FASCIOLA HEPATICA RESISTENTE A TRICLABENDAZOLE Un creciente problema mundial

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1 FASCIOLA HEPATICA RESISTENTE A TRICLABENDAZOLE Un creciente problema mundial Dr. Hugo D. Solana Lab. Biol. Cel. y Mol. FCV-UNCPBA Tandil- ARGENTINA La fasciolosis es una zoonosis emergente producida por Fasciola hepatica, un trematodo que parasita el hígado de animales herbívoros y el hombre. Es una parasitosis intrahepática de distribución cosmopolita que se manifiesta en casi todas las zonas tropicales y subtropicales en donde habitan fundamentalmente ovejas y otros rumiantes (Mas-Coma S., 2004). La enfermedad se expresa en importantes pérdidas de peso, disminución de la producción láctea, reducción de la eficiencia reproductiva y bajas conversiones de la ingesta, sumado al decomiso de hígados y reses de calidad inferior (Olaechea, F., 2007).. Dicha parasitosis ha pasado además a ser un gran problema para la población humana siendo su transmisión a través de la ingesta de vegetales infestados (Mas-Coma S., 2004). En medicina humana y veterinaria ante esta parasitosis se indica como droga de elección al Triclabendazole (TCBZ), un antihelmíntico benzimidazol halogenado cuyo mecanismo de acción al igual que otros benzimidazoles antihelmínticos es a través de la unión a la β tubulina del parásito con la consecuente despolimerización de sus microtúbulos provocándose la pérdida de función de los mismos y la inevitable muerte del helminto (Brennan, G.P, et al 2007). En general, TCBZ es rápidamente metabolizado a su metabolito activo el TCBZ sulfóxido, no solo en el hígado del hospedador definitivo sino también en fracciones subcelulares del trematodo siendo éste metabolito el que genera el efecto antiparasitario para posteriormente ser nuevamente sulfoxidado a la forma inactiva TCBZ sulfona eliminándose mayormente de esta forma. Por ello, su eficacia antiparasitaria dependerá del tiempo que perdura la concentración tóxica del fármaco en el interior del parásito (Mottier L. et al 2004). El desarrollo de estos antihelmínticos benzimidazólicos, de gran eficacia, amplio espectro y poder residual, ha permitido al productor agropecuario disponer de una herramienta de control cada vez más práctica y adaptable a diferentes sistemas de producción. Todas estas características, agregadas a una disminución de toxicidad en los más modernos grupos químicos, crearon un falso "sentido de seguridad" en el productor pecuario, quién sustituyó el diagnóstico y el asesoramiento profesional, por la casi exclusiva utilización de drogas antihelmínticas sin control ni asesoramiento profesional. Como consecuencia del uso inadecuado de este tipo de fármacos, hoy enfrentamos un serio inconveniente como es el desarrollo de resistencia parasitaria. Por más de 15 años el tratamiento farmacológico con TCBZ ha sido el método de control más utilizado ante esta parasitosis; sin embargo, el problema aún persiste y no solo no ha podido ser revertido, muy por el contrario, se vienen observando evidencias de resistencia al TCBZ cada vez con mayor frecuencia. A la fecha, su uso indiscriminado ya ha generado en varias regiones del planeta cepas de Fasciola hepatica resistentes a dicho antihelmíntico haciéndose necesario ampliar los conocimientos referidos a su mecanismo de acción y eficacia farmacológica (Fairweather, I., 2009). En general, la mayoría de los seres vivos incluidos los helmintos evaden el efecto de los diferentes xenobióticos a través de: i) Cambios estructurales y/o funcionales de las células que modifican la captación de la droga al sitio de acción, produciendo modificaciones en su metabolismo (incremento/inactivación y/o eflujo celular) y alterando la capacidad de acumulación intracelular de la droga. ii) Alteración de sistemas enzimáticos necesarios para la detoxificación afectando la acción farmacológica de la droga y iii) Disminución del número o afinidad de los receptores, afectando la unión del

2 fármaco al receptor y, por tanto, su efecto farmacológico (Álvarez, L.I., 2005). La resistencia de F. hepatica al TCBZ es ya un problema mundial. Los primeros hallazgos datan de fines del siglo pasado (Boray and De Bono 1989) y a la fecha ya se han reportado casos en Australia (Overend and Bowen 1995), Irlanda (O Brien 1998), Escocia (Mitchell et al. 1998), Gales (Thomas et al. 2000) Paises Bajos (Moll et al. 2000), España (Alvarez-Sánchez et al. 2006) y más recientemente en Sudamérica en Argentina (Olaechea et al., 2011a,b) y Perú (Ortiz et al 2013). Estudios previos referidos al mecanismo de acción de los benzimidazoles antihelmínticos han demostrado que se unen a la β-tubulina del helminto pero a diferencia de lo que ocurre en el caso de resistencia en nematodos, en el trematodo F. hepatica no se han encontrado mutaciones en la secuencia de β-tubulina que respondan a la expresión de resistencia a TCBZ, por lo cual la resistencia expresada en F. hepatica la obtendría a partir de otros cambios genéticos y/o metabólicos (Brennan, G.P, et al 2007). Los helmintos poseen mecanismos de detoxificación ante diferentes xenobióticos en los cuales se incluyen antiparasitarios tales como el TCBZ. Dichos mecanismos se basan fundamentalmente en procesos oxidativos generados principalmente por enzimas de Fase I tales como Flavin monooxigenasa (FMO) y Citocromo P 450 (Solana, H., et al, 2009b) aunque inicialmente no debería descartarse la participación de otras enzimas de Fase I y Fase II y/o proteínas de membrana tales como la Glicoproteína P (Gp P) que actuando como bomba de eflujo expulsa endo y xenobióticos al medio extracelular. La sobreexpresión de algunos de estos sistemas puede ser uno de los principales mecanismos que F. hepatica dispondría para su expresión de resistencia al antihelmíntico. Sumado al hecho que en Fasciola hepatica el fenómeno de resistencia es más simple de generarse y menos de medirse por la existencia de más de una especie hospedadora. Recientes estudios desarrollados en nuestros laboratorios demuestran que en Fasciola hepatica la resistencia a TCBZ es al menos debida a una respuesta multienzimática con sobreexpresión de varias enzimas detoxificativas tales como Flavin monooxigenasa (FMO) (enzima de Fase I) (Álvarez, L.I., 2005). y Glutatión S- Transferasa (GST) y Glutatión Peroxidasa (GP), (enzimas de Fase II) (Scarcella S,. et al, 2012, Fernández.V., el al 2012). Además, mientras que en los estudios inmunohistoquímicos no se detectaron diferencias en la distribución de FMO en ambas cepas (sensible y resistente a TCBZ), en los estudios genéticos se detectaron diferencias significativas en la expresión de ARNm que codifica para dicha enzima en ambas cepas. En el caso de la cepa resistente, la expresión del ARNm que codifica para FMO es 1.5 veces mayor que en la cepa sensible a TCBZ. Se confirma así que la vía FMO no solo estaría involucrada en los mecanismos de detoxificación general, sino que además participaría activamente en el desarrollo del fenómeno de resistencia al antihelmíntico fasciolicida TCBZ por parte del trematodo (Lamenza, P. 2013). Con respecto al probable involucramiento de enzimas detoxificativas de Fase II hemos evaluado, en cepas sensibles y resistentes a TCBZ, la participación de la GST, una enzima que cataliza el ataque nucleofílico a una amplia gama de compuestos (Solana, H., et al 2009a). Hemos detectado que la cepa resistente en forma similar a FMO expresa una significativamente mayor actividad metabólica que se correlaciona con la mayor expresión del ARNm correspondiente (Scarcella, S et al 2012). Dentro de los estudios referidos al involucramiento de moléculas de la Fase III de detoxificación en el presente estamos analizando a la Gp P. Dicha molécula es una proteína de membrana con función de bomba extrusora. Su especificidad de sustrato es muy amplia por lo cual la resistencia a TCBZ podría ser modulada por dicha bomba. En nematodos resistentes se han detectado alteraciones en los niveles de expresión de los alelos para Gp P. Se postuló así la posibilidad de que probables

3 cambios genéticos en la expresión de Gp P podrían estar relacionados con la resistencia a TCBZ en Fasciola hepatica (Solana H. et al 2011) por lo cual en nuestros laboratorios se está caracterizando el gen y comparando la expresión del ARNm de Gp P en cepas sensibles y resistentes a TCBZ. Se realizó un análisis de tblastx en base a secuencias ortólogas a la secuencia de nucleótidos de la proteína Pg P. Se comparó con secuencias de Schistosoma mansoni mostrando una homología del 97% en el caso de la cepa sensible y un 99% en el caso de la cepa resistente. En ambos casos la homología se da con una secuencia de Pg P del tipo 1, 2 y 3 (Scarcella, S., et al 2012, Lamenza, P., et al 2013 ). Recientemente el grupo del Dr. I. Faitweather en Irlanda ha demostrado que en F. hepatica resistente a TCBZ existe una mutación puntual en uno de sus aminoácidos aunque esto no necesariamente estaría involucrado en el desarrollo del fenómeno de resistencia. Todos los resultados obtenidos hasta el presente aportan al entendimiento de los mecanismos generadores de resistencia y al conocimiento de la actividad, metabolismo y disposición de estas drogas en el parasito en estudio. Los resultados alcanzados hasta el presente constituyen un aporte a la interpretación de la actividad fasciolicida de TCBZ siendo además parte de un estudio general que se desarrolla en nuestros laboratorios referido al mecanismo de acción de los antihelmínticos benzimidazólicos. Al presente y a pesar de los resultados obtenidos aún continuamos con el problema sin resolver completamente. Los estudios realizados en nuestros laboratorios hasta la fecha no solo han generado instrumentos y aportes importantes para contribuir a la ampliación de conocimientos referidos al mecanismo de acción de los antihelmínticos benzimidazólicos sino que también han aportado al conocimiento funcional del fenómeno de resistencia a TCBZ en F. hepatica. CONCLUSIONES GENERALES Al existir drogas de gran eficacia y ser tan complicados los métodos de control no medicamentosos, se abusa de las drogas y, el resultado es la resistencia antihelmíntica. Los genes de resistencia son parte del DNA cromosómico, inicialmente raros en las poblaciones parasitarias, pero cuando una droga establece un mecanismo de selección, los genes de resistencia pueden incrementar su proporción poblacional. Algunas drogas pueden mantener su eficacia aún siendo muy utilizadas, pero en otros casos, como sucede con la resistencia a TCBZ por parte de F. hepatica la resistencia parasitaria hace perder eficacia a la droga siendo ya una manifestación mundial que genera enormes pérdidas económicas. Los estudios desarrollados en nuestros laboratorios demuestran que en Fasciola hepatica la resistencia a TCBZ es al menos debida a una respuesta multienzimática con sobreexpresión de varias enzimas detoxificativas tales como Flavin monooxigenasa (FMO) (enzima de Fase I) y Glutatión S-Transferasa (GST) y Glutatión Peroxidasa (GP) (enzimas de Fase II) aunque no debería descartarse la sobreexpresión de otras enzimas detoxificativas. La resistencia antihelmíntica en general puede ser monitorizada con dos metas: A) Detectar resistencia luego de que emergió, identificar drogas efectivas y descartar inefectivas. B) Detectar resistencia cuando su incidencia es baja, de esta manera se puede cambiar de grupo químico a efectos de preservar la eficacia (es la estrategia más correcta). El grupo químico inicial podrá ser usado nuevamente luego de un tiempo. Obviamente, una herramienta esencial de este sistema es el diagnóstico, que debe ser a través de pruebas muy sensitivas, capaces de identificar resistencias con una incidencia menor del 1 % de la población. Para que la resistencia sea efectivamente seleccionada se necesita que, por un lado la droga seleccione resistentes y por otro, que los resistentes tengan capacidad para reproducirse y encontrar un hospedador.

4 El difícil equilibrio del manejo de la resistencia consiste en controlar la parasitosis manteniendo la susceptibilidad del parásito. Es indudable que el problema se podrá manejar siempre y cuando se establezca un control parasitario integrado, lo que implica la combinación de técnicas de control no químicas con técnicas químicas REFERENCIAS Alvarez, L.I., Solana, H.D., Mottier, M.L., Virkel, G., Fairweather, I. & Lanusse, C.E. (2005) Altered drug influx/efflux and enhanced metabolic activity in triclabendazole-resistant liver flukes. Parasitology.131: Alvarez-Sánchez MA, Mainar-Jaime RC, Pérez-García J and Rojo-Vázquez FA, Resistance of Fasciola hepatica to triclabendazole and albendazole in sheep in Spain. Vet Rec 159, Boray JC and De Bono D, (1989). Drug resistance in Fasciola hepatica. In Adv Vet Sci Eds P. M. Outteridge, R. D. Richards. Australia, Artarmon Brennan, G.P., Fairweather, I., Trudgett, A., Hoey, E., McCoy, McConville, M., Meaney, M., Robinson, M., McFerran, N., Ryan, L., Lanusse, C., Mottier, L., Alvarez, L., Solana, H., Virkel, G., Brophy, P.M., Understanding triclabendazole resistance. Exp. Mol. Pathol. 82, Fairweather, I., (2009). Triclabendazole progress report, : an advancement of learning? J. Helminthol. 83, Fernández.V.; Cadenazzi.G., Solana. M., Ortiz Obritas. P.; y Solana.H. (2012). Actividad metabólica diferencial de Glutatión Peroxidasa y Glutatión S-Transferasa en Fasciola hepatica sensible y resistente a triclabendazole (Rev Arg Parasitol) Volumen 1. Nro. 1 Pag 192. Lamenza, P., Ortiz Oblitas, P., Ceriani, C., Solana, H. (2013). Identification and characterization of Phase I detoxification enzymes in isolates of Fasciola hepatica susceptible and resistant to triclabendazole. 24th International Conference of the World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (WAAVP) Perth, Western Australia, August Lamenza, P., Scarcella, S., Tort, J., Larroza, M., Olaechea, F., Solana, H. (2011). Caracterización y expresión del gen para Glicoproteina P de Fasciola hepatica sensibles y resistentes a triclabendazole. XX Congreso Latinoamericano de Parasitología y XV Congreso Colombiano de Parasitología y Medicina Tropical. 21 al 25 de Septiembre de Univ. Nac. de los Andes. Bogotá. Colombia. Mas-Coma S, (2004). Human Fascioliasis. In Waterborne Zoonoses: Identification, Causes, and Control (eds. Cotruvo, J.A., Dufour, A., Rees, G., Bartram, J., Carr, R., Cliver, D.O., Craun, R., Fayer, R. & Gannon, V.P.J.), World Health Organisation/IWA Publishing, London Moll L, Gaasenbeek CP, Vellema P and Borgsteede FH, Resistance of Fasciola hepatica against triclabendazole in cattle and sheep in The Netherlands. Vet Parasitol 91, doi: /s (00)

5 Mottier L, Virkel G, Solana H, Alvarez L, Salles J, Lanusse C. (2004). Triclabendazole biotransformation and comparative diffusion of the parent drug and its oxidized metabolites into Fasciola hepatica. Xenobiotica 34(11 12): O Brien DJ, Fasciolosis: a threat to livestock. Irish Vet J 51, Overend DJ and Bowen FL, Resistance of Fasciola hepatica to triclabendazole. Austral Vet J 72, doi: /j tb03546.x Olaechea, F. (2007). Fasciola hepática. Enfermedades parasitarias de los ovinos y otros rumiantes menores en el cono sur de América. Ed. Suárez, V; Olaechea,F.; Romero,J.; Rossanigo,C. Ediciones INTA.. Pág Olaechea, F., Larroza, M., Solana, H., Scarcella, S., Carnevale, S. (2011a). An experimental study in sheep, to confirm triclabendazole resistance of Fasciola hepatica in Patagonia, Argentina. PROCEEDINGS 23rd WAAVP. Olaechea, F., Lovera, V., Larroza, M., Raffo, F., Cabrera, R., (2011b). Resistance of Fasciola hepatica against Triclabendazole in cattle in Patagonia (Argentina). Vet. Parasitol. 178 (3/4), Ortiz, P., Scarcella, S., Cerna, C., Rosales, C., Cabrera, M., Guzmán, M., Lamenza, P., Solana, H. (2013) Resistance of Fasciola hepatica against Triclabendazole in cattle in Cajamarca (Peru): A clinical trial and an in vivo efficacy test in sheep. Vet. Parasitol. Scarcella, S., Lamenza, P., Guzmán, M., Larrosa, M., Olaechea, F., Tort J., Fernández V., Solana, H. (2011). Assessment of the expression of Glycoprotein P gen in a novel Fasciola hepatica isolated triclabendazole resistant-strain in Argentina. XXIII WAAVP. Congreso Internacional de la Asociación Mundial para el Avance de la Parasitología Veterinaria de Agosto de Buenos Aires Scarcella S, Lamenza P, Virkel G, Solana H. (2012). Expression differential of microsomal and cytosolic glutathione-s-transferases in Fasciola hepatica resistant at triclabendazole. Molecular and Biochemical Parasitology;181:37 9. Solana, H., Scarcella, S., Alzola, R., & Lanusse, C. (2009a). P-glycoprotein immunolocalization and glutathion-s-transferase activity in Fasciola hepatica recovered from triclabendazole treated sheep. J. Vet. Pharmacol. Therap. 32 (Suppl. 1), Solana, H., Scarcella, S., Virkel, G., Ceriani, C., Rodríguez, J. & Lanusse, C. (2009b) Albendazole enantiomeric metabolism and binding to cytosolic proteins in the liver fluke Fasciola hepatica. Vet Res Commun 33(2): Solana, H., Scarcella, S., Lamenza, P., Tort, J., Cerna, C., Cabrera, M., Rosales, C., Ortiz, P. (2011). Expresión diferencial de Glicoproteína P en Fasciola hepatica proveniente de bovinos, ovinos y cerdos de Cajamarca, Perú. Sus implicancias en el desarrollo de resistencia antihelmíntica.xx Congreso Latinoamericano de Parasitología y XV Congreso Colombiano de Parasitología y Medicina Tropical. 21 al 25 de Septiembre de Univ. Nac. de los Andes. Bogotá. Colombia