LABORATORIO Nº 3 ENZIMOLOGÍA

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1 LABORATORIO Nº 3 ENZIMOLOGÍA I. - INTRODUCCIÓN A) ESPECTROFOTOMETRIA: Utilizando términos quizás excesivamente simplistas puede definirse la espectrofotometría de absorción, como la medida de la atenuación que el material a estudiar (muestra) efectúa sobre una radiación incidente sobre el mismo con un espectro definido. En general, las medidas se realizan dentro del espectro comprendido entre 220 y 800 nm, y este espectro, a su vez, puede dividirse en dos amplias zonas: la zona de la radiación visible, situada por encima de 380 nm, y la zona de la radiación ultravioleta situada por debajo de estos 380 nm. La región del infrarrojo se sitúa por encima de los 800 nm. La energía de una onda electromagnética está dada por la ecuación: E = hν, donde h es la constante de Planck y v es el número de onda (el recíproco de la longitud de onda λ). La energía de la luz UV y visible es capaz de excitar electrones π y electrones no enlazantes desde su estado basal a un nivel energético mayor (estado excitado) y, en consecuencia, se dice que la molécula que contiene estos electrones absorbe luz a la longitud de onda correspondiente. Generalmente, este tipo de electrones se encuentran en moléculas conjugadas (moléculas que poseen dobles enlaces separados por un enlace simple). La conjugación aumenta la longitud de onda de la absorción al disminuir la diferencia energética entre el estado basal y el estado excitado, de modo que un dieno conjugado absorbe luz de alrededor de 215 nm, mientras que un compuesto con un alto número de enlaces conjugados, como el β-caroteno absorbe a 450 nm. La estructura de enlaces conjugados que permite la absorción de luz se denomina cromóforo. Si una luz blanca pasa a través de una solución que contiene compuestos que actúan como cromóforos, ciertas longitudes de onda son absorbidas selectivamente. El color resultante de la solución se debe a la luz transmitida. La absorción de luz por parte de una sustancia es una propiedad característica de ella, que puede ser utilizada para su identificación y cuantificación, ya que un compuesto determinado tiene un espectro de absorción característico, por lo tanto la comparación del espectro de este compuesto puro con los espectros de compuestos conocidos permitirá su identificación. Leyes de la absorción de energía radiante Se refieren a las relaciones existentes entre la cantidad de absorbente y el grado con el que es absorbida la energía radiante. En términos generales, puede decirse que hay dos variables capaces de afectar al grado de absorción: la concentración del absorbente y la longitud del trayecto que el rayo luminoso recorre a través de la solución. La Ley de Lambert - Beer establece que la absorción es proporcional al número de moléculas de la sustancia absorbente presente en la solución por donde pasa el haz electromagnético. La expresión matemática para esta ley es: A = ε l c Donde ε es la absortividad molar (una medida de la radiación absorbida), que es un valor constante para cada sustancia a cada longitud de onda λ. Cuando la concentración, c, es expresada en moles por litro se denomina coeficiente de extinción molar y cuando es expresada en gramos por litro coeficiente de extinción específico. El término l representa el espesor de la capa absorbente y está en unidades de cm.

2 Cuando las medidas se efectúan utilizando siempre la misma cubeta (o bien un grupo de cubetas estandarizadas que posean un paso de luz constante) y los efectos ópticos debidos a la cubeta son reproducibles, el término l de la expresión de la absorbancia se hace constante. Dado que ε, es también constante para un determinado absorbente y una concreta longitud de onda, resulta entonces que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración: A = k c (k = ε l). La absorbancia es adimensional, presenta valores entre 0 y 2 unidades de absorbancia o densidad óptica, dentro de cuyo rango generalmente se cumple la Ley de Lambert - Beer Características de un espectrofotómetro La medida de absorbancia se lleva a cabo con la ayuda de un espectrofotómetro: Estos equipos contienen los siguientes componentes básicos: Posee una fuente de luz capaz de emitir luz a las longitudes de onda que se quiere medir. El selector de longitud de onda permite el paso de la luz a la longitud de onda deseada. Una rendija u orificio define la intensidad de luz incidente sobre la muestra dispuesta en una celda o cubeta que posee un diámetro de 1 cm y no interfiere con el paso de la luz, y finalmente, la luz emitida después de su paso por la celda es cuantificada por un detector. Los espectrofotómetros dan la lectura directa de la absorbancia (A) o bien, el porcentaje de transmitancia (%T). La relación entre ambos es: A = 2 - log % T La ventaja fundamental que ofrece el empleo de la Absorbancia en lugar de la Transmitancia es que la relación existente entre la concentración y la absorbancia es lineal, cosa que no sucede con el %T.

3 % 60 Absorbancia Transmitancia concentración (g/l) concentración (g/l) La absorbancia de una solución es la resultante de la absorbancia del soluto cuya concentración se desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes, reactivos) que absorben también a esa longitud de onda. Estos compuestos se denominan interferencias. Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga todos los componentes del sistema menos aquel que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia de éste debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien, con el blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0, o sea 100% de transmisión. Curvas de calibración Una curva de calibración relaciona las A ó %T con las concentraciones y su empleo es necesario en los trabajos cuantitativos en los que hay que calcular la concentración del absorbente. Siempre que sea posible, es aconsejable la construcción de una curva de calibración que cubra la zona de concentraciones que se van a encontrar en la práctica. La elaboración de la curva debe ser la fase primera al montar y estandarizar cualquier procedimiento fotométrico. Las concentraciones pueden expresarse en cualquier tipo de unidades de medida; sin embargo, la medida más conveniente es emplear para las curvas las mismas unidades en las que se debe expresar el resultado final. Ejemplo: curva de la Hemoglobina.

4 B) ENZIMAS: La mayoría de las reacciones químicas que ocurren en los sistemas vivos, si siguieran sus propios mecanismos, ocurrirían demasiado lentas. Se requiere de catalizadores para que estas reacciones transcurran a velocidades que realmente sean útiles para la célula. En los sistemas biológicos, los catalizadores de dichas reacciones químicas son las enzimas. Qué es catálisis? Qué es lo que hace la catálisis? Para entenderlo, consideremos una reacción química simple: A + B C + D Si la reacción ocurre sin interferencia, eventualmente, parecerá como si se detuviera. Lo que sucede realmente es que tanto la reacción directa como la inversa están ocurriendo a la misma velocidad. Esto es lo que conocemos como equilibrio químico y podemos expresar su constante de equilibrio: Keq = [ C] [ D] [ A] [ B] Esta constante es característica de la reacción. Un catalizador aumenta la velocidad a la que la reacción se acerca al equilibrio, pero no altera la naturaleza del estado de equilibrio. Otra propiedad importante de los catalizadores es que son muy efectivos en cantidades muy pequeñas, con respecto a las cantidades a catalizar. La Cinética Enzimática, es una rama especializada de la cinética química, que está basada en la teoría cinética de la materia. En esta teoría, se ve que una solución está hecha de un grupo de moléculas y que cada una de ellas se mueve a una velocidad particular. En este movimiento, ellas chocan entre sí, cada colisión involucra una cierta cantidad de energía. Si la colisión no involucra suficiente energía, la reacción no ocurre. Si la energía es suficiente, las moléculas se combinan para formar un intermediario activado, estableciendo un estado de transición. La energía mínima que se requiere para la formación de este intermediario es la Energía de Activación. Esto lo podemos representar mediante: A B* C Esta reacción la podemos graficar de la siguiente manera: B* Donde B* es el estado de transición A C En una reacción catalizada por una enzima, esta actúa agregando pasos a la reacción, de manera que la energía de activación requerida sea menor:

5 B* A ES E ACTIVACIÓN Donde ES es la unión de la enzima con el sustrato C Note que en las reacciones catalizadas por enzimas, al reaccionante se le llama sustrato. El cambio de Energía libre ó ΔG, es la diferencia de energía libre que se produce entre el estado inicial (sustrato) y el producto final. Si se observa en los gráficos anteriores, el cambio de energía libre es la distancia entre el estado energético del sustrato y la del producto. Note que, con o sin enzima, los niveles de energía libre inicial y final son los mismos y el ΔG es el mismo, por lo que la termodinámica de la reacción no ha cambiado. La Actividad enzimática de una enzima se determina midiendo la cantidad de producto formado (o de sustrato consumido) por unidad de tiempo. La Comisión de Enzimas de la Unión internacional de Bioquímíca ha definido la unidad de enzima como: la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 μmol (micro mol) de sustrato por minuto bajo condiciones definidas En la figura anterior se puede observar la típica evolución de una curva obtenida en un ensayo enzimático. Inicialmente, la enzima transforma el sustrato en producto siguiendo un comportamiento lineal. A medida que avanza la reacción, se va agotando la cantidad de sustrato y va disminuyendo la cantidad de producto que se genera por unidad de tiempo (disminuye la velocidad de la reacción), lo que se manifiesta en forma de curva asintótica. Dependiendo de las condiciones del ensayo y del tipo de enzima, el período inicial puede durar desde milisegundos hasta horas.

6 La mayoría de los estudios de cinética enzimática se centran en el período inicial, es decir, en la zona lineal de la reacción enzimática. Sin embargo, también es posible medir toda la curva de la reacción y ajustar estos datos a una ecuación no lineal. Esta forma de medir las reacciones enzimáticas es denominada análisis de la curva de progreso. Existen distintos factores que pueden modificar la actividad enzimática, entre otros: a) Concentración de enzima b) Concentración sustrato c) Temperatura d) ph e) Inhibidores Efecto de la Concentración de enzima: Cuando se determina la velocidad inicial de una reacción catalizada por una enzima a distinta concentraciones de ésta, en presencia de concentraciones saturantes de sustrato y manteniendo los otros factores ambientales constantes (temperatura y ph), se establece que la actividad enzimática es directamente proporcional a la concentración de la enzima. Efecto de la Concentración de Sustrato y velocidad de la reacción: La cinética enzimática comienza a inicios del 1900 con la derivación de la Ecuación de Michaelis-Menten, la que describe la relación entre la velocidad de la reacción y la concentración de sustrato: k 1 k 3 E + S ES E + P k 2 Se asume que la constante de velocidad de la reacción inversa para k 3 es insignificante y que lo importante son los valores de velocidad inicial. Cuando estamos en velocidad inicial, la cantidad de P es despreciable y, por lo tanto, la reacción inversa, E + P ES, es también despreciable. Las constantes de velocidad se combinan dando la siguiente constante: k2 + k3 Km = k 1 Donde k 1, k 2 y k 3 son constantes de velocidad La velocidad de la reacción queda definida por la siguiente ecuación: V = [ S] V max [ S] + Km Donde V = velocidad de la reacción Vmax = velocidad máxima [S] = concentración de sustrato Km= constante de Michaelis-Menten

7 Km es un parámetro cinético muy importante al momento de determinar la actividad de una enzima, ya que indica el grado de afinidad de la enzima por un sustrato. El valor de Km es inversamente proporcional a la fuerza de unión entre la enzima y el sustrato. Un valor alto de Km, indica baja afinidad de la enzima por el sustrato y un valor bajo, una alta afinidad. La magnitud de Km es un valor característico para la combinación de cada enzima con su sustrato. Al graficar V / [S] se tendrá: Gráfico de Velocidad de Reacción versus Concentración de sustrato De este gráfico se desprende que la Km corresponde a la concentración de sustrato a la que se obtiene la mitad de la velocidad máxima. Se pueden distinguir dos fases en la reacción. Una primera fase, en que la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la concentración de sustrato, es decir, es de orden uno. Esto ocurre a bajas concentraciones de sustrato, por lo que la enzima no está saturada de sustrato, de manera que si aumentamos la concentración de sustrato, la velocidad aumenta. En la segunda fase, la velocidad de la reacción se vuelve independiente de la concentración de sustrato, es decir, es de orden cero. Esto ocurre cuando la enzima es saturada por el sustrato, de manera que aunque aumentemos la concentración de sustrato, la velocidad se mantiene constante. Al tipo de curva obtenido por este gráfico se le llama hipérbola rectangular. Como no es una representación lineal, es difícil trabajar con ella y obtener algunos datos. Lineaweaver-Burk, proponen un tipo de gráfico que considera los inversos de la velocidad (1/V) y de la concentración de sustrato (1/[S]), obteniéndose el siguiente tipo de gráfico:

8 A este gráfico, también se le conoce como de Dobles Recíprocos. Efecto de la temperatura en la Actividad Enzimática En la mayoría de las reacciones químicas, un aumento de temperatura causa aumento en la velocidad de la reacción, y por ende el número de colisiones efectivas entre las moléculas dado que aumenta la energía cinética de las moléculas participantes de la reacción. Sin embargo, en el caso de las enzimas, hay que considerar su naturaleza proteica, ya que se sabe que un aumento de temperatura produce desnaturalización de las proteínas, lo que se ve traducido en un brusco descenso de la actividad enzimática. Para cada enzima hay una temperatura óptima. Para la mayoría de las enzimas de los mamíferos, es de 37 ºC. Para algunas enzimas microbianas, en particular para las bacterias termófilas, la temperatura óptima puede ser superior a los 65ºC.

9 Efecto del ph en la Actividad Enzimática Al igual que en el caso de la temperatura, las enzimas poseen un ph o un rango de ph óptimo, en el que su actividad es máxima. Valores mayores o menores a este rango de ph provocan disminución de la actividad. Esto se explica por el hecho de que algunos radicales de los aminoácidos cambian su polaridad a distinto ph, cambiando la conformación de la proteína y de esta manera podemos afectar sitios que son críticos para la actividad enzimática. El ph óptimo de la actividad de una enzima, refleja, generalmente, el ambiente celular en el cuál se encuentra la enzima. Por ejemplo, la Pepsina que hidroliza algunos enlaces peptídicos de proteínas durante la digestión estomacal, tiene un ph óptimo cercano a 1,6 (el rango de ph estomacal fluctúa entre 1 y 2). Por otra parte, la Glucosa fosfatasa del hepatocito, tiene un ph óptimo cercano a 7,8 (el ph intracelular del hepatocito es cercano a 7,2). II.- OBJETIVOS - Aprender a usar correctamente el espectrofotómetro - Conocer y aplicar los principios básicos de la espectrofotometría - Construir una curva de calibración - Determinar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática de la Invertasa. III.- PARTE EXPERIMENTAL PRIMERA PARTE: CURVA DE CALIBRACIÓN 1. Material de estudio Entre las enzimas que se han conocido desde muy antiguo, se encuentran aquellas que hidrolizan la sacarosa. En 1860, Berthelot purificó una enzima procedente de la levadura y que hidrolizaba la sacarosa, la llamó Ferment inversif. Más recientemente se le ha llamado: invertasa, sucrasa, sacarasa y O-fructofuranosidasa. El sustrato de esta enzima es la sacarosa y se obtiene como productos, glucosa y fructosa. En esta sesión experimental, se usará el procedimiento de análisis a tiempo fijo, que consiste en detener la reacción usando el reactivo 3,5-DNS (ácido 3,5-dínitrosalicílíco) y medir el poder reductor de los productos.

10 2. Curva de Calibración (ó Curva Estándar) Procedimiento: 1) Desarrolle el siguiente protocolo: Reactivos Glucosa y Fructosa 0,05 M Sacarosa 0,6 M TUBOS Blanco Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Patrón 5-0,2 ml 0,4 ml 0,8 ml 1,2 ml 1,5 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml H 2 O destilada 2,0 ml 1,8 ml 1,6 ml 1,2 ml 0,8 ml 0,5 ml 3,5-DNS 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2) Desarrolle el color calentando los tubos durante 5 minutos en baño termorregulado a 100ºC. 3) Enfríe los tubos. 4) Determine la Absorbancia de cada tubo, leyendo en espectrofotómetro a 540 nm de longitud de onda Para el uso del espectrofotómetro siga las siguientes instrucciones: l. Encendido de lámparas: Lámpara de tungsteno (Zona del visible, 900 a 340 nm), encendido instantáneo Lámpara de Deuterio (Zona del UV, 340 a 200 nm aprox), encienda el equipo 30 min antes de usarlo 2. Oprima la tecla MODE para accionar el modo absorbancia, A 3. Ajuste la longitud de onda utilizando las flechas arriba o abajo. 4. Vierta una pequeña porción del blanco (Tubo de ensayo N 1) en una celda o cubeta 5. Inserte el blanco en el portaceldas y cierre la puerta del compartimiento de muestras 6. Oprima la tecla 100 %T para llevar a cero absorbancia 7. Saque el blanco y devuelva el líquido al tubo de ensayo. 8. Sacuda la cubeta sobre papel absorbente y vierta una pequeña porción del siguiente tubo de ensayo 9. Inserte la muestra a medir en el portaceldas, cierre la puerta del compartimiento. 10. Lea la medición de absorbancia en la pantalla. 11. Repita el procedimiento desde el punto 7 Importante: las cubetas empleadas en el espectrofotómetro (1 cm de espesor) deben estar escrupulosamente limpias y deben cogerse siempre por sus caras esmeriladas u opacas. No es conveniente secarlas con papel corriente por el carácter abrasivo de éste sino con un papel suave.

11 5) Anote las lecturas en la siguiente tabla: CURVA DE CALIBRACIÓN Blanco Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Patrón 5 Producto (μmol) de Glucosa y Fructosa 0, Absorbancia 6) Realice un gráfico (curva de calibración), Absorbancia versus concentración de producto SEGUNDA PARTE: EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA. Procedimiento: 1) Desarrolle el siguiente protocolo: Reactivos Buffer Acetato 0,1 M ph 4,7 Sacarosa 0,6 M Invertasa Temperatura de Incubación (5 minutos) TUBOS 1 1b 2 2b 3 3b 1 ml 2 ml 1 ml 2 ml 1 ml 2 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml - 1 ml - 1 ml - 3ºC Ambiente 99ºC 2) Registre la temperatura ambiente con un termómetro. 3) Adicione 2 ml de 3,5-DNS a cada uno de los tubos. 4) Desarrolle color calentando durante 5 minutos en baño termorregulado a 100ºC. 5) Enfríe los tubos. 6) Seleccione en el espectrofotómetro una longitud de onda de 540 nm. Ajuste a cero el equipo utilizando el tubo blanco ( tubo 1b) 7) Mida la absorbancia del tubo 1 y anote las lecturas en la siguiente tabla. 8) Repita el procedimiento 6) y 7) para las otras temperaturas 9) Anote las lecturas en la siguiente tabla Absorbancia ) Con los datos anteriores, extrapole los valores de Absorbancia de la curva de calibración (práctico N 3 primera parte) para obtener la cantidad de producto y complete la siguiente tabla: Temperatura 3ºC Ambiente 99ºC Producto (µmol) 11) Grafique temperatura versus Producto 12) Determine el efecto de la temperatura sobre la actividad de la Invertasa