercial más sensible que la salvaje (Fig. 10). La disminución en biomasa (50 a 90%) es significativamente mayor que la observada en el área miceliar ( a 40%). El efecto inhibitorio más claro se produce con S. luteus, S. polyrhizum y X. badius. Aunque el área sólo se ve afectada un 30-40%, la biomasa desciende en un 80-90%. Disminución en área (%) TC TN Disminución en biomasa (%) Lq Rl Sl Sp Xb Figura 10. Efecto de L. quieticolor (Lq), R. luteolus (Rl), S. luteus (Sl), S. polyrhizum (Sp) y X. badius (Xb), en el crecimiento de las cepas salvaje (TN) y comercial (TC) de Trichoderma. 16

17 Las especies fúngicas ectomicorrícicas presentan un crecimiento muy lento respecto a las cepas de Trichoderma y los dos patógenos, capaces de desarrollar un denso micelio que ocupa completamente la superficie de la placa. Algunos autores consideran que la necesidad de dejar crecer las cepas ectomicorrícicas de 14 a 21 días antes de enfrentarlas con las cepas patógenas esta muy relacionada con el efecto antagonista observado, al producirse una disminución de la disponibilidad de nutrientes en el medio de cultivo, que causa una reducción en el crecimiento del patógeno (Martin-Pinto et al., 06). Las especies testadas no parecen confirmar esta hipótesis ya que la tasa de crecimiento y el diámetro alcanzado por las cepas ectomicorrícicas durante 18 días muestra diferencias entre especies que no se correlacionan con las diferencias observadas en el grado de inhibición del desarrollo del patógeno (Fig. 11). Inhibición del crecimiento (%) S. sapinea Xb F. circinatum Xb Sp Rl Lq Sl Sp Sl Rl Lq Diametro (mm) Figura 11. Relación entre el diámetro de la cepa ectomicorrícica en el momento de la siembra del patógeno y el porcentaje de inhibición del crecimiento de S. sapinea y F. circinatum en área (claro) y biomasa (oscuro), transcurridos tres días. 17

18 Los cambios observados en el color de la colonia en el caso de Suillus, Scleroderma y Xerocomus,en presencia del patógeno parecen sugerir que es la producción de compuestos fenólicos la causa, al menos en parte, de la inhibición en algunos casos prácticamente total, del crecimiento tanto de Sphaeropsis sapinea como de Fusarium circinatum. TC S. polyrhizum S. polyrhizum Fusarium S. luteus TC Fusarium Figura 12. Cambios en el color del medio de cultivo, así como en el margen de la colonia de la cepa ectomicorrícica, observados en Scleroderma polyrhizum y Suillus luteus cuando crece en presencia de Trichoderma o del patógeno. 18

19 La capacidad antagonista de Trichoderma es altamente variable. Mihuta-Grimm y Rowe (1986) demostraron que de 255 aislamientos obtenidos de diferentes lugares, sólo el 15% de los mismos fueron efectivos en el control de Rhizoctonia, y llegaron a la conclusión, al igual que Arcia (1995), de que las cepas aisladas del lugar de aplicación son más efectivas que las traídas de otras zonas. Es probable que la capacidad antagonista de Trichoderma dependa de la especificidad de la cepa aislada y que los aislamientos, como sugieren. Acevedo y Arcia (1988) sean más eficientes para el control de un patógeno que para otro. Por ello, es importante medir esa especificidad, y, en caso de tener situaciones de este tipo, sería interesante evaluar la efectividad de mezclas de cepas antagonistas, a fin de controlar la acción de las poblaciones patogénicas. 19

20 CONCLUSIONES Actualmente las medidas utilizadas para el control de las enfermedades del suelo son el uso de productos químicos y prácticas culturales; sin embargo, el control por medio de estas prácticas se ve restringido por razones económicas y ecológicas. Las posibilidades de sustituir o disminuir el uso de productos químicos en el control de enfermedades producidas por hongos del suelo abre una ventana a la investigación de técnicas alternativas como el control biológico. Todas las especies fúngicas testadas in vitro presentan capacidad antagonista para las cepas de Sphaeropsis sapinea y Fusarium circinatum causantes de graves daños en los rodales de Pinus radiata de la CAPV. Las dos cepas de Trichoderma inhiben el crecimiento de Fusarium circinatum y de Sphaeropsis sapinea, mostrándose más efectiva la cepa salvaje que la comercial, lo que indica la idoneidad de localizar y seleccionar cepas adaptadas a las zona de aplicación. Suillus luteus y Xerocomus badius son capaces de inhibir in vitro, de forma casi total el crecimiento tanto de Sphaeropsis sapinea como de Fusarium circinatum, lo que las sitúa como buenos candidatos para el control biológico de la enfermedad del chancro resinoso.

21 BIBLIOGRAFIA Acevedo, R.; Arcia, A Control de Sclerotium cepivorum por Trichoderma en macetas. (Resumen). Fitopatol. Venez. 1(1):34. Arcia, A. M Uso de Antagonistas en el Control de Fitopatógenos del Suelo. En: Curso sobre Control Microbial de Insectos Plagas y Enfermedades en Cultivos. UCLA. Barquisimeto - Venezuela. p. Cabras A., Mannoni M:A:, Serra S., Andolfi A., Fiore M., Evidente A. 06. Occurrence, isolation and biological activity of phytotoxic metabolites produced in Vitro by Sphaeropsis sapinea, pathogenic fungus of Pinus radiata. European Journal of Plant Pathology 115: Duchesne L.C., Peterson R.L., Ellis B Pine root exudates stimulates the synthesis of antifungal compounds by the ectomycorrhizal fungus Paxillus involutus. New Phytol., 108: Martin-Pinto P., Pajares J, Diez J. 06. In Vitro effects of four ectomycorrhizal fungi, Boletus edulis, Rhizopogon roseolus, Laccaria laccata and Lactarius deliciosus damping off in Pinus nigra seedlings. New Forests 32: Mihuta-Grimm, L. and Rowe, C Trichoderma spp. as biocontrol agents of Rhizoctonia damping-off of radish in organic soil and comparison of four delivery systems. Phytopathology 76(3): Mousseaux M.R., Dumroese R.K., James R.L., Wenny D.L., Knudsen G.R Efficacy of Trichoderma harzianum as a biological control of Fussarium oxysporum in container-grown Douglas-fir seedlings. New Forests 15: Scheffknecht S., Mammerler R., Steinkellner S., Vierheilig H. 06. Root exudates of mycorrhizal tomato plants exhibit a different effect on microconidia germination of Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici than root exudates fron non-mycorrhizal tomato plants. 21